摘要
背景：COL4A1和COL4A2基因（编码胶原蛋白IVα链1/2）的遗传变异出现在遗传性和散发性脑小血管病（CSVD）中，CSVD是卒中、痴呆和脑出血（ICH）的主要原因。然而，CSVD伴ICH与COL4A1/COL4A2变异的分子机制仍不清楚。
方法：对携带Col4a1错义突变的小鼠和杂合Col4a2敲除小鼠进行血管功能和分子研究，并结合对携带COL4A1/COL4A2突变的人脑内皮细胞以及散发性CSVD伴ICH患者脑组织的分析。
结果：Col4a1错义突变导致独立于高血压的早发性CSVD，表现为小动脉血管舒张增强，这是由于内皮功能障碍、血管壁增厚和硬度降低。机制上，早发性失调的内皮依赖性超极化（EDH）是由于胶原蛋白IV水平降低，导致内皮细胞钙离子敏感性K+通道活性及水平升高，进而通过血管平滑肌细胞中的Na/K泵引起血管舒张。我们的数据支持这种内皮功能障碍先于CSVD相关ICH的发生，是由于内皮细胞胞质钙离子水平升高所致。此外，散发性CSVD患者的脑血管显示基因型依赖性机制：携带常见非编码COL4A1/COL4A2风险等位基因的患者血管壁增厚且胶原蛋白IV水平降低。
解释：COL4A1/COL4A2变异通过失调的EDH、血管壁厚度和生物力学改变（由于胶原蛋白IV水平降低和/或突变胶原蛋白IV分泌）在遗传性和散发性CSVD伴ICH中发挥作用。这些数据突显了EDH和胶原蛋白IV水平作为潜在治疗靶点。
资助：MRC、Wellcome Trust、BHF。
关键词：胶原蛋白；基底膜；脑血管疾病；卒中；小血管病；内皮功能障碍。
研究背景
本研究之前的证据：脑小血管病（CSVD）是导致脑出血（ICH）引起的大部分卒中的原因，也是血管性痴呆的主要原因，约占所有痴呆病例的50%。COL4A1/COL4A2基因编码的胶原蛋白IV是血管基底膜（一种特殊的细胞外基质结构）的主要成分。既往研究表明，这些基因的突变导致罕见的遗传性CSVD，即COL4A1综合征（Gould综合征）。此外，对于晚发性散发性CSVD，非编码变异是65%人群的风险因素，同时也可出现罕见编码变异。然而，引起CSVD的分子机制以及COL4A1/COL4A2遗传变异的作用仍不清楚。
本研究的附加价值：我们揭示了胶原蛋白IV调节小动脉的内皮细胞介导的血管舒张，CSVD涉及血管舒张增强和内皮超极化失调，为小鼠CSVD的机制提供了新见解。这种血管功能障碍伴随着血管硬度降低和壁厚增加，代表了ICH发生前的早期CSVD阶段。这是由基底膜改变驱动的，由于胶原蛋白IV水平降低，导致晚发性微出血和内皮功能障碍。该机制得到了我们对散发性CSVD患者脑组织分析的支持，也为该疾病的基因型-表型相关性提供了新见解。对没有罕见编码COL4A1/COL4A2变异的患者脑血管分析表明，常见非编码风险变异通过降低胶原蛋白IV水平和增加血管壁厚度发挥作用。这种壁增厚也发生在携带罕见编码COL4A1/COL4A2变异的CSVD患者中，数据表明它们通过分泌突变蛋白起作用，因此这是这些不同遗传变异机制汇聚的点。
所有可用证据的意义：这些数据为血管功能调节和CSVD机制提供了新见解。它们确立了在CSVD早期阶段，由于细胞外胶原蛋白IV水平降低（可由罕见编码或常见非编码COL4A1/COL4A2变异和突变引起），导致EDH血管舒张增强。发现通过降低细胞外胶原蛋白IV水平导致过度EDH血管舒张，为未来的治疗策略提供了新靶点。
引言
脑小血管病（CSVD）影响80%的65岁以上成人的小动脉、毛细血管和静脉，是卒中、痴呆和脑出血（ICH）的主要原因，贡献了约50%的痴呆病例。对其分子机制的有限理解阻碍了满足未满足治疗需求的能力。在血管中，基底膜（BM）是一种特殊的细胞外基质（ECM）结构，将内皮细胞与血管平滑肌细胞（VSMC）分隔开，胶原蛋白IV蛋白在BM中形成网络。血管BM包含由α1α1α2(IV)蛋白组成的胶原蛋白IV网络，包括两个α1(IV)链和一个α2(IV)链，分别由COL4A1和COL4A2基因编码。COL4A1/COL4A2的突变导致早发性CSVD伴ICH，以及眼、肌肉和肾脏缺陷，作为多系统COL4A1综合征（Gould综合征）的一部分。常见非编码变异（可能影响表达水平）和罕见编码变异分别发生在约65%和3%的散发性CSVD中，从而确立了胶原蛋白IV作为关键遗传决定因素。
BM缺陷、胶原蛋白IV错误折叠伴内质网滞留和内质网应激可由COL4A1/COL4A2突变引起，但这些上游分子损伤对Gould综合征病理学的相对贡献和分子串扰仍不清楚。此外，对CSVD中血管缺陷的性质以及胶原蛋白IV突变如何引起这些缺陷也缺乏了解。
