摘要
缺血性中风是全球大多数中风病例的主要原因，会引发主要由小胶质细胞介导的深刻神经炎症反应。过度活化的促炎性小胶质细胞加剧神经元损伤，凸显了针对小胶质细胞调节的治疗策略需求。异氟醚（2,6-二异丙基苯酚）作为一种广泛使用的静脉麻醉剂，因其强效的抗炎特性而成为一种有前景的神经保护剂。本综述全面探讨了异氟醚通过多种细胞机制减轻缺血性中风中小胶质细胞活化和炎症的方式。通过阐明这些分子途径，强调了异氟醚在减轻缺血性脑损伤和指导未来临床干预中的治疗潜力。
关键词：中风；炎症；小胶质细胞；异氟醚
1. 引言
缺血性中风是最常见的中风类型，约占所有中风病例的87%。2021年，全球约有6990万例缺血性中风病例，自1990年以来增加了101.8%。2021年因缺血性中风导致的总死亡人数约为359万。已经探索了多种方法来促进受损神经网络的修复并防止因缺血性中风导致的残疾。缺血性中风是由于供应氧气和营养物质到大脑的血管阻塞引起，导致功能立即丧失。周围的组织形成一个半暗带，这是一个缺乏氧气和葡萄糖的区域。虽然恢复血流是首要治疗方法，但它可能对脑组织造成二次损伤，即脑缺血再灌注（I/R）损伤。
半暗带中的细胞产生多种损伤相关分子模式（DAMPs），这些分子被小胶质细胞上的模式识别受体（PRRs）识别，导致大量释放促炎性细胞因子，从而产生细胞毒性。缺血性中风后，小胶质细胞极化为促炎性（M1）或抗炎性（M2）状态可以决定中风的预后。在缺血性中风中，M1小胶质细胞的过度活化是受影响脑区产生高炎症环境的主要因素，导致神经元损伤和神经退行性变。因此，在缺血性中风期间调节小胶质细胞活化对于缓解炎症很重要。
异氟醚（2,6-二异丙基苯酚）是一种在临床实践中广泛使用的静脉麻醉剂，被认为具有通过调节小胶质细胞活化而在缺血性中风中的潜在抗炎特性。异氟醚对小胶质细胞活化的主要作用被认为是通过不同的作用机制抑制促炎性细胞因子的释放。本综述旨在描述异氟醚在缺血性中风中发挥神经保护作用的最重要细胞机制。这些分子机制共同如图1所示，提供了异氟醚如何调节小胶质细胞活化和神经炎症的视觉总结。
图1. 异氟醚在缺血性中风背景下减轻小胶质细胞活化和神经炎症的细胞机制综合图解。异氟醚通过多个分子靶点和信号通路发挥神经保护作用，包括调控PI3K/Akt级联反应、抑制NOX、下调TLR4和Cx43以及激活JAK1/STAT3通路。它还调节miRNA介导的信号传导，特别是miR-155/SOCS1和miR-221/222–IRF2轴。其他机制包括抑制NF-κB/HIF-1α通路、减少EV释放、通过降低ROS减轻氧化应激以及维持细胞内Ca2+稳态。使用BioRender.com创建（URL访问日期为2025年4月25日）。
2. 异氟醚的作用机制
2.1 目标受体及异氟醚神经药理学效应的机制
异氟醚的麻醉效果主要通过激活GABAA受体——哺乳动物大脑中的主要抑制性受体——来实现，该受体由五个亚基组成，形成一个由配体γ-氨基丁酸（GABA）控制的中央氯离子选择性通道。异氟醚诱导的GABAA受体激活导致氯离子流入电流增加，有助于抑制谷氨酸释放。此外，已发现异氟醚可以通过阻断电压门控钠通道来抑制谷氨酸释放。
异氟醚相关的主要抗炎机制是通过直接激活GABAA受体和抑制N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体来减弱过量谷氨酸释放的神经毒性作用。NMDA受体在快速兴奋性突触传递和各种促炎性细胞因子的产生中起关键作用。据报道，异氟醚可以抑制NMDA受体，导致细胞内Ca2+积累的减弱，最终减少小胶质细胞产生促炎性细胞因子。
异氟醚还通过其脂溶性启动其抗炎作用。异氟醚作为脂质配方整合到细胞膜中，改变膜结构和功能，以及离子通道流动、第二信使生成和细胞因子及类花生酸的产生。
2.2 PI3K/Akt通路激活与抑制
2.2.1 PI3K/Akt通路激活
