摘要
背景 单次血浆Aβ测量在阿尔茨海默病诊断中并无实用价值，但重复检测中血浆Aβ水平的变化可能有助于预测和评估早期阿尔茨海默病或轻度认知障碍的进展。
目的 考察基线与连续测量的血浆Aβ水平与随访中认知变化的关系。
方法 来自一项基于人群队列的269名受试者（52名认知受损，217名对照）接受了3至6年的临床随访。70名受试者提供了3年随访的血浆样本，43名受试者提供了6年随访样本。采用ELISA方法测量血浆Aβ水平。
结果 随访中认知下降的受试者基线血浆Aβ42水平较低。在随访期间认知下降者中，血浆Aβ42及Aβ42/Aβ40比值下降（6年内Aβ42下降2.4 pg/ml），而认知稳定或改善者中Aβ42及Aβ42/Aβ40比值则上升。使用乙酰水杨酸、双嘧达莫、抗糖尿病或抗凝药物的受试者，以及患有冠心病的受试者，其Aβ40水平较高。
结论 随访中较低或持续下降的血浆Aβ42水平与认知衰退相关。连续测量血浆Aβ42可能有助于识别处于认知衰退风险中的个体。
关键词：阿尔茨海默病；淀粉样蛋白；血浆；痴呆；轻度认知障碍；阿尔茨海默病；淀粉样蛋白；痴呆
引言
阿尔茨海默病是痴呆最常见的病因。目前其诊断基于临床标准并排除其他原因。然而，由于已有对症治疗且疾病修饰药物已进入III期试验，迫切需要用于早期诊断和疾病监测的客观生物标志物。老年斑中β淀粉样蛋白沉积是阿尔茨海默病的病理特征之一，与神经原纤维缠结并列。β淀粉样蛋白是由神经元和血小板分泌的肽，来自淀粉样前体蛋白，经β和γ分泌酶裂解产生。大脑中沉积的大部分Aβ由42个氨基酸形式构成，且Aβ42首先积累，Aβ40在阿尔茨海默病发病过程中较晚沉积。轻度认知障碍和阿尔茨海默病患者脑脊液中Aβ42水平降低，脑脊液Aβ42与τ蛋白或磷酸化τ蛋白联合检测被认为有助于早期诊断。
Aβ存在于血浆中，但其来源是外周还是脑内仍不清楚。在Tg2576转基因小鼠中，血浆Aβ水平随大脑中Aβ积累增加而下降。由于Aβ可通过血脑屏障双向转运，有假设认为脑脊液与血浆Aβ池之间存在平衡。鉴于脑脊液Aβ42随认知衰退而下降已被确认，推测血浆Aβ42可能同样下降。若如此，血浆Aβ将提供一种直接、无创且经济的阿尔茨海默病生物标志物。然而，已知21号染色体突变导致早发性家族性阿尔茨海默病的患者以及21三体综合征患者在痴呆症状出现前血浆Aβ42水平已升高。此外，晚发性阿尔茨海默病患者的一级亲属血浆Aβ水平也升高。
既往研究表明，散发性阿尔茨海默病发病前血浆Aβ40水平升高。但最近一项研究认为，低血浆Aβ40水平预测老年男性阿尔茨海默病。其他研究发现，后来发展为痴呆的患者Aβ42水平升高，尤其是遗忘型轻度认知障碍。最后，多项研究未发现阿尔茨海默病转换者与认知稳定对照之间的Aβ水平存在显著差异。
单次血浆Aβ测量似乎无实用价值，而重复检测中血浆Aβ水平的变化可能有助于预测和评估早期阿尔茨海默病或轻度认知障碍的进展。然而，目前纵向研究有限。我们的目的是在基于人群的轻度认知障碍和认知完整对照队列中，探讨随访期间血浆Aβ水平的变化是否比基线水平更能预测认知下降。
研究对象与方法
研究对象
研究对象来自一项基于人群的研究（n=806，年龄60-76岁），该研究旨在考察老年人痴呆的风险因素和预测指标。基线时（1997-1998年），52名受试者存在认知损害（临床痴呆评分为0.5者51名，CDR 1者1名）。本研究的第一组包括原始队列中所有提供血浆样本的认知损害受试者（n=52）。对于每个认知损害者，我们随机从同一队列中选取4-5名年龄和性别匹配的认知完整对照（n=217）。这些受试者分别于3年（n=197）和6年（n=60）后接受临床重新评估。