CSVD中的血管功能障碍典型表现为内皮细胞介导的血管舒张减弱和相关的低灌注，这与CSVD严重程度相关。三种主要的内皮依赖性血管舒张途径是：1）一氧化氮（NO）通过NOS（NO合酶）生成，导致VSMC中cGMP产生；2）环加氧酶产生前列环素；3）内皮细胞中钙离子依赖性钾通道（KCa）的激活导致VSMC超极化和血管舒张中的EDH。虽然这些途径已明确，但ECM和BM在其中作用仍探索不足。因此，COL4A1/COL4A2突变是否影响小血管的内皮依赖性血管舒张是理解CSVD的关键知识空白。
在这里，我们显示胶原蛋白IV是内皮细胞介导血管舒张的调节剂，在CSVD中，Col4a1错义突变通过降低细胞外胶原蛋白IV水平引起内皮功能障碍，伴失调的EDH血管舒张，以及生物力学和结构性血管缺陷。我们的数据还提供了证据，表明常见非编码变异和罕见编码COL4A1/COL4A2变异表现出基因型依赖性机制，这些机制汇聚于脑血管的肥厚性重塑。识别过度EDH血管舒张和较低的胶原蛋白IV水平代表了CSVD的一种新机制，突显了潜在的治疗途径。
方法（略，详见原文）
伦理：动物研究按照英国内政部规定进行。人脑样本来自UK MRC脑库和LINCHPIN研究，获得知情同意。细胞培养实验经伦理委员会批准。
动物研究：Col4a1+/SVC、Col4a2+/em2Wtsi及其同窝野生型小鼠（C57BL6/J背景）随机分组。小鼠在12小时光暗循环下自由进食饮水。ICH作为主要结局。组织在上午9-11点采集。样本编号不显示基因型，研究者盲法。动物通过CO2梯度过量、颈椎脱臼或异戊巴比妥腹腔注射后4% PFA灌注固定处死。
钢丝肌动描记：三级肠系膜动脉环制备并安装在肌动描记仪上。血管归一化至13.3 kPa张力，经KPSS唤醒。用去甲肾上腺素测量血管收缩。内皮依赖性血管舒张通过预收缩血管（3×10−6 M去甲肾上腺素）对卡巴胆碱（1×10−8 − 3×10−5 M）的剂量反应曲线测量。NO贡献通过100μM L-NAME孵育血管30分钟后卡巴胆碱剂量反应曲线评估。基础NO水平通过测量10μM去甲肾上腺素收缩血管（有/无L-NAME预处理）间接评估。ΔmN = mN(L-NAME) - mN(未处理)。评估EDH血管舒张时，血管用1μM TRAM-34和0.5μM apamin孵育20分钟，然后进行卡巴胆碱剂量反应曲线。Na+/K+泵的作用通过10μM哇巴因预处理动脉，然后在L-NAME存在下进行卡巴胆碱剂量反应曲线测量。前列环素介导的血管舒张通过10μM吲哚美辛（环加氧酶抑制剂）存在下卡巴胆碱剂量反应曲线测量。内皮非依赖性舒张通过NO供体硝普钠（SNP）测量。
**血管结构和硬度
血管结构和硬度 使用压力肌动描记系统测量，如前所述（DMT）。血管在被动条件下于PSS中承受压力曲线。在每个压力下测量5分钟后记录内径（Di）和外径（De）。壁厚计算为[(De − Di)/2]。横截面积CSA计算为[(π/4) × (De²−Di²)]。壁腔比W:L计算为[(De-Di)2∗Di]。周向壁应力σ计算为[(P∗Di)/(2∗壁厚)]，其中P=压力。周向壁应变ε计算为[(Di–Di@10 mmHg)/(Di@10 mmHg)。整体刚度β可以计算为[ln (P/Ps) = β(De/Ds-1)]，其中Ps和Ds是参考压力（80 mm Hg）下的参考压力和外径。
血压分析：通过无线电遥测法测量Col4a2+/em2Wtsi和WT同窝小鼠的血压。将PhysioTel PA-C10压力发射器植入左颈动脉，发射器置于肩部。手术在无菌条件下进行，使用异氟烷麻醉，术后给予卡洛芬镇痛。小鼠在加热孵化箱中恢复至完全清醒，并每日监测。术后一周开始记录血压，每5分钟记录一次，持续48小时，使用Dataquest IV遥测系统。根据12小时光暗周期计算日/夜平均值。4-6个月龄Col4a1+/SVC小鼠的收缩压采用尾容积描记法记录。
代谢笼和裂隙灯分析如前所述进行。
小鼠组织组织病理学：组织经4% PFA灌注固定，再固定24小时。石蜡包埋的中脑连续切片（5-7 μm），覆盖约1 mm距离。Perl's普鲁士蓝染色用于检测ICH。肾脏切片进行PAS染色。
小鼠组织免疫染色如前所述进行。组织在液氮中于OCT中冷冻。冷冻切片用丙酮固定，0.01 M HCl/KCl抗原修复，10%山羊血清封闭，一抗4°C孵育过夜，PBS洗涤，二抗室温孵育1小时。使用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片。在Nikon Eclipse Ts2显微镜上成像。