研究表明，异氟醚可通过PI3K/Akt通路激活在大鼠脑缺血再灌注（I/R）损伤模型和氧糖剥夺（OGD）激活的原代小胶质细胞中诱导自噬。通常，PI3K/Akt通路在正常生理条件和各种病理障碍下对细胞有许多重要的生物功能。PI3K/Akt通路的一个重要结果是细胞中自噬的激活，这对于回收受损细胞器至关重要，并在减轻中风引起的神经损伤中起到关键作用。在之前的一项研究中，探讨了异氟醚对大鼠脑缺血再灌注（I/R）损伤模型和从小鼠大脑皮层分离的氧糖剥夺（OGD）刺激的原代小胶质细胞自噬的影响，特别关注PI3K/Akt信号通路。为了评估异氟醚增强的自噬，使用免疫荧光技术测量了自噬体形成的标记物LC3在大鼠脑组织和原代小胶质细胞中的表达。结果显示，异氟醚处理显著增加了LC3的表达。为了进一步证实异氟醚对自噬诱导的增强效果，他们使用Western blot分析研究了自噬标记物LC3II/I、Beclin-1和Atg-7的蛋白水平；结果表明，在用异氟醚处理的I/R组中，这些蛋白水平显著高于未处理的I/R组。他们还通过Western blot测量了体外OGD激活的原代小胶质细胞的蛋白水平，并证明了在用异氟醚处理的原代小胶质细胞中，LC3II/I、Beclin-1和Atg-7蛋白水平显著高于未用异氟醚处理的原代小胶质细胞。这项研究还揭示了在I/R损伤的大鼠脑组织和OGD刺激的原代小胶质细胞中，PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白的磷酸化水平显著增加，表明异氟醚通过激活PI3K/Akt通路发挥作用。有趣的是，在I/R损伤的大鼠和OGD处理的原代小胶质细胞中，异氟醚导致肿瘤抑制基因PTEN的下调，该基因抑制PI3K/Akt通路的激活。因此，PI3K/Akt通路的激活和PTEN基因的下调对异氟醚的保护作用至关重要。在I/R损伤大鼠和OGD刺激的原代小胶质细胞中，使用LY294002抑制PI3K/Akt通路显著减少了自噬相关标记物，包括LC3II/I比值、Beclin-1和Atg-7。这表明异氟醚通过PI3K/Akt通路上调自噬。
另一项研究显示，延迟给予异氟醚对LPS激活的BV2小胶质细胞在不同时间间隔内通过PI3k/Akt通路产生的细胞因子具有抗炎作用。这项研究证实，通过PI3k/Akt通路的激活是减少炎症介质（如一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）和肿瘤坏死因子（TNF））产生的关键。根据这项研究，用50 μM异氟醚处理的BV2细胞在30分钟后PKB磷酸化增加了2.1倍，1小时孵育后增加到2.3倍。然而，当BV2细胞培养物用wortmannin（一种PI3k/Akt通路抑制剂）处理时，异氟醚对PKB磷酸化的影响显著减少，同时导致促炎介质NO、ROS和TNF的显著增加。
2.2.2 PI3K/Akt通路抑制
尽管PI3K/Akt通路的激活在增加神经疾病中的自噬方面发挥了作用，但其他研究认为PI3K/Akt通路和自噬的过度激活也可能导致炎症和细胞死亡。因此，研究和理解PI3K/Akt通路的下调仍然是神经系统疾病中的另一个重要方面。在暴露于LPS并用异氟醚处理的小胶质细胞中，已显示miR-106b/Pi3k/Akt轴是抑制小胶质细胞活化的重要途径，从而减少促炎性细胞因子的产生。在这个通路中，异氟醚通过下调PI3k/Akt通路上调miR-106的表达，从而促进抗炎作用。在同一研究中，为了进一步确认异氟醚通过miR-106的抗炎作用，进行了使用miR-106抑制剂的功能缺失（LOF）方法。结果表明，抑制miR-106表达完全消除了异氟醚的抗炎作用，导致TIR结构域包含的衔接分子1（Ticam1）、髓样分化初级反应88（Myd88）、干扰素调控因子3（Irf3）和核因子κB（NF-κB）转录本的表达水平显著增加。这些转录本作为关键的炎症指标，用于评估异氟醚如何通过miR-106抑制小胶质细胞中的炎症信号级联反应——特别是TLR-NF-κB轴。这表明异氟醚能有效抑制通过NF-κB通路调控的炎症介质的产生。为了研究miR-106介导的PI3k/Akt下游通路的作用，进行了一项实验，使用PI3k/Akt通路特异性激动剂740Y-P和拮抗剂Wortmannin进行Western blot分析。结果显示，当细胞用740Y-P处理时，p-Akt水平显著上调，而用Wortmannin处理时则显著下调。在740Y-P上调p-Akt后，miR-106b介导的TNF和Nos2抑制显著减少，表明PI3k/Akt信号是miR-106b/PI3k/Akt轴的关键部分。
2.3 抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶
