摘要
目的
已有报道称硒具有抗癌特性和在化疗中的细胞保护作用。然而，硒对晚期乳腺癌化疗的联合效应尚未明确界定。本研究旨在探讨硒与多西紫杉醇联合应用于乳腺癌细胞系化疗的联合效应。
方法
在贴壁培养条件下，用500皮摩尔多西紫杉醇和100纳摩尔、1微摩尔或10微摩尔硒处理两种乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7。评估各处理组72小时后的细胞生长变化、细胞周期持续时间和凋亡程度。
结果
在MDA-MB-231细胞中，联合治疗组（500皮摩尔多西紫杉醇加10微摩尔硒）与单独多西紫杉醇治疗组相比，细胞生长百分比显著降低（15% vs. 28%；P = 0.004），晚期凋亡百分比显著增加（63% vs. 26%；P = 0.001），G2/M期细胞周期阻滞增加（P = 0.001）。等效图分析证实了MDA-MB-231细胞中联合治疗的协同效应。然而，在MCF-7细胞中，联合治疗组与单独多西紫杉醇治疗组在细胞生长凋亡百分比、凋亡百分比和细胞周期阻滞模式方面无显著差异。
结论
我们的体外研究表明，硒与多西紫杉醇的联合应用通过凋亡和G2/M期细胞阻滞抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的细胞增殖。
关键词：乳腺肿瘤，硒，多西紫杉醇，联合药物治疗
引言
乳腺癌是最常见的侵袭性癌症，也是女性死亡的第二大原因。乳腺癌通常采用手术治疗，对于晚期癌症病例，随后可能进行化疗、免疫治疗或放疗，或两者兼施[1,2]。转移性乳腺癌是最严重且无法治愈的疾病，中位总生存期为2-3年[3]。对于晚期乳腺癌患者，通常建议对激素受体阴性肿瘤、管腔亚型的内分泌耐药疾病和快速增殖性疾病进行化疗[4,5]。一般来说，使用环磷酰胺和阿霉素进行化疗，有时会添加紫杉烷类药物如多西紫杉醇[5,6]。
多西紫杉醇是一种抗有丝分裂化疗药物，用于治疗局部晚期或转移性乳腺癌且蒽环类化疗失败的患者[5,6,7]。多西紫杉醇通过促进微管蛋白聚合和稳定微管组装来发挥细胞毒性，同时防止生理性微管解聚[4]。这种作用显著减少了微管形成所需的游离微管蛋白，并抑制了中期和后期之间的有丝分裂细胞分裂，从而防止进一步的细胞后代。临床上，多西紫杉醇可能抑制乳腺癌细胞的增殖，但该药物对正常细胞会产生多种不良反应[8]。
硒作为人体健康必需的微量元素而广为人知[9]，最近被视为一种有效的营养抗癌元素。在乳腺癌中，各种生态学研究和病例对照研究发现硒水平与癌症风险和死亡率之间存在逆相关关系[10,11]。一项实验研究表明，硒的给药在体外环境中降低了乳腺癌细胞的生长率[12]。给予0.8-微克/克体重的硒与乳腺癌细胞生长率降低80%-93%相关，且对宿主无明显不良影响[12]。
一些癌症患者在放疗和化疗后会经历多种不良反应，还会因人体内氧化正常细胞损伤的细胞过程而发展为慢性淋巴水肿[13]。最近，硒被建议作为对抗化疗和放疗相关副作用以及对淋巴水肿影响的替代疗法[14,15,16,17,18,19]。
考虑到硒的抗癌特性和控制化疗引起的副作用和淋巴水肿的额外潜力，硒补充可能对接受化疗的晚期乳腺癌患者有益。然而，硒在晚期乳腺癌化疗中的联合效应尚未明确界定。
因此，我们假设在晚期乳腺癌的传统多西紫杉醇化疗的实验环境中，硒的联合治疗可能有利于抑制乳腺癌细胞生长。本研究的目的是比较硒与多西紫杉醇在乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中的联合效应与单独化疗的效果。
方法
细胞培养
两个人类乳腺癌细胞系（MDA-MB-231和MCF-7）从美国类型细胞培养物收集中心（ATCC，贝塞斯达，马里兰州，美国）获得。实验细胞在组织培养皿（编号：353003，Falcon，圣何塞，加利福尼亚州，美国）中用含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）培养。培养的细胞（5 × 10^5）在含5% CO2的潮湿大气中于37℃生长。