电子显微镜如前所述进行。组织用1%四氧化锇和1.5%铁氰化钾固定，鞣酸处理，再经1%四氧化锇处理，醋酸铀酰染色，梯度乙醇脱水，丙酮置换后包埋于Agar100Hard树脂中。
原子力显微镜：荧光和明场成像用于引导原子力显微镜（AFM）成像。7 μm OCT包埋未固定切片用PBS洗涤，与抗Col4a2抗体孵育，PBS洗涤，再与二抗孵育15分钟。AFM使用JPK Nanowizard® 3 BioScience AFM在过滤后的dPBS中室温进行。使用Quantitative Imaging™模式扫描组织。分析使用JPK软件，将力曲线与Hertz模型拟合以获得杨氏模量图。每只动物随机选择2个鲍曼囊进行成像，取平均值用于最终分析。
蛋白提取：从冷冻半脑中制备脑富集血管部分。肠系膜血管蛋白裂解液通过机械去除周围脂肪获得。蛋白提取物通过组织匀浆器在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中制备。
Western blotting使用Mini PROTEAN®电泳系统进行，蛋白转移至硝酸纤维素膜。膜用0.5%丽春红S染色，5%脱脂牛奶或3% BSA封闭，一抗孵育，HRP偶联二抗孵育，化学发光检测。
RT-PCR：动物组织在TRIzol中匀浆，提取RNA，DNase处理，cDNA合成，使用Power Up SYBR green Mastermix进行qRT-PCR。数据以2^-ΔΔCt法分析。
细胞培养：人脑微血管内皮细胞（HBEC-5i）在含ECGS、10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM:F12中培养。实验前细胞在含0.25 mM L-抗坏血酸的培养基中培养72小时。对于在胶原蛋白IV上培养的细胞，先用明胶和50 μg/ml人胶原蛋白IV包被培养皿。
基因组编辑：使用Alt-R® CRISPR crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白混合。使用Lipofectamine CRISPRMAX或TransIT-X2转染试剂将Cas9 RNP和ssODN转染细胞。48小时后重新铺板，通过PCR和限制性内切酶筛选编辑后的细胞系，Sanger测序确认突变。
HiPSC培养与分化：COL4A1G755R、COL4A2G702D和同基因hiPSC系如前所述产生。hiPSC在TeSR™-E8培养基中培养，使用Vitronectin XF作为基质。hiPSC来源的内皮细胞按照先前报道的方案分化，在BMP4、VEGF-A和SB431542等因子作用下，于第10天通过CD34磁珠分选获得。
Ca²⁺测量：细胞用Fluo-4 Direct Calcium Assay Kit加载，37°C孵育60分钟。使用100 μM乙酰胆碱刺激。采用时间序列模式捕获荧光图像，使用CALIMA Calcium Imaging Tool分析图像。hiPSC-EC用Fluo4AM预加载，在共聚焦显微镜下监测细胞内钙离子流。
全基因组测序：对两只Col4a2+/em2Wtsi小鼠进行全基因组测序。读数与小鼠基因组GRCm38比对，使用GATK进行变异发现。
患者队列：我们选取了UK MRC脑库和LINCHPIN研究中的死后石蜡包埋人脑样本。随机选取CSVD评分≥2且不含罕见COL4A1/COL4A2变异的样本，并选取所有携带罕见COL4A1/COL4A2变异且有脑组织可用的散发性ICH样本。使用ICH和CSVD阴性的样本作为对照。
人脑组织分析：胶原蛋白IV免疫染色如前所述进行。每个患者随机选取5个直径40-150 μm的小动脉，在Nikon Eclipse TS2R显微镜下成像。计算管腔面积分数和胶原蛋白IV阳性面积分数。使用ImageJ软件盲法分析图像。
统计分析使用GraphPad Prism软件进行。正态性检验采用Shapiro-Wilk检验。使用Welch's t检验、非配对t检验或Mann-Whitney U检验比较均值，多组比较使用Welch's ANOVA及事后检验。剂量反应曲线采用曲线下面积及事后检验分析。非正态分布数据使用Kruskal Wallis检验及Bonferroni校正的Mann-Whitney事后检验。表型存在/缺失比较使用Fisher精确检验。p值小于0.05视为具有统计学显著性。