抑制过度活化的小胶质细胞中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）可改善炎症。NOX是一个由多个亚基组成的膜结合蛋白复合物，所有亚基在吞噬细胞中都发挥重要作用。在诸如小胶质细胞等吞噬细胞中，NOX参与细胞外和细胞内活性氧（ROS）的产生。NOX复合物由胞浆（p47phox、p67phox、p40phox和Rac2）和膜结合（gp91Phox和P22 Phox）亚基组成。当被特定激酶磷酸化时，胞浆亚基形成复合物，转移到膜上与膜亚基对接，从而产生超氧阴离子，这是ROS的前体。由NOX产生的ROS调节细胞内信号传导，也负责细胞损伤，如病理条件下神经元损伤。脑损伤（例如中风）后，小胶质细胞开始不受控制地大量产生ROS和促炎性细胞因子，导致神经炎症。在缺血性中风期间，NOX可能会过度激活，导致ROS的过量产生，如超氧阴离子（O2−）和过氧化氢（H2O2）。这会导致神经细胞蛋白质、脂质和核酸的损伤，最终导致它们的死亡。在另一项研究中，为了检测异氟醚通过NOX抑制的抗炎作用，Luo等人测量了LPS刺激的BV2小胶质细胞在有无异氟醚预处理情况下的NOX酶活性。结果表明，异氟醚预处理显著降低了NOX活性。这种酶活性的降低是由于gp91Phox和P22 Phox亚基表达的抑制，正如Western blot所示。因此，胞浆和膜亚基之间的组装减少导致小胶质细胞中促炎因子的产生受到抑制。在平行实验中，作者发现异氟醚对gp91Phox和P22 Phox表达的下调具有剂量依赖性。此外，为了评估gp91Phox和p22Phox亚基的个体作用，作者使用siRNA介导的相应信使RNA沉默BV2小胶质细胞，发现沉默p22phox降低了异氟醚的抗炎效果，使其在降低一氧化氮和TNF产生方面的效果减弱，而沉默gp91phox并没有显著改变异氟醚的抗炎效果。总之，这些结果说明了异氟醚通过抑制NOX失活小胶质细胞的抗炎效果。
2.4 阻断和下调Toll样受体4表达
Toll样受体4（TLR4）是一种模式识别受体（PRR），在与PAMPs或DAMPs结合后，通过激活各种类型的信号级联反应产生促炎性和抗炎性细胞因子，从而引发免疫反应。中风后，受损细胞产生的DAMPs可以被小胶质细胞上的TLR4识别，导致促炎性细胞因子的产生。不受控制的炎症细胞因子释放会加重缺血性脑损伤。在识别PAMPs或DAMPs后，TLR4利用其Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域招募关键适配蛋白——包括MyD88、MyD88-adapter-like蛋白（MAL，也称为Toll/白细胞介素-1受体结构域包含的适配蛋白，TIRAP）、TIR结构域包含的适配诱导干扰素-β（TRIF，也称为TIR结构域包含的适配分子-1，TICAM-1）和TRIF相关适配分子（TRAM，也称为TIR结构域包含的适配分子-2，TICAM-2）——从而诱导转录因子NF-κB、AP-1和IRFs的下游激活，促进各种促炎性细胞因子的产生，最终导致炎症。根据一些研究，异氟醚已被证明通过下调TLR4在调节炎症中起关键作用。在一个MCAO模型中，异氟醚减少了小胶质细胞中的TLR4表达，导致促炎性细胞因子IL-6、IL-β和TNF的mRNA表达显著下降。因此，下调小胶质细胞中的TLR4，抑制促炎性细胞因子的产生，并减少梗死体积，共同显著减轻缺血性中风中的脑损伤。这种显著的促炎性细胞因子产生减少在TLR4敲除小鼠中未观察到，表明异氟醚通过下调TLR4在小胶质细胞中具有抗炎效果。
在一项研究中，Qin等人调查了异氟醚通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路对OGD/OGD/R BV2小胶质细胞的保护作用。一旦小胶质细胞的TLR4与DAMPs结合，它可以依次招募MyD88、白细胞介素-1（IL-1）受体相关激酶、TNF受体相关因子6（TRAF6）和转化生长因子-β激活激酶1（TAK1），导致IKK复合物的激活。当IKK复合物被激活时，它会在丝氨酸残基32和36处磷酸化IkappaB-α，触发其降解。然后，NF-κB被释放，转运到细胞核中，并最终诱导κB依赖基因的转录，如IL-1、IL-6和TNF-α。根据Qin等人获得的Western blot分析结果，暴露于OGD/R时，BV2细胞中TLR4和MyD88蛋白水平增加。然而，用异氟醚预处理的BV2细胞中，TLR4和MyD88蛋白水平显著下降。此外，为了进一步研究TLR4介导的信号传导的下游通路，用Western blot分析测量了有无异氟醚处理的IkappaB-α磷酸化和IkappaB-α水平。结果表明，异氟醚显著减少了OGD/R条件下BV2细胞的IkappaB-α磷酸化。此外，OGD/R BV2细胞核内的NF-κB蛋白水平增加，而用异氟醚预处理OGD/R BV2细胞后，这一现象显著逆转。这对应于异氟醚显著减少OGD/R BV2细胞释放的TNF，这一点通过ELISA得到了确认。