纵向标志物组（组2）包括原始269名受试者中提供3年随访血浆样本的70名，其中43名提供了6年随访样本。组2包括11名基线时认知损害但非痴呆的受试者（CDR 0.5）并提供了至少一次随访血浆样本，以及59名基线认知完整且年龄性别匹配的对照（至少一次随访血浆样本）。失访主要由于参与者拒绝继续研究。所有受试者均签署知情同意书，研究获得当地伦理委员会批准。
临床评估
评估包括结构化详细访谈，涵盖人口统计学信息、病史、用药、吸烟和饮酒习惯，以及主观记忆障碍和抑郁评估。还包括临床检查以及通过CDR和一系列神经心理学测试进行的认知损害评估：记忆：韦氏记忆量表视觉再现测试、CERAD神经心理学评估量表词语列表回忆、韦氏记忆量表修订版逻辑记忆测试、NYU段落回忆、CERAD结构性实践延迟回忆；语言：韦氏成人智力量表修订版词汇分测验、简版（15项）波士顿命名测试；注意与执行功能：连线测试A和B部分、词语流畅性测试；视空间技能：韦氏成人智力量表修订版积木设计、CERAD结构性实践；整体功能：简易精神状态检查、画钟测试。
认知衰退定义为CDR从0变为0.5或从0.5变为1。
Aβ40和Aβ42的测量
269份基线样本（组1）于2002-2003年测量。完成6年随访后，我们重新分析了70名受试者的基线样本（组2），并与其随访样本（组2）于2006-2007年一同测量。
静脉血样本采集于肝素管，血浆采用标准方法分离。样本等分后储存于-70℃聚丙烯管中直至分析。Aβ40通过改良自成熟方法的ELISA测量。捕获抗体为6E10，检测抗体为生物素标记的G2-10抗体。使用合成Aβ1-40肽作为标准品。分析前向样本中加入0.05% Tween 20-0.5% BSA。Aβ42采用市售高灵敏度ELISA方法测量，我们对该方法进行了改良，使其适用于高于7 pg/ml浓度的测量。分析前向标准品和样本中加入0.5 M盐酸胍。使用去污剂以避免样本凝集并释放血浆蛋白中的Aβ肽。
在纵向分析中，将同一个体的基线和随访样本置于同一板上以避免批间变异。因此，我们测量了70名受试者的基线样本两次（间隔4年）。两次测量的绝对浓度不同：Aβ40中位水平为174.5（2003年）和198 pg/ml（2007年），Aβ42为17（2003年）和49 pg/ml（2007年）。但两次测量之间存在中度相关性（Aβ40 r=0.674，p<0.001；Aβ42 r=0.824，p<0.001）。相关图见补充资料。
Aβ40测定批间变异为23.8%，Aβ42测定为19.1%。批间CV使用中等浓度参考样本（Aβ40约250 pg/ml，Aβ42约400 pg/ml）测量。Aβ40的批内变异：高浓度（约1200 pg/ml）为0.71%，中等浓度为0.95%，低浓度（约150 pg/ml）为5.9%。Aβ42的批内CV（中位）：分别为1.6%（约1000 pg/ml）、2.5%和9.8%（约15 pg/ml）。
APOE基因分型
APOE等位基因分型采用基于PCR的方法。受试者分为APOE ε4阴性和APOE ε4阳性。
统计学
统计分析使用SPSS for Windows 14.0.1。由于数据非正态分布，采用Kruskal Wallis、Mann-Whitney U和Spearman相关检验。分类数据使用χ²检验。通过logistic回归分析计算不同组别受试者认知衰退的比值比。使用Microsoft Excel拟合线性回归斜率以分析Aβ水平的变化趋势。
结果