资助者角色：资助者在研究设计、数据收集、数据分析、解读或报告撰写中未发挥作用。
结果
Col4a1甘氨酸突变增加CSVD伴ICH中的血管舒张
我们着手通过评估Gould综合征小鼠模型Col4a1+/SVC的小肠系膜动脉血管功能来研究CSVD机制。该模型携带杂合Col4a1错义突变（G1064D），该突变替换了α1α1α2(IV)胶原结构域中的甘氨酸残基为天冬氨酸。该突变代表了约60%的Gould综合征突变。我们分析了3个月龄的Col4a1+/SVC小鼠，该年龄小鼠出现CSVD伴ICH，结果显示对去甲肾上腺素的敏感性和加压反应降低（图1a, b, 补充图S1a）。我们将这些变化归因于基础NO生成增加的血管舒张效应，因为Col4a1+/SVC血管在NOS抑制剂L-NAME诱导下显示增强的血管收缩（图1c, 补充图S1b）。这些变化因对NO的反应性增加（对NO供体硝普钠（SNP）的反应）而加剧（图1d）。为了解析Col4a1甘氨酸突变对血管舒张的影响，我们研究了NO-cGMP、前列环素和EDH介导的通路。令人惊讶的是，对卡巴胆碱的剂量反应曲线显示Col4a1+/SVC小鼠血管舒张增强（图1e, 补充图S1c），而L-NAME抑制NO合成后，NO-cGMP通路的相对贡献降低（图1e），尽管血管对NO的反应性和基础NO水平增加。这些数据表明前列环素和/或EDH介导的血管舒张激活增强，但未检测到前列环素介导的血管舒张差异（补充图S1d）。然而，Col4a1+/SVC血管经apamin、TRAM-34（分别抑制小和中KCa [SKCa, IKCa]）和L-NAME预处理后，与仅用L-NAME预处理的WT血管相比，血管舒张程度相似，这确立了CSVD中EDH血管舒张增强（图1f）。这种血管功能障碍和CSVD独立于高血压发生（补充图S1g），而高血压是CSVD的主要风险因素。因此，Col4a1突变通过小和中KCa通道引起失调的NO和增强的EDH血管舒张，揭示了小血管病的新机制。
图1. Col4a1甘氨酸突变导致血管功能障碍。 (a) 与野生型（WT）动脉相比，Col4a1+/SVC对去甲肾上腺素（NA）的收缩减弱。(b) Col4a1+/SVC对KCl的最大反应降低30%。(c) Col4a1+/SVC中基础NO生成增加，表现为L-NAME预处理后动脉对NA的收缩增强。(d) Col4a1+/SVC血管中内皮非依赖性血管舒张增加，表现为对SNP的剂量反应升高。(e) Col4a1+/SVC血管内皮依赖性松弛增强，卡巴胆碱诱导的血管舒张增加。L-NAME预处理表明突变动脉中eNOS介导的血管舒张贡献减少。(f) 经KCa抑制剂apamin和TRAM-34预处理的Col4a1+/SVC血管，内皮依赖性松弛减少约50%。经apamin、TRAM-34和L-NAME预处理的Col4a1+/SVC血管的内皮依赖性血管舒张与仅用L-NAME预处理的WT血管相似，表明突变动脉中EDH血管舒张增强。
降低的胶原蛋白IV水平增加成年期微出血风险
COL4A1/COL4A2的错义突变、罕见编码变异和常见风险等位基因在CSVD伴ICH中的机制尚不清楚。错义突变引起的BM缺陷和内质网应激在携带COL4A1/COL4A2突变的小鼠和患者中均有发生，但它们对COL4相关CSVD机制的相对贡献仍未知，这是一个重要的知识空白。
为了阐明这一点，我们获得了Col4a2杂合敲除小鼠（Col4a2+/em2Wtsi），该小鼠通过CRISPR缺失了外显子18。我们确认了Col4a2缺失且不存在其他编码变异（补充图S2a, b）。杂合Col4a2+/em2Wtsi小鼠在断奶时显示正常孟德尔比率和体重，并且Col4a2 mRNA和蛋白水平降低（图2a-d, 补充图S2c-g）。Col4a1 mRNA水平并不总是与Col4a2水平相关（图2b; 补充图S2h-j），表明尽管它们共享启动子，但至少在一定程度上是独立调控的。在Col4a2+/em2Wtsi的脑血管或肾脏中未检测到内质网应激（补充图S2k-o），确立了任何表型都是由胶原蛋白IV水平降低引起的，这导致BM增厚和分裂（图2e, f; 补充图S3a-d），并通过原子力显微镜揭示BM硬度降低（图2g, h, 补充图S3e）。原子力显微镜在鲍曼囊的BM上进行，因为它含有与血管BM相似的α1α1α2(IV)，且血管腔靠近BM妨碍了测量。因此，Col4a2+/em2Wtsi小鼠可用于确定由胶原蛋白IV水平降低引起的BM缺陷如何导致疾病。