在同一研究中，Qin等人建议糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的失活可能是异氟醚在中风期间的另一个保护作用。本质上，GSK-3β是一种持续活跃的丝氨酸/苏氨酸激酶，在TLR4刺激的细胞中通过PI3K通路在第9位调节丝氨酸残基（Ser9）的磷酸化而失活，从而导致促炎性细胞因子的减少和抗炎性细胞因子IL-10的增加。用Western blot检测LPS刺激的BV-2小胶质细胞中的GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达，显示p-GSK-3β与总GSK-3β的比率增加了3.2倍。用异氟醚预处理进一步将比率提高了1.4倍。因此，在TLR4刺激的小胶质细胞中，异氟醚可以帮助增强GSK-3β的磷酸化，同时下调TLR4，从而减少促炎性细胞因子并增加抗炎性细胞因子IL-10。
2.5 下调连接蛋白43
促进小胶质细胞中连接蛋白43（Cx43）的显著下调是异氟醚在中风期间显示的另一种独特保护作用。Cx43是一种脊椎动物蛋白，形成间隙连接通道，进行相邻细胞之间细胞质隔室的直接信号传导。此外，Cx43还能够形成半通道，使ATP、谷氨酸、离子（如Ca2+）和其他小的促炎性或神经毒性分子等因子和分子释放到细胞外介质中。连接蛋白43可以在多个位点被磷酸化，这以不同方式影响其组装和功能。缺血时，小胶质细胞被促炎性细胞因子（如TNF和INF-γ）激活，增加Cx43的表达。激活的小胶质细胞迁移到受损神经元，通过Cx43形成的间隙连接通道进行离子、第二信使和小分子的物理交换，以促进促炎性和神经退行性细胞功能，如小胶质细胞或神经元中的凋亡。此外，经历凋亡的细胞产生的碎片和促炎性细胞因子可以进一步促进Cx43在小胶质细胞中的过表达，导致异常且大规模的凋亡信号，甚至可能杀死健康细胞。在一项研究中，确认了异氟醚通过下调小胶质细胞Cx43在中风中的抗炎作用。在体外模型（缺氧/复氧（H/R）损伤）中，使用免疫荧光染色观察到H/R损伤后Iba1+细胞显著增加约20%，表明小胶质细胞活化增加。还观察到促炎性细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF）水平的增加和抗炎性细胞因子（如IL-10）水平的下降。重要的是，根据Western blot结果，H/R暴露后小胶质细胞中Cx43和磷酸化Cx43（p-Cx43）水平升高。此外，使用TUNEL测定法观察到小胶质细胞中显著增加的凋亡。此外，在设计用于研究H/R损伤小胶质细胞对神经元作用的离体模型中，将大鼠原代神经元在H/R损伤小胶质细胞的条件培养基（MCS）中培养24小时。MTT测定结果显示，由于H/R损伤，神经元活力略有下降，但在MCS培养后观察到显著下降。使用40 μM异氟醚处理，小胶质细胞活力改善，Iba1、Cx43和p-Cx43表达降低，说明异氟醚可行地削弱Cx43的表达和磷酸化，并减少小胶质细胞活化。此外，观察到促炎性细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF）显著减少，同时抗炎性细胞因子（如IL-10）显著增加，这意味着异氟醚处理可以显著保护小胶质细胞免受H/R损伤的影响。因此，结果证实异氟醚通过下调小胶质细胞中的Cx43表达，从而减少神经元凋亡，具有抗I/R损伤的抗炎作用。为了研究Cx43在异氟醚对H/R诱导的神经元损伤的挽救作用中的角色，我们敲低了小胶质细胞中的Cx43。结果显示，与单独使用异氟醚处理相比，Cx43敲低结合异氟醚处理显著减少了微管相关蛋白2（Map2）的表达，并在H/R暴露的MCS处理神经元中实现了更高的形态恢复。此外，Cx43敲低和异氟醚处理相比H/R损伤细胞显著增加了小胶质细胞的存活率，并分别减少了促炎性细胞因子和增加了抗炎性细胞因子。最后，他们在体内中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型中研究了异氟醚在I/R损伤中的保护作用。结果与体外结果一致，接受异氟醚治疗和Cx43下调的MCAO动物显示出脑梗死体积和神经元凋亡显著减少。通过Cx43的过表达，I/R损伤条件恶化，尽管异氟醚仍可通过下调Cx43表达稍微减轻细胞死亡和小胶质细胞活化。