表1呈现受试者的人口统计学信息。269名个体的基线Aβ40和Aβ42水平普遍较低，但部分受试者Aβ42水平极高。90分位临界值为101 pg/ml，但最高测量值为1341 pg/ml。Aβ40水平与年龄呈弱相关（r=0.186，p=0.002），但Aβ42无此关联。Aβ40和Aβ42水平在性别间或APOE ε4携带者与非携带者间无差异。Aβ42水平与Aβ40浓度不相关。
基线Aβ水平与随访期间认知衰退
认知受损者（n=52）与认知完整者（n=217）在基线血浆Aβ40、Aβ42或Aβ42/Aβ40比值方面无显著差异。
然而，其中197名受试者于3年后接受临床评估，60名于6年后评估。基线Aβ42水平在3年随访后认知下降的受试者中显著较低（认知稳定n=147：19 pg/ml（0-1341）；认知下降n=50：12 pg/ml（0-276）；p=0.001）。6年后认知下降者的基线Aβ42水平（10 pg/ml，n=36）也低于认知稳定者（18 pg/ml，n=24），p=0.013。
基线Aβ42处于最低四分位数的受试者，与最高四分位数相比，3年后认知衰退的比值比为3.12（95% CI 1.25-7.79，p=0.015），6年后为4.77（95% CI 1.14-19.98，p=0.033）。类似地，Aβ42/Aβ40比值处于最低四分位数的受试者，3年后认知衰退的比值比为3.26（1.31-8.11，p=0.011），6年后为8.40（1.83-83.568，p=0.006）。
血浆Aβ水平变化与认知衰退的关系
70名受试者提供了3年随访血浆样本，43名提供了6年样本。认知下降者（3年后n=27，6年后n=14）的Aβ42中位水平保持不变或下降，而认知稳定者则升高。Aβ40水平无显著统计学变化。认知下降者的Aβ42/Aβ40比值显著降低。
进行了趋势分析，为每名受试者计算斜率，用于评估认知稳定者与认知下降者之间Aβ42的变化。在3-6年随访期间，70名受试者中有28名认知下降，其中24名在随访期间Aβ42水平呈下降趋势。认知下降者的Aβ42水平保持不变，认知稳定者则升高（0.0 (4.9) pg/ml/年 vs 2.1 (21) pg/ml/年；斜率差异p=0.009）。Aβ42/Aβ40比值的对应的变化也显著（每年0.0 (0.029) vs 每年0.0036 (0.055)；斜率差异p=0.02）。
血浆Aβ与总体健康状况
表3显示了药物以及某些疾病与血浆Aβ水平的关系。Aβ40水平与基线使用降脂药或非甾体抗炎药无关。激素替代疗法与女性Aβ值无关。使用乙酰水杨酸（n=62，p=0.004）或双嘧达莫（n=12，p=0.017）的受试者Aβ40水平较高。两种药物均未使用者Aβ40值最低，仅使用其中一种者居中，两种均使用者最高。单独使用胰岛素（n=5，p=0.009）或胰岛素联合口服抗糖尿病药物（n=13，p=0.003）的受试者Aβ40水平也较高。Aβ42水平与任何药物使用无关。冠心病与高血浆Aβ40水平相关（p=0.035）。认知稳定组与认知下降组在用药方面无统计学显著差异。
讨论
我们的结果表明，低或下降的血浆Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值与随访期间认知衰退相关。此外，连续测量中可能存在的与年龄相关的血浆Aβ42水平升高与稳定的认知表现相关。