图2. Col4a2+/em2Wtsi小鼠的基底膜缺陷。 (a) 6个月龄Col4a2+/em2Wtsi小鼠脑血管中Col4a2 mRNA水平降低。(b) 6个月龄Col4a2+/em2Wtsi小鼠肠系膜动脉中Col4a1和Col4a2 mRNA水平降低。(c) 野生型（WT）和Col4a2+/em2Wtsi（4a2）小鼠主动脉中α2(IV)免疫染色（红色）。(d) 染色定量。(e) 肾脏鲍曼囊BM中的多链形成。(f) Col4a2+/em2Wtsi鲍曼囊BM厚度增加。(g) WT和Col4a2+/em2Wtsi鲍曼囊BM硬度的原子力显微镜图像。(h) Col4a2+/em2Wtsi中BM硬度降低。(i) 50%的Col4a2+/em2Wtsi中出现阳性含铁血黄素染色。(j) Col4a2+/em2Wtsi中的色素沉积。(k) Col4a2+/em2Wtsi中的含铁血黄素阳性染色（蓝色）。
携带Col4a1错义突变的小鼠在3个月龄时出现前段发育不全、肾脏缺陷和脑血管疾病。相反，14个月龄的Col4a2+/em2Wtsi小鼠未显示明显的前段发育不全迹象（补充图S4m）。在肾脏中，观察到毛细血管簇回缩和鲍曼囊增厚，伴轻度多尿和多饮，但无肾积水、髓质萎缩或纤维化（补充图S4a-l）。这表明与Col4a1错义突变相比，发病更晚，疾病更轻，与携带Col4a2错义突变的小鼠一致。14个月龄的Col4a2+/em2Wtsi小鼠中有一半（3/6）出现微出血，这是CSVD的表现，通过含铁血黄素染色显示（图2i-k, 补充图S4n）。每只Col4a2+/em2Wtsi小鼠（6/6, p=0.0022, Fisher精确检验）的血管壁或伴随含铁血黄素染色处均观察到棕黄色色素沉积（图2j, k），表明这反映了脂褐素或蜡样质和/或完整的红细胞。因此，降低的胶原蛋白IV水平增加了晚发性ICH和肾脏疾病的风险，并提示COL4A2中常见风险等位基因通过降低胶原蛋白IV水平在散发性成年期CSVD伴ICH中发挥作用。
由胶原蛋白IV水平降低引起的BM缺陷是血管功能障碍的基础
为了研究Col4a1甘氨酸突变是否通过降低胶原蛋白IV水平引起内皮功能障碍，我们研究了3个月龄Col4a2+/em2Wtsi小鼠的血管功能。结果显示，在无高血压的情况下，NO介导的血管舒张增加，而血管收缩或内皮非依赖性血管舒张未改变（图3a, 补充图S4o-r, 5a-d）。血管功能障碍随年龄增长而进展，与Col4a1+/SVC相似，6个月龄的Col4a2+/em2Wtsi小鼠具有由小和中KCa通道介导的增强EDH血管舒张，以及NO血管舒张贡献减少（图3b, c, 补充图S5e-h）。
图3. 胶原蛋白IV水平降低导致的血管缺陷。 (a) 3个月龄野生型（WT）和Col4a2+/em2Wtsi（Col4a2+/−）小鼠肠系膜动脉在有无NOS抑制剂L-NAME存在下对卡巴胆碱的剂量反应曲线。(b) 6个月龄小鼠在有无L-NAME存在下对卡巴胆碱的剂量反应曲线，显示Col4a2+/em2Wtsi中NO依赖性和非依赖性血管舒张增加。(c) 在L-NAME、小和中KCa通道阻滞剂apamin和TRAM-34存在下对卡巴胆碱的剂量反应曲线，显示6个月龄Col4a2+/em2Wtsi中的EDH血管舒张。(d) 3个月龄Col4a1+/SVC在L-NAME、apamin和TRAM-34（KCa抑制剂）及哇巴因（Na+/K+泵抑制剂）存在下对卡巴胆碱的剂量反应曲线，揭示EDH由Na+/K+泵介导。(e) 6个月龄Col4a2+/em2Wtsi在L-NAME、apamin和TRAM-34及哇巴因存在下对卡巴胆碱的剂量反应曲线。(f) 6个月龄WT和Col4a2+/em2Wtsi（Col4a2+/−）肠系膜动脉中中KCa通道（KCNN4）蛋白水平增加。(g) 3个月龄Col4a1+/SVC小鼠肠系膜动脉在一系列压力下外径增加。(h) 3个月龄野生型（WT）和Col4a1+/SVC小鼠肠系膜动脉内径。(i) 3个月龄Col4a1+/SVC小鼠动脉壁厚度增加。(j) 3个月龄Col4a1+/SVC小鼠横截面积增加。(k) 应力-应变曲线
(续前文)
胶原蛋白IV变异影响CSVD中的血管生物力学