2.6 JAK1/STAT3通路激活
据报道，异氟醚通过激活特定的Janus激酶-信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）信号通路（如JAK1/STAT3）在中风中具有神经保护作用。JAK/STAT通路参与多种细胞因子的免疫反应和非免疫介质（如生长因子和激素）的作用。事实上，JAK家族包括四个成员（JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2（TYK2）），STAT家族包括七个成员（STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6）。JAK成员对其受体亲和力不同，这些亲和力与其胞质部分组成性关联。当特定配体与其受体结合时，会组装一个活性受体复合物，其胞质部分会磷酸化受体相关的JAKs。反过来，JAKs的磷酸化为STATs提供停泊位点，从而使STATs在其酪氨酸和丝氨酸残基上被磷酸化。然后，磷酸化的STATs从受体复合物中释放出来，形成二聚体，转运到细胞核中与特定目标基因的启动子区域结合，从而调节这些基因的转录。在JAK/STAT家族成员中，JAK1/STAT3通路的激活在中风中显示出抗炎作用。基本上，JAK1的磷酸化可以通过磷酸化STAT3在酪氨酸705和丝氨酸727残基上来调节STAT3活性，其中Ser727残基磷酸化的减少通常与Tyr705残基磷酸化的增加相关。在先前的研究中，使用CoCl2诱导的缺氧损伤BV2细胞建立了体外缺氧模型，以评估异氟醚在缺血/缺氧中风中的保护作用。根据Western blot结果，CoCl2处理降低了JAK1的表达和磷酸化。此外，CoCl2处理减少了STAT3在Tyr-705处的磷酸化，对STAT3在Ser-727处的磷酸化没有影响。然而，异氟醚预处理在CoCl2诱导的缺氧损伤BV2细胞中减少了这些CoCl2调控的效果。此外，为了进一步研究异氟醚通过激活JAK1/STAT3通路的抗炎作用，Lu等人用异氟醚和选择性JAK1抑制剂INCB039110预处理BV2细胞，随后进行CoCl2处理。根据结果，INCB039110消除了异氟醚的效果，导致TNF产量的增加。虽然很明显，异氟醚在中风中的抗炎作用涉及通过增加JAK1磷酸化和随后的STAT3在Tyr-705处的磷酸化激活JAK1/STAT3通路，但异氟醚启动或调控该通路的确切分子机制仍不清楚。
此外，一些研究表明，STAT3可以根据其激活背景和磷酸化状态充当促炎因子和抗炎因子。在抗炎背景下，STAT3促进M2小胶质细胞极化，这与组织修复和抗炎反应有关。然而，在某些条件下，STAT3的激活也可以支持促炎过程，特别是如果磷酸化程度或模式发生改变，例如异常或过度激活可能会促进炎症基因表达。因此，虽然JAK/STAT3通路参与促进M2极化和抗炎作用，但由于STAT3的作用取决于具体调控方式，该通路本身具有多样性，可以在抗炎或促炎结果之间转变。
2.7 miR-155/SOCS1通路
异氟醚的一些抗炎作用与下调特定miRNA（如miR-155）有关——miR-155在TLR4激活后表达，是调节中枢神经系统（CNS）炎症反应的最重要的miRNA之一——并且在小胶质细胞中对一些促炎性细胞因子基因（如IL-6和TNF）的强烈诱导至关重要。同时，在LPS通过TLR4激活小胶质细胞时，启动了一些负反馈回路——如抑制细胞因子信号传导-1（SOCS1）表达——以防止过度反应和发展出耐内毒素性。据报道，miR-155通过下调小胶质细胞中的SOCS1发挥促炎功能。SOCS1是一种通过直接抑制JAK/STAT激活来抑制细胞因子信号翻译的蛋白质，从而抑制细胞因子的产生。因此，miR-155通过靶向和降解SOCS1 mRNA在转录后调节SOCS1。在另一项研究中，使用LPS激活的BV2小胶质细胞来研究异氟醚通过抑制miR-155/SOCS1的抗炎作用。根据PCR测定结果，用增加浓度的LPS处理BV2细胞导致miR-155的显著剂量依赖性表达。然而，当用异氟醚处理LPS激活的BV2小胶质细胞时，观察到miR-155表达显著减少。为了进一步评估miR-155在异氟醚抗炎作用中的作用，使用miR-155抑制剂敲低miR-155。