治疗后细胞生长评估
对于每个细胞系，将5 × 10^5个细胞接种在含10% FBS的DMEM中。24小时后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞并在新鲜培养基中培养。首先，确定500皮摩尔作为MDA-MB-231和MCF-7细胞72小时的治疗性多西紫杉醇剂量。其次，在评估硒联合治疗效果之前，将100纳摩尔、1微摩尔或10微摩尔的硒添加到MDA-MB-231和MCF-7细胞中72小时，以确认不同浓度下硒对细胞增殖和存活的独立作用。第二，将单独500皮摩尔多西紫杉醇（DT 500皮摩尔）、500皮摩尔多西紫杉醇加100纳摩尔、1微摩尔或10微摩尔硒（DT 500皮摩尔 + SN 100纳摩尔；DT 500皮摩尔 + SN 1微摩尔；DT 500皮摩尔 + SN 10微摩尔）添加到MDA-MB-231和MCF-7细胞中72小时。然后，在用0.4%台盼蓝染料孵育后，使用血细胞计数板在Neubauer计数室中对细胞进行定量。所有测量均进行三次，每次实验至少重复三次。
使用等效图分析评估联合药物效应
传统上，等效图分析被用作识别多种药物联合效应的方法，包括相加、协同或拮抗效应。由于硒和多西紫杉醇的组合使用了非恒定剂量比，因此使用CompuSyn ver. 1.0（ComboSyn Inc.，Paramus，新泽西州，美国）自动构建了两种药物在其ED50处的标准化等效图。根据组合数据点在标准化等效图中的位置，指示相加效应（如果点落在斜边上）、协同效应（如果点落在左下）或拮抗效应（如果点落在右上）。组合指数（CI）提供了一种使用中位效应图分析来分析联合效应的方法。CI值<1.0、=1.0和>1.0分别表示协同、相加和拮抗效应。
使用Annexin V染色进行凋亡分析
根据制造商的协议（Pharmingen，BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州，美国）进行Annexin V染色。使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸获得单细胞悬液。离心处理后的细胞系后，用冷PBS洗涤细胞两次，并以1 × 10^6个细胞/mL的浓度重悬于结合缓冲液（10毫摩尔HEPES，pH 7.4，150毫摩尔NaCl，5毫摩尔KCl，1毫摩尔MgCl2和1.8毫摩尔CaCl2）中。将含有1 × 10^5个细胞的溶液100微升转移到5毫升培养管中，并向每管中加入5微升Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（PI）。涡旋管后，细胞在室温（25℃）下避光孵育15分钟，并向每管中加入400微升结合缓冲液。在1小时内使用FACSCalibur系统（BD Biosciences）进行流式细胞术。
细胞周期分析
两种癌细胞系的生长可能因细胞周期阻滞而受到抑制，我们通过分析不同细胞周期阶段的细胞比例来确定生长抑制是否是由于细胞周期阻滞造成的。每组处理72小时后，收获细胞，在70%乙醇中固定1小时，并用PBS洗涤。然后，细胞在37℃下用100微克/毫升的RNase A处理1小时，并用10微克/毫升的PI染色。每次实验使用FACSCalibur系统进行三次流式细胞术。
统计分析
所有数据均来自至少三次重复实验。使用Student t检验比较处理细胞和对照细胞的结果。为比较正态分布的连续变量，使用单向方差分析检验。为比较非正态分布的连续变量，使用Kruskal-Wallis检验。使用卡方检验比较名义变量。使用SPSS ver. 17.0（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）分析数据。双侧P值小于0.05被认为具有统计学意义。