血管功能障碍可导致血管重塑，这在CSVD中表现为血管壁增厚和硬度增加。血管重塑主要受血流和组织作用于内皮细胞和VSMC的机械力调节。因此，为了提供CSVD的机制性见解，我们确定了胶原蛋白IV突变对血管结构、重塑和生物力学的影响。压力肌动描记术显示，3个月龄Col4a1+/SVC小鼠的外径和壁厚增大（图3g, h），壁腔比和横截面积增加（图3i, j），表明壁增厚和肥厚性重塑。血管重塑和生物力学特性密切相关，其中ECM和VSMC发挥关键作用，而硬度增加与CSVD相关。因此，我们通过确定在给定应力下的应变（血管扩张程度）和血管壁上的应力来研究生物力学特性。这揭示3个月龄Col4a1+/SVC小鼠的血管硬度显著降低（图3k），应变显著增加（最高压力下约30%），显示Col4a1+/SVC血管变形更大，但壁应力总体无差异（补充图S1e, f）。6个月龄Col4a2+/em2Wtsi小鼠显示，降低的胶原蛋白IV水平降低了血管硬度（图3l, 补充图S5m, n），但我们未能检测到壁厚、直径或肥厚性重塑的改变（补充图S5j-l）。这可能反映了疾病阶段的差异，即Col4a2+/em2Wtsi小鼠的壁增厚尚未发展，和/或Col4a1甘氨酸突变机制的多样性。这些数据确立了胶原蛋白IV在维持血管硬度中的作用，CSVD涉及通过降低胶原蛋白IV水平导致的血管生物力学缺陷（血管硬度降低）以及导致壁增厚的肥厚性重塑。
内皮细胞中钙离子信号增加
内皮细胞钙信号对于NO和EDH血管舒张至关重要，eNOS和KCa通道的激活依赖于Ca²⁺内流。因此，内皮细胞钙水平改变可能是Col4a1突变激活这些通路的机制。我们通过CRISPR将导致Gould综合征的杂合COL4A1 G755R突变引入人脑微血管内皮细胞系（HBEC）（补充图S7a-c），以测量基础和乙酰胆碱刺激下的Ca²⁺水平。结果显示，基础和乙酰胆碱刺激下的胞质钙离子水平显著升高（图4a, b）。我们还使用来自Gould综合征患者的iPSC来源的脑内皮细胞（携带COL4A1G755R和COL4A2G702D突变）证实了这一点（图4c-f）。为了探究细胞外胶原蛋白IV水平与基础胞质钙水平之间的联系，我们使用CRISPR创建了携带COL4A2外显子18杂合缺失的HBEC（补充图S7），与Col4a2+/em2Wtsi小鼠等效，发现这些细胞的基础钙水平升高（图4g）。此外，在胶原蛋白IV包被的孔板上培养COL4A1+/G755R HBEC，作为增加细胞外胶原蛋白IV水平的模型，改善了钙水平（图4h）。这些数据确立了胶原蛋白IV突变导致内皮细胞胞内钙水平升高，且胶原蛋白IV水平代表一个治疗靶点。
图4. COL4A1/COL4A2变异增加脑内皮细胞中的Ca²⁺水平。 (a) 携带COL4A1突变的人脑微血管内皮细胞系（HBEC）中基础及乙酰胆碱刺激后的胞内钙水平升高。(b) COL4A1突变细胞中胞内Ca²⁺浓度的定量。(c) 人iPSC来源的脑内皮细胞中胞内Ca²⁺水平，显示携带COL4A1 G755R突变的细胞对乙酰胆碱的反应增强。(d) 突变hiPSC来源的脑内皮细胞中峰值平均值升高。(e) COL4A2突变（G702D）和同基因对照人iPSC来源的脑内皮细胞中胞内Ca²⁺水平。(f) COL4A2 G702D突变hiPSC来源的脑内皮细胞中胞内Ca²⁺水平峰值平均值。(g) COL4A2+/- HBEC细胞系和WT中的基础胞内Ca²⁺水平。(h) 通过胶原蛋白IV包被孔板增加细胞外胶原蛋白IV水平对COL4A1WT/G755R HBEC细胞基础胞内Ca²⁺水平的影响。(i) 6个月龄Col4a2+/-小鼠肠系膜中肌球蛋白轻链激酶（MLK）、总肌球蛋白轻链（MLC）和磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）的Western blot。(j) Col4a2+/-小鼠肠系膜中磷酸化MLC与总MLC的比值增加。
为了确定胶原蛋白IV突变是否诱导内皮细胞中更“合成”的表型并导致ECM产生增加，我们对COL4A1+/G755R细胞系进行了RT-PCR（补充图S7d），并分析了iPSC来源模型的转录组数据集。这未发现这些细胞向合成表型转化的证据。
肌球蛋白轻链磷酸化（MLC）是Ca²⁺依赖性的，6个月龄Col4a2+/em2Wtsi小鼠肠系膜中磷酸化MLC与总MLC的比值增加（图4i, j, 补充图S8），为胶原蛋白IV水平降低引起的Ca²⁺信号增强提供了体内支持。波形蛋白、αSMA和总MLC水平未改变，表明VSMC数量没有增加，并提供了在血管舒张增强的情况下VSMC处于收缩状态的证据（补充图S8）。这表明功能性VSMC缺陷是胶原蛋白IV相关CSVD的一部分。