根据结果，在未转染的BV2细胞中，异氟醚显著减少了促炎介质和细胞因子（如NO、TNF和IL-6）的产生。然而，在miR-155敲低的BV2细胞中，LPS诱导的促炎性细胞因子的产生较弱，异氟醚对这些细胞因子的产生几乎没有影响，表明miR-155在异氟醚抗炎作用中的关键作用。此外，测量了不同处理中SOCS1的蛋白表达。在转染阴性对照抑制剂——用作基线参考以与miR-155特异性抑制进行比较的非靶向抑制剂——的细胞中，LPS处理略微增加了SOCS1蛋白表达。然而，在LPS和异氟醚存在的情况下，SOCS1蛋白表达显著高于仅LPS处理的情况，确认异氟醚可以上调SOCS1。尽管异氟醚在LPS刺激下显著增加了阴性对照抑制剂转染细胞中的SOCS1，但在miR-155敲低细胞中未能诱导SOCS1。此外，为了确认SOCS1在异氟醚抗炎作用中的作用，测量了SOCS1下调的小胶质细胞中的亚硝酸盐和细胞因子水平。BV2小胶质细胞被转染了SOCS1或对照siRNA。根据结果，在SOCS1敲低细胞中，响应LPS的NO、TNF和IL-6生产水平显著高于对照siRNA。然而，异氟醚显著减少对照siRNA处理细胞中LPS诱导的NO、TNF和IL-6的生产，但在SOCS1敲低细胞中不明显，表明SOCS1在异氟醚抗炎作用中起着关键作用。总体而言，可以得出结论，异氟醚通过miR-155/SOCS1通路的抗炎作用是通过下调miR-155并由此上调SOCS1表达所产生的——共同导致促炎介质生产的显著减少。
2.8 miR-221/222-IRF2通路
miR-221/222-IRF2轴被视为由异氟醚激活的抗炎通路。miR-221/222基因簇位于Xp11.3染色体上。miR-221/222的启动子区域包含两个经典的TATA盒，分别位于pre-miR-222上游550和190个碱基对处，以及三个pre-miR-221下游的多聚A序列。血管紧张素II与包括雌激素受体α和核受体NCOR1和NCOR2在内的抑制复合物一起调控该基因簇的表达。miR-221和miR-222一起被编码和转录为pri-miR，这两个旁系同源miRs相距726 bp，并共享相同的种子核苷酸序列。通过Drosha和RNA结合蛋白DiGeorge综合征关键区域基因8（DGCR8）介导的核加工，pri-miR转录生成110个核苷酸的pre-miR-221和pre-miR-222。miR-221/222-IRF2通路的另一个组成部分，干扰素调节因子2（IRF2），通过与促炎转录因子IRF1相同的DNA序列结合，起到转录抑制因子的作用。IRF2通过与共抑制因子（包括IRF2结合蛋白2（IRF2BP2））相互作用来发挥其转录抑制效果，从而激活抗炎（M2）标志基因并抑制促炎（M1）标志基因。一些研究表明，miR-221/222通过抑制IRF2翻译来减少IRF2蛋白水平，从而促进炎症。然而，其他研究表明，异氟醚可以抵消miR-221/222的功能，从而增加IRF2蛋白水平，导致促炎性细胞因子水平的下降。这项研究报告称，LPS诱导的miR-221/222上调被异氟醚治疗显著消除。为了研究miR-221/222在小胶质细胞活化中的作用，他们通过转染miR-221和miR-222模拟物在BV2细胞中过表达miR-221/222。结果揭示了细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的生产显著增加。然而，当他们通过miR-221和miR-222抑制剂沉默LPS引发的BV2细胞中的miR-221/222表达时，观察到炎症细胞因子水平显著下降，表明miR-221/222在小胶质细胞活化中的调节作用。此外，使用三种公开可用的算法（TargetScan、miRDB和miRBase）发现IRF基因是miR-221/222的目标。事实上，miR-221或miR-222的异位表达导致BV2细胞中IRF2蛋白表达的减少。最后，检查了miR-221/222–IRF2轴是否介导异氟醚在小胶质细胞活化中的抗炎作用。Xiao等人使用异氟醚处理上调了LPS刺激的BV2细胞中的miR-221/222。结果显示，由于异氟醚处理，炎症基因（Il1b、IL6、Tnf、Ptgs2和Nos2）的表达显著减少，从而降低了细胞因子水平，这可以通过miR-221或miR-222模拟物恢复。此外，遗传沉默LPS引发的BV2细胞中的IRF2并用异氟醚处理，确认了异氟醚无法诱导抑制效果。所有这些发现表明，miR-221/222–IRF2轴是异氟醚抑制小胶质细胞活化的重要功能性介质。
