核酸治疗的优雅性受制于物流复杂性
传统生物制剂是静态的；一旦开发完成，其结构和作用机制就固定不变。相比之下，核酸治疗具有内在的可编程性——使曾经被认为不可能的治疗方法变得可行。
将RNA或DNA用作治疗手段的吸引力来自于核酸本身的特性，它可以根据核酸类型和核苷酸序列编码多种生物学结果1。为了引发靶向免疫反应，编码抗原的mRNA可作为疫苗发挥作用，而编码抗体的mRNA可模拟适应性免疫反应。为了干预疾病引起的分子机制，siRNA可以沉默致病基因；mRNA可以替代缺失的蛋白质；当向导RNA与编码基因编辑器的mRNA配对时，可以实现靶向基因编辑1。
对核酸设计进行小幅调整可以进一步定制核酸治疗的作用机制，并可提高稳定性、效力和安全性。这使得可以在不改变整体药物产品设计的情况下对药物底物层面进行修改1。例如，修改抗原蛋白的编码序列可以使mRNA疫苗平台适应特定受体或病原体靶标的生物学特性，而不改变整体方法或机制。
然而，核酸治疗的这种可编程性使其特别适合快速应对快速演变的传染病和开发个性化药物。然而，当前核酸治疗的制造和递送模式基于假设大批量生产固定产品的流程，这限制了核酸治疗的固有灵活性，从而减少了其治疗应用2。一种在护理点将与载体无关的预形成囊泡(PFVs)与可定制治疗剂相结合的替代流程，可能有助于核酸治疗实现个性化药物3。
当今核酸治疗是如何制造的？
这类治疗包括高度脆弱且具有生物反应性的核酸载体，它作为治疗剂，以及递送载体，它包裹载体以保护它并促进进入靶细胞。一种常用且临床验证过的核酸治疗递送载体，脂质纳米颗粒(LNPs)，由精确配比的可离子化脂质、结构脂质和空间脂质组成——每种都起着关键作用。这些包括与核酸有效载荷相互作用、包裹和保护它。整体而言，LNP的配方决定了它在制造和给药过程中保持稳定性和纯度的程度，以及细胞递送和摄取的成功率4。对于特殊应用，LNPs可以装饰配体，使其能够实现细胞特异性递送。
当前核酸治疗的制造和运输过程涉及提前将递送载体装载核酸载体。这需要相对较大的批次规模和复杂的程序来维持产品的完整性和稳定性随时间推移2。在这个装载过程中，LNP的脂质成分被组合并溶解在有机溶剂（通常是乙醇）中，并与悬浮在酸性缓冲液中的核酸载体快速混合，自行组装成完全包裹核酸治疗剂的LNPs。然后必须去除乙醇并替换为等渗中性pH缓冲液以稳定装载的LNPs，然后将产品准备好进行冷冻保存，装瓶，冷冻，并通过冷链（通常为-20°C至-80°C）运输2。
在与辉瑞和BioNTech合作开发COMIRNATY™疫苗流程时，我们发现当需要大批量核酸治疗来应对大流行规模的响应时，这种制造模式是合理的4。然而，由此产生的产品需要冷链基础设施，并需要由受过处理冷冻保存产品培训的医院人员接收和管理，这限制了在资源匮乏环境中的疫苗获取。制造模式也是浪费的；随着COVID-19病毒突变，原始疫苗设计的效果减弱，需要每年更新配方。使用更新的mRNA序列重新制造疫苗导致浪费了前一年未使用的疫苗。
在核酸治疗模式最具前景的大多数情况下，提前批量生产是适得其反的，这需要过度生产，从而增加了核酸治疗每剂量的成本。当前生产方法的过度最小批次规模限制了单个、小批量治疗和治疗迭代的经济可行性。同时，将递送载体预先装载核酸载体将治疗修改到给药的时间与制造、释放和运输过程结合在一起，可能需要长达六个月的时间2。
需要能够实现小规模生产和缩短治疗修改与给药之间时间线的流程，以推动快速可编程药物从可能性变为临床现实。
预形成囊泡可解决LNP制造瓶颈
在护理点将PFVs与其核酸载体装载，有可能通过实现核酸载体的小规模生产和缩短平台修改的时间线，解决高度个性化和时间敏感的核酸治疗的许多制造瓶颈。
通过将PFVs与其载体分开制造，可以提前大批量制造PFVs，这一过程类似于正常的LNP生产。然后可以在护理点将PFVs与核酸载体结合，核酸载体可以在更短的时间线内开发，并以适合小规模给药的适当数量开发3。
此外，将PFVs与其核酸载体分开制造和运输，允许采用量身定制的保存和存储技术，这些技术对递送载体的冷链运输和存储的依赖性较低（核酸载体可能仍需要冷链运输和存储）。与预先组装的治疗相比，PFVs可以在更高温度下储存，并以液态形式运输，同时保持稳定性。
临床前证据为临床开发奠定基础
临床前测试表明，PFVs可以在护理点在10-20分钟内与核酸载体组装，无需加热或溶剂。通过优化缓冲液，研究人员观察到对各种载体的封装效率超过90%，包括mRNA、siRNA、自扩增RNA(saRNA)以及1:1比例的mRNA/gRNA混合物。由于LNP和mRNA之间的相互作用时间减少，PFV工艺显示出与传统混合方法相比，减少了不需要的RNA-脂质加合物的形成3。
对传统方法和PFV方法生产的配方进行的物理和化学分析表明，两种工艺的颗粒性质无法区分。这些测量包括粒径和多分散性指数、封装效率、RNA含量、脂质含量和RNA完整性。此外，通过冷冻电镜成像的形态学分析显示等效颗粒，装载mRNA的PFV在液态存储条件（2-8oC）下显示出超过40周的稳定性3。最具说服力的稳定性读数表明，未装载的PFV具有独特的能力，在12个月期间的所有时间点保持封装效率，无论是在非冷冻液态（4oC）还是冷冻保存（-80oC）下储存，同时在各种储存条件下保持胶体稳定性（尺寸不变且多分散性指数低于0.1）3。长期储存的能力表明，核酸治疗的递送载体可以在护理点批量储存，因此治疗给药的时间主要取决于核酸载体的可用性。
在PFV在给药前立即生产的概念验证中，研究人员在不同应用中证明了两种递送方法之间的等效性能：预防性疫苗和系统给药的治疗。对于编码流感血凝素(HA)抗原的mRNA疫苗，传统LNP和PFV之间的功能性抗体反应在统计学上是等效的。对于系统给药的治疗，在递送编码单克隆抗体的mRNA后，也实现了相当的血清抗体表达3。
虽然PFVs尚未应用于临床试验，但迄今为止的临床前证据支持改善可编程药物可行性的长期潜力。正在为快速演变的病原体开发疫苗策略以及正在开发高度个性化和可编程核酸药物的药物开发者，可能会从投资这种新型制造策略中受益。
核酸治疗创新的汇聚
PFV制造方法在时间上与许多其他进步汇聚，这些进步正在扩大核酸药物的可及性和应用。对核酸和疾病生物学的改进理解正在扩展核酸载体的形式和应用1,4。变化是渐进的，但通过汇集多样解决方案和方法的团队合作而加快，以更好地应对人类健康和福祉的持久威胁。
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