结果
多西紫杉醇和硒联合治疗后MDA-MB-231和MCF-7细胞系的细胞生长
在单独硒治疗模型中，MDA-MB-231细胞系（P = 0.824）和MCF-7细胞系（P = 0.453）中对照细胞和用100纳摩尔、1微摩尔或10微摩尔硒处理的细胞之间在细胞生长方面无显著差异。在DT 500皮摩尔 + SN联合治疗模型中，与DT 500皮摩尔相比，MDA-MB 231细胞系中DT 500皮摩尔 + SN 10微摩尔组的细胞生长显著降低（15% vs. 28%，P = 0.004）。然而，在MCF-7细胞系中，所有DT 500皮摩尔 + SN联合治疗组与单独治疗组相比，细胞生长无显著降低。
MDA-MB-231和MCF-7细胞中多西紫杉醇和硒的联合效应
为MDA-MB-231和MCF-7细胞使用剂量-反应曲线构建标准化等效图。在MDA-MB-231细胞中，当细胞暴露于100微摩尔硒与多西紫杉醇时，通常识别出协同效应。当细胞暴露于其他剂量的硒与多西紫杉醇时，通常识别出相加效应。在MCF-7细胞中，当细胞暴露于硒与多西紫杉醇时，通常识别出相加效应。
多西紫杉醇和硒联合治疗后MDA-MB-231和MCF-7细胞系的凋亡和细胞周期分析
在MDA-MB-231细胞系中，所有联合治疗组的早期凋亡与DT 500皮摩尔组相比无显著差异（13%-15% vs. 18%，P = 0.125）。然而，与DT 500皮摩尔组和其他联合治疗组相比，DT 500皮摩尔 + SN 10微摩尔组的晚期凋亡增加（63% vs. 29%-36%）。细胞周期分析表明，与其它治疗组相比，DT 500皮摩尔 + SN 10微摩尔组中G2/M期细胞周期阻滞显著增加。
在MCF-7细胞系中，与DT 500皮摩尔组相比，所有DT 500皮摩尔 + SN联合治疗组的早期凋亡（6%-8% vs. 6%）和晚期凋亡（21%-25% vs. 17%）无显著差异。细胞周期分析表明，与DT 500皮摩尔组相比，DT 500皮摩尔 + SN联合治疗组中G2/M期细胞周期阻滞略有增加，但在DT 500皮摩尔 + SN联合治疗组之间，G2/M期细胞周期阻滞无显著差异。
讨论
在这项实验研究中，我们研究了硒和基于多西紫杉醇的化疗对两种乳腺癌细胞系（MDA-MB-231和MCF-7）生长抑制的联合效应。我们的研究结果表明，硒对晚期乳腺癌细胞多西紫杉醇化疗的协同效应是细胞系特异性和硒剂量特异性的。与单独多西紫杉醇治疗相比，仅用DT 500皮摩尔 + SN 10微摩尔处理的MDA-MB-231细胞系显示出更高的癌细胞生长抑制。此外，我们发现用DT 500皮摩尔 + SN 10微摩尔处理的MDA-MB-231细胞系中凋亡细胞百分比增加，G2/M期DNA含量增加，这一结果与细胞生长结果一致。然而，在我们的研究中，我们未能观察到硒对MCF-7细胞系中多西紫杉醇治疗的任何协同效应。
临床上，硒可能是一种有吸引力的天然添加剂，用于治疗不易治愈的晚期乳腺癌。硒作为硒蛋白的组成部分和硒代谢物的来源，参与抗氧化反应和氧化还原调节途径[20]。大量实验和临床研究表明，硒补充可降低包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌和肝癌在内的人类癌症的发病率[21,22,23]。硒已被确定为关键的癌症预防元素，并被认为可以减少癌症进展。尽管尚无明确的临床研究，但一些实验室研究表明，硒以剂量依赖性方式抑制乳腺癌细胞生长。