2.9 NF-κB/Hif-1α信号通路
抑制NF-κB/Hif-1α信号通路代表了异氟醚在神经炎症中发挥抗炎作用的另一种机制。NF-κB家族的转录因子包括五个成员——p50、p52、p65（也称为RelA）、c-Rel和RelB——它们以异源或同源二聚体复合物的形式存在。这些亚基在细胞质中被IkB家族成员失活。当被某些化合物（如TNF）激活时，会诱导激酶信号级联反应，导致IKK介导的IkB磷酸化及其随后的多泛素介导的蛋白酶体降解。这有助于释放NF-κB，其转运到细胞核中并与目标基因启动子和增强子结合，从而促进各种促炎性细胞因子的产生。重要的是，据报道，NF-κB亚基p65在Hif-1α mRNA和蛋白的产生中起关键作用。低氧诱导因子-1α（Hif-1α）是HIF-1的一个亚基，HIF-1是在低氧条件下启动的转录因子。事实上，在低氧期间，Hif-1α亚基的稳定性提高，这导致Hif-1α上调促炎基因的转录，如细胞因子。根据许多研究，NF-κB作为Hif-1α的转录激活因子起关键作用；在缺乏NF-κB的情况下，即使在延长的低氧期间，Hif-1α基因也不会被转录。异氟醚可以通过下调NF-κB p65来抑制CoCl2缺氧诱导的BV2细胞中的Hif-1α表达，从而抑制促炎性细胞因子TNF、IL-1β和IL-6的产生。在这项研究中，为了通过抑制NF-κB/Hif-1α通路来检查异氟醚的抗炎作用，作者测量了异氟醚可能影响的两种蛋白——NF-κB p65和Hif-1α——的水平。细胞在CoCl2刺激前约3小时用异氟醚预处理24小时，然后通过Western blot测量NF-κB p65和Hif-1α的生产水平。结果显示，与CoCl2处理组相比，异氟醚显著减少了NF-κB p65和Hif-1α的生产。为了进一步研究NF-κB在异氟醚相关抗炎机制中的作用，作者用siRNA对抗NF-κB p65处理BV2细胞，随后暴露于低氧并孵育24小时
。结果显示，在NF-κB p65沉默和CoCl2处理的细胞中，Hif-1α和IL-1β水平相比仅用CoCl2处理的细胞显著下调。因此，异氟醚抑制NF-κB p65的上调，从而抑制Hif-1α的产生，导致BV2细胞中低氧诱导的炎症减少。
2.10 细胞外囊泡释放
最近报道了异氟醚的另一种抗炎机制，即抑制细胞外囊泡（EV）的释放。细胞外囊泡（包括外泌体和微囊泡）是细胞间信号传导的关键参与者。脑损伤后，小胶质细胞释放这些囊泡以分泌促炎性细胞因子，导致炎症。EV的释放通常由免疫激活剂（如ROS、ATP、LPS和TNF）刺激。在使用LPS刺激的BV2细胞进行的一项研究中，确认了异氟醚通过下调免疫激活的EV释放发挥抗炎作用。在这项研究中，作者首先通过Western blot测量了LPS刺激的小胶质细胞在有无异氟醚处理情况下的EV释放，方法是测定EV颗粒中的EV标记物flotillin-2和组织转谷氨酰胺酶（tTG）的蛋白水平。结果显示，单独使用LPS显著增加了flotillin-2和tTG的蛋白水平；然而，异氟醚处理显著降低了flotillin-2和tTG水平，表明异氟醚可以减少小胶质细胞释放EV。此外，为了研究EV在异氟醚介导的小胶质细胞抗炎反应中的作用，作者检查了是否可以通过向治疗组添加从免疫激活的小胶质细胞中分离的EV来逆转异氟醚的抗炎效果，同时加入LPS和异氟醚。结果表明，异氟醚介导的M1标记基因下调和M2标记基因上调在EV处理后完全逆转，证实异氟醚通过减少EV释放发挥其抗炎作用。此外，为了测量异氟醚通过抑制EV释放减少小胶质细胞介导的神经毒性，他们收集了LPS刺激的BV2细胞的EV并将其添加到实验组中。结果显示，EV处理在没有LPS的情况下并未显著影响N2A细胞中小胶质细胞介导的神经毒性；然而，EV处理显著逆转了LPS刺激的小胶质细胞中异氟醚介导的神经保护作用。最后，使用MAP2 ELISA以更具体地靶向N2A培养物中的MAP2阳性神经元，并定量确定LPS和异氟醚处理后的神经元存活率。异氟醚逆转了条件培养基中LPS刺激的小胶质细胞引起的神经毒性，但这种保护作用在收集条件培养基前将EV添加到小胶质细胞培养物中时被消除。LPS激活的小胶质细胞还在培养物中诱导TUNEL阳性细胞，这是凋亡的标志，而收集条件培养基前将EV添加到小胶质细胞培养物中进一步加剧了这一效应。总之，结果证实异氟醚预处理通过抑制EV释放减少了激活的小胶质细胞介导的神经毒性。
2.11 氧化应激与抗氧化活性增强