我们在基线横断面分析中未发现认知完整者与认知受损者之间血浆Aβ水平的差异。既往比较散发性阿尔茨海默病患者与对照者血浆Aβ水平的横断面研究结果矛盾。有报告发现Aβ40或Aβ42升高，而其他研究未发现阿尔茨海默病与对照之间的差异。最近一项研究发现，遗忘型轻度认知障碍女性的血浆Aβ42水平高于健康对照或受影响男性。然而，基线低Aβ42水平与随访期间发生的认知衰退相关。与我们的结果一致，最近一项研究检测到低Aβ42/Aβ40比值与认知衰退之间的关联。同样，一项针对257名痴呆患者的前瞻性三城研究发现，高Aβ42/Aβ40比值与随访期间痴呆风险降低相关。另一项基于人群的病例队列研究声称，基线血浆中低Aβ42与高Aβ40组合的个体痴呆风险增加超过10倍，但单独Aβ42或Aβ40水平与认知衰退无关。其他研究报告了不同结果。VITA研究发现基线Aβ水平与随访期间认知衰退无关。其他研究在后来发展为阿尔茨海默病的受试者中发现了基线Aβ42浓度升高，尽管在完全调整的多变量模型中血浆Aβ水平与阿尔茨海默病无关。
研究队列的差异，例如相对于认知衰退的时机、认知功能评估方式以及用药和其他疾病等混杂因素的存在，都可能影响结果。一些研究的终点是转换为痴呆，而我们的研究以及其他一些研究的终点是认知衰退。所选终点以及样本收集时机的差异可能部分解释结果的不同。
由于存在许多混杂因素，单次血浆Aβ测量可能不适合作为阿尔茨海默病的标志物。就阿尔茨海默病的自然病程而言，Aβ测量的时机可能至关重要。对转基因动物的实验研究表明，当大脑中Aβ开始积累时，血浆Aβ水平下降。高血浆Aβ浓度可能与阿尔茨海默病的发展有关，正如在阿尔茨海默病基因突变携带者和晚发性阿尔茨海默病患者一级亲属中发现的血浆Aβ水平升高所表明的那样。然而，由于大脑淀粉样蛋白病理在首次症状出现前数年就已开始，在有症状的个体中可能检测不到血浆Aβ的潜在升高。这一假设只能在纵向研究中加以探讨。与我们的结果一致，先前的研究表明下降的Aβ水平与认知衰退相关，并且已诊断为阿尔茨海默病的患者Aβ42水平低于轻度认知障碍患者。许多研究表明血浆Aβ水平随年龄增长而升高，正如我们在认知完整受试者中发现的那样。在一项研究中，从轻度认知障碍转换为阿尔茨海默病的受试者年龄相关性升高最小。阿尔茨海默病患者血浆Aβ40和Aβ42的年龄相关性变化可能不同。在这方面，Aβ42/Aβ40比值可能比单一标志物更能预测阿尔茨海默病。
研究队列的差异使得不同研究之间的比较变得困难。许多混杂因素可能影响血浆Aβ水平。肾功能障碍可能增加血浆Aβ，因为血浆Aβ通过肾脏排泄。许多研究表明血管疾病与血浆Aβ水平之间存在关联。血浆同型半胱氨酸（一种可能的血管疾病标志物）水平与血浆Aβ40和Aβ42水平呈正相关。既往研究也表明某些药物可能影响血浆Aβ。我们发现使用乙酰水杨酸和双嘧达莫（直接影响血小板功能和活化的药物）的受试者以及使用抗凝和抗糖尿病药物的受试者Aβ40水平升高，而使用非甾体抗炎药或降脂剂与血浆Aβ水平无关。乙酰水杨酸与血浆Aβ40的关联在没有心血管疾病的受试者中也存在。与先前研究一致，未发现Aβ水平与降脂剂之间的关系。
方法论和实验条件的差异也可能影响结果。红细胞和血浆蛋白（例如白蛋白和脂蛋白）结合Aβ，变性条件将Aβ释放到血浆游离池中。此外，免疫测定中使用的不同抗体可能检测到Aβ的不同组分。先前研究表明，不同ELISA批次之间的Aβ绝对水平存在差异。我们也注意到在隔4年测量两次的70个样本中绝对水平存在差异。由于这些方法学困难，单次测量的诊断价值有限。
Vanderstichele等人的一项研究报告了标准化样本储存和处理条件的重要性。为了更好地利用这些分析，所使用的检测方法应商业化、标准化并经过充分验证。
我们得出结论，血浆Aβ不是阿尔茨海默病的诊断标志物，但连续测量中Aβ42水平的下降可能与认知衰退相关，并提示阿尔茨海默病的发展。
参考文献
[此处省略原文参考文献列表]
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