散发性CSVD伴ICH中COL4A1/COL4A2变异的基因型依赖性机制
COL4A2中的常见非编码变异是CSVD和ICH的遗传风险等位基因，风险等位基因存在于约65%的人群中。我们之前对LINCHPIN队列中散发性CSVD伴ICH患者的COL4A1/COL4A2序列分析也识别出这些患者中的罕见编码COL4A1/COL4A2变异。为了阐明常见非编码COL4A2变异的作用，我们检测了随机选择的、无罕见编码COL4A1/COL4A2变异患者以及无ICH或CSVD对照的脑组织（补充表S1）。这些患者没有其他导致ICH的原因（如大血管原因、肿瘤等），因此CSVD是唯一的病理基础。基底节区域的免疫染色显示，小脑动脉壁增厚且胶原蛋白IV水平降低（图5a-c），支持我们的Col4a2+/em2Wtsi小鼠数据，并表明常见非编码COL4A2风险变异通过降低胶原蛋白IV水平起作用。对携带罕见编码COL4A1/COL4A2变异患者脑组织的分析（补充表S1）也显示壁增厚（图5a-c）。在散发性晚发性CSVD伴ICH中未发现甘氨酸突变（相当于Col4a1+/SVC突变，Gould综合征早发性CSVD的主要原因）。耐人寻味的是，携带罕见编码变异的患者脑血管的胶原蛋白IV水平与对照组相似。这提供了证据，表明在晚发性散发性CSVD中，编码变异不影响胶原蛋白IV分泌，这与早发性家族性Gould综合征中的COL4A1/COL4A2突变不同。相反，它支持它们通过分泌变异型胶原蛋白IV起作用，该变异蛋白随后也导致血管壁增厚。这支持COL4A1/2的常见非编码和罕见编码变异在CSVD中具有基因型依赖性机制，即降低的细胞外胶原蛋白IV水平和突变蛋白的分泌汇聚于血管壁增厚，为CSVD的基因型-表型相关性提供了见解。
图5. 人散发性CSVD中的胶原蛋白IV水平和壁厚。 (a) 来自非ICH非CSVD对照、无罕见编码COL4A1/2变异的散发性CSVD伴ICH（CSVD）以及携带罕见COL4A1/2变异的散发性CSVD伴ICH（COL4-ICH）患者脑组织的胶原蛋白IV免疫染色。(b) 散发性CSVD（无罕见COL4变异）和COL4-ICH（携带罕见COL4变异）中的血管壁增厚。(c) 胶原蛋白IV染色定量显示散发性CSVD（无罕见COL4变异）中血管壁胶原蛋白IV水平降低。
讨论
在此，我们确立了CSVD伴ICH的一种机制，即胶原蛋白IV变异影响内皮细胞介导的小血管功能和结构，揭示了胶原蛋白IV在内皮依赖性血管舒张中的作用。在小鼠中，CSVD在无高血压的情况下发生，直接支持了新兴观点，即至少某些心血管风险因素对CSVD发展的机制性作用可能更有限。胶原蛋白IV变异通过降低细胞外胶原蛋白IV水平，导致内皮细胞钙水平升高以及VSMC的收缩状态，从而引起EDH介导的血管舒张增强。这导致血管肥厚性重塑，生物力学改变，硬度降低（图6）。内皮功能障碍发生在疾病早期阶段，在老年Col4a2+/em2Wtsi小鼠中比ICH早8个月，因此证实了它是CSVD的初始驱动因素。我们的数据为CSVD这个理解不足但至关重要的方面提供了新见解，该方面迄今为止最常与脑低灌注和血管舒张减弱相关联。我们推测，这种增强的舒张可能在更进展的CSVD中发展为灌注减少，为血流与CSVD之间的复杂关系提供了见解。然而，由于我们研究的是小外周血管，现在确定这些机制是否在脑血管中保守至关重要。
图6. COL4A1/COL4A2变异在CSVD中的机制。 图示概述了CSVD的总体机制，即由于胶原蛋白IV水平降低导致的基底膜（BM）缺陷增加了胞内钙水平，导致通过KCa通道和Na/K泵介导的EDH血管舒张增强的内皮细胞介导的血管舒张。此外，BM缺陷也可能由突变蛋白分泌引起，两者都与CSVD中独立于高血压的血管壁增厚相关联。
机制上，增强的血管舒张是由于BM缺陷，胶原蛋白IV水平降低导致内皮细胞Ca²⁺水平升高（图4a-f），进而导致KCa通道开放（与中K通道水平增加相关）和VSMC上Na⁺/K⁺泵活性增强。基质缺陷与Ca²⁺水平增强之间的分子联系尚不清楚，但可能涉及整合素信号改变，我们在携带COL4A2突变的患者细胞中观察到了这一点。虽然我们的数据排除了因蛋白错误折叠引起的明显内质网应激，但不能排除内质网作为钙库在此过程中的作用。增强的血管舒张伴随着血管重塑，壁增厚和VSMC潜在的收缩状态，而非VSMC数量增加，这可能是代偿性反应。这得到了在ICH中，脑血管中平滑肌细胞覆盖减少，而肌肉化增加段上游的支持。这种耗竭和预测的血管壁减弱已被提出作为该部位出血的机制，因为在Col4a1突变小鼠中，小动脉无法承受肌肉增生上游更高的血管内压力。