线粒体作为细胞的双膜亚区室，是ROS产生的主要来源，同时也是ATP生产的重要角色。中风和IR损伤后，线粒体功能障碍导致的ROS水平升高会引发氧化应激，导致神经退行性变。尽管再灌注期间线粒体ROS产生的原因尚不清楚，但据报道，缺氧诱导的中风和IR损伤期间线粒体产生的ROS增加可能是由于线粒体中柠檬酸循环中间分子琥珀酸的异常高水平。此外，IR损伤期间ROS的过度产生还可能导致线粒体膜电位下降，从而加重线粒体功能障碍。在一项使用CoCl2缺氧诱导BV2细胞的研究中，确认了异氟醚通过改善氧化应激和增强抗氧化活性的保护作用。结果显示，与对照细胞相比，CoCl2处理显著增加了BV2细胞中的ROS产生，而异氟醚处理减少了CoCl2诱导的ROS水平。同时，CoCl2降低了超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力（T-AOC），而异氟醚改善了这一减少。异氟醚恢复SOD和T-AOC的抗氧化活性抑制了ROS的过量产生和炎症反应。异氟醚通过抑制NF-κB激活恢复SOD活性，从而抑制炎症反应。此外，异氟醚减少Fe2+到Fe3+的氧化，从而防止Hif-1α蛋白的稳定化，导致炎症介质的下调。异氟醚还改善了CoCl2处理的小胶质细胞中线粒体膜电位的下降。
2.12 细胞内Ca2+稳态
维持细胞内Ca2+稳态被认为是异氟醚在小胶质细胞中的一种重要抗炎机制。许多小胶质细胞的生理功能——如细胞增殖、分化、迁移以及涉及许多基因转录调控的细胞内酶促通路的诱导——已知与细胞内Ca2+信号传导相关。根据一些研究，小胶质细胞内Ca2+浓度的增加与促炎性细胞因子和ROS的产生有关。根据这些研究，虽然小胶质细胞内Ca2+浓度的增加对于炎症细胞因子的产生是必要的，但它本身并不足以单独引发这一过程；还需要用LPS处理小胶质细胞。在神经系统中，CaMKIIα是Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMK）的主要同工型，对细胞内Ca2+水平高度敏感，其激活与促炎性细胞因子（如TNF和IL-1β）的产生相关。此外，ERK 1/2和NF-κB也参与了Ca2+介导的TNF-α释放。在一项使用CoCl2缺氧诱导BV2细胞的研究中，研究了异氟醚通过维持细胞内Ca2+稳态发挥抗炎作用的效果。结果显示，与对照相比，CoCl2处理增加了细胞质Ca2+浓度以及CAMKIIα、ERK和NF-κB蛋白的磷酸化。然而，异氟醚预处理减弱了CoCl2诱导的细胞内Ca2+水平的增加，并下调了CAMKIIα、ERK和NF-κB的磷酸化。为了研究Ca2+稳态和CAMKIIα、ERK、NF-κB磷酸化在TNF生产中的作用，BV2细胞用钙螯合剂BAPTA-AM、CAMKIIα抑制剂KN93或ERK抑制剂U0126预处理，随后进行CoCl2处理。结果显示，BAPTA-AM、KN93和U0126显著减少了TNF的生产，效果与异氟醚相似。为了确认CAMKIIα、ERK和NF-κB磷酸化在异氟醚对CoCl2处理的保护作用中的作用，BV2细胞用钙螯合剂BAPTA-AM、CAMKIIα抑制剂KN93或ERK抑制剂U0126预处理，随后进行CoCl2处理。结果显示，与异氟醚处理类似，BAPTA-AM和KN93显著减少了CAMKIIα的磷酸化。此外，BAPTA-AM、KN93和U0126显著减少了ERK和NF-κB的磷酸化，效果也与异氟醚处理相似。此外，他们发现CoCl2处理增加了细胞凋亡和裂解的caspase 3的表达；然而，这些效应被异氟醚处理所抑制，表明CoCl2诱导的凋亡可以被异氟醚抑制。最后，BV2细胞用钙螯合剂BAPTA-AM、CAMKIIα抑制剂KN93或ERK抑制剂U0126预处理，随后进行CoCl2处理，以研究Ca2+稳态和CAMKIIα、ERK、NF-κB通路在细胞凋亡中的作用。结果显示，BAPTA、KN93和U0126各自减少了凋亡细胞的百分比。此外，发现BAPTA、KN93和U0126各自抑制了裂解的caspase 3的表达。然而，异氟醚、BAPTA-AM、KN93和U0126预处理对pro-caspase 3的表达没有影响。总体而言，结果表明异氟醚的一种抗炎机制是通过限制细胞内Ca2+过载，调节CaMKIIα、ERK和NF-κB的磷酸化，从而减少促炎性细胞因子的产生和细胞凋亡。
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