已开发出多种化疗药物用于治疗晚期乳腺癌患者。多西紫杉醇通常被接受为先前化疗失败的晚期乳腺癌患者的化疗药物[5]，但其临床疗效可能因严重的多西紫杉醇相关副作用（如严重中性粒细胞减少症、液体潴留、脱发、指甲变化和过敏反应）而受损[8]。控制与多西紫杉醇治疗相关的副作用可能会改善化疗患者的生存质量和临床结果。化疗的不良反应与正常人体细胞中自由基增加和相关氧化损伤有关[24]。最近，硒化合物被建议作为预防化疗相关副作用的毒性拮抗剂。一些动物研究表明，亚硒酸钠可能减少化疗的副作用，如顺铂或阿霉素[15,17,18]。由于手术或放疗对淋巴系统的损伤导致的液体潴留，患者经常在手术和放射治疗后遭受继发性淋巴水肿[13]。硒可能改善稀疏灌注水肿组织中的氧化还原平衡，因此可能是控制和缓解淋巴水肿的有用药物[25]。
考虑到硒可以抑制乳腺癌患者的癌细胞生长，并可以减少化疗的副作用和淋巴水肿，关于使用硒联合治疗的共识可能对这些患者有益。在评估硒联合治疗效果之前，我们首先确定了硒对癌细胞生长的独立作用，逐步增加剂量。因此，本实验排除了对硒加多西紫杉醇联合治疗功效的偏见和混淆。它清楚地验证了硒作为多西紫杉醇化疗添加剂的剂量依赖性功效。考虑到仅10微摩尔的硒就能显著降低MDA-MB-231细胞系的细胞生长，硒的联合效应被认为是剂量依赖性的，并针对特定细胞系，即MDA-MB细胞系。使用Annexin V-FITC染色进行的凋亡分析显示，10微摩尔硒联合治疗中细胞凋亡高度集中，显著抑制了MDA-MB-231细胞。这些结果与我们的细胞分析数据一致，后者表明联合治疗组中G2/M周期的阻滞增加。
在本研究中，我们无法阐明硒与多西紫杉醇化疗联合的确切机制。硒可能作用于癌症进展的机制尚不清楚；然而，凋亡和程序性细胞死亡已被假定为硒化合物抑制癌症生长的主要机制[26]。少数研究表明，硒通过线粒体介导的凋亡和G1细胞周期阻滞抑制人类乳腺癌细胞的生长[20,27]。硒诱导的G1期阻滞与细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3、CDK4和CKD6表达水平降低以及p15 INK4B、p21 Waf1/Cip1和p53表达水平增加相关[28]。
本研究的一个有趣发现是，仅雌激素受体阴性的MDA-MB-231细胞显示出硒与多西紫杉醇联合治疗的显著协同效应。大多数乳腺癌患者是女性，雌激素与乳腺癌细胞生长密切相关。雌激素被认为负责调节硒结合蛋白的表达，这会在硒治疗期间诱导抑制癌细胞增殖[29]。在先前的体内和体外研究中，硒在雌激素受体阳性的MCF-7细胞中诱导了更大的细胞死亡和凋亡，但在雌激素阴性的MDA-MB-231细胞中则不然[29,30]。在雌激素受体阳性的MCF-7细胞中，生长抑制的机制被认为通过破坏雌激素信号传导而发生[30]。然而，当与多西紫杉醇联合用于联合化疗模型时，硒似乎对癌细胞的作用不同。在多西紫杉醇化疗与硒的联合模型中，硒对细胞死亡的协同效应在雌激素受体阳性的MCF-7细胞中未观察到，但在雌激素阴性的MDA-MB-231细胞中观察到。通过破坏雌激素信号传导导致细胞死亡的机制似乎不能解释我们的研究结果。多西紫杉醇的细胞毒性作用主要通过抑制有丝分裂纺锤体组装来阻断有丝分裂，当与多西紫杉醇联合给药时，硒可能有助于在MDA-MB-231细胞中诱导这种抗有丝分裂反应，而不是通过自身直接抑制细胞生长。然而，尚不清楚为什么硒在联合多西紫杉醇治疗中的协同效应在雌激素受体阴性的MDA-MB-231和雌激素受体阳性的MCF-7细胞之间存在差异。癌症的不同激素特征可能与硒对多西紫杉醇作用的协同效应密切相关，但我们无法提供进一步的解释。需要进一步研究来探索和理解这些差异。
结论
总之，我们发现硒与多西紫杉醇的联合治疗通过凋亡和G2/M期细胞阻滞抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的细胞增殖。与硒联合的化疗可能对某些晚期乳腺癌病例的治疗有益。需要进一步研究以阐明乳腺癌细胞联合治疗中生长抑制的分子机制。
致谢
本工作得到了Konkuk大学的支持。
备注
未报告与本文相关的潜在利益冲突。
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