COL4A1/COL4A2的错义突变导致COL4A1（Gould）综合征中的早发性CSVD伴ICH，而罕见错义变异和常见非编码变异也已作为风险因素出现。然而，这些不同类型变异在CSVD中的上游分子损伤，以及由此产生的基因型-表型相关性的基础和存在性，仍然不清楚。迄今为止，作为上游分子损伤，已提出细胞外胶原蛋白IV缺乏、突变蛋白分泌以及因错误折叠蛋白胞内滞留引起的蛋白毒性应激。在小鼠中，我们和其他人先前的工作表明，Col4a1错义突变（包括Col4a1+/SVC突变）导致多个组织中细胞外胶原蛋白IV水平降低，但分泌突变蛋白和水平降低对不同表型的相对贡献仍知之甚少，并且可能受突变和/或组织和细胞类型的影响。我们此处的数据确立了，降低的细胞外胶原蛋白IV水平可在散发性和遗传性CSVD中引起内皮功能障碍和晚发性CSVD伴ICH。这得到了近期观察性分析的支持，该分析表明胶原蛋白IV水平与CSVD严重程度负相关。我们的数据显示，在携带罕见假定致病性变异的患者组织中，胶原蛋白IV水平无差异，这也提供了证据，表明突变胶原蛋白IV的分泌是导致散发性晚发性CSVD伴ICH中血管壁增厚的第二种机制。这支持了等位基因特异性机制，这些机制汇聚于肥厚性重塑。与散发性CSVD相比，Col4a1+/SVC小鼠和Gould综合征的发病年龄更早、CSVD严重程度更高，这可能是由于蛋白毒性应激（如我们之前对携带COL4A2突变患者分析所支持的，以及小鼠中ICH严重程度与胶原蛋白IV内质网滞留水平的相关性），和/或甚至更低的细胞外胶原蛋白IV水平。综合来看，这些数据为CSVD中的基因型-表型关系提供了见解。然而，我们研究的一个局限性是人体队列的样本量，这使我们无法考虑已知的CSVD风险因素（如血压或糖尿病）等混杂因素。
总之，我们的研究结果表明了BM和胶原蛋白IV在血管功能中的作用，以及CSVD的一种机制，即由胶原蛋白IV水平降低驱动的血管重塑和增强的EDH血管舒张，独立于
（续前文）高血压。这显著增加了我们对CSVD机制的理解，并提示EDH和胶原蛋白IV水平可作为治疗靶点。
贡献者
SM、YYS、EB、GH、AA、AG、MC、ML、CG、YL、AK、CT进行了实验，YT提供了胶原蛋白IV抗体，KEK、MSS、WF、NB、TVA监督了研究工作。HM、MA、CV、CS和RA-SS提供了患者数据和组织。SM、YYS、EB、CT、AG、GH、MC、KEK、AA、MSS、AHH、JDM和TVA进行了数据分析。SM、NB和TVA提出了项目构思和概念。所有作者均协助撰写稿件。SM、CT和TVA进行了数据获取和验证。CDA和TVA筹集了资金。所有作者均已阅读并批准最终稿件。
数据共享声明
研究收集的数据和样本分析数据将在合理要求下提供给通讯作者。
利益冲突声明
CDA报告了来自美国心脏协会和拜耳公司在本研究范围之外的研究资助，以及与ApoPharma的咨询。RA-SS报告了来自BHF、苏格兰政府首席科学家办公室和国家健康研究所健康技术评估计划支付给爱丁堡大学的资助，来自Recursion Pharmaceuticals支付给大学的咨询收入，以及来自NovoNordisk支付给爱丁堡大学的终点裁定报销。TVA报告其在DEBRA UK的资助委员会任职，并曾担任英国基质生物学学会荣誉财务主管（2016-2022）。
致谢
我们感谢爱丁堡基因组学进行基因组测序。图6使用Biorender生成。感谢英国心脏基金会（BHF）对SJM的学生奖学金（FS/15/64/32035）；BHF（PG/15/92/31813）、英国医学研究理事会（MRC）（MR/R005567/1）、卒中协会（16VAD_04）和英国心脏研究（RG 2664/17/20）对TVA的资助；英国MRC对RA-SS的LINCHPIN研究奖学金（G0900428和G1002605）；Wellcome Trust对NJB的资助（103720）；Wellcome Trust对KEK的资助（110126/Z/15/Z, 203128/Z/16/Z）；英国MRC对MC的资助（MR/S005412/1）；以及NIH-NINDS对CDA的资助（R01NS103924）。
附录A 补充数据
Supplemental Figs. S1–S9 and Tables S1 and S2
Western Blots
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