未成熟的Acta2 R179C/+平滑肌细胞(SMCs)未能完全分化并保持干细胞样的特性，包括增加迁移和糖酵解通量，与野生型(WT)SMCs相比。增加线粒体呼吸作用使用烟酰胺核苷(NR)不仅降低了糖酵解并增加了Acta2 R179C/+ SMCs的氧化磷酸化(OXPHOS)，还驱动分化并减少迁移。此外，实验表明22%的Acta2 SMC-R179C/+小鼠在左颈动脉结扎(LCAL)手术后死亡，而WT小鼠无死亡，且所有这些表型均可通过NR治疗得以预防。这些数据表明，通过改变细胞代谢来驱动Acta2 R179C/+ SMCs的分化和静止可以减弱Acta2 SMC-R179C/+小鼠中的烟雾病样疾病，突显了未成熟且高度迁移性SMCs在烟雾病(MMD)发病机制中的作用。
【摘要】改变精氨酸179的ACTA2致病变异导致儿童期中风，这是由于类似烟雾病(MMD)的远端颈内动脉(ICA)闭塞引起，但其发病机制尚不清楚且没有预防性治疗方法。本研究表明，Acta2 R179C/+ SMCs未能充分分化并保持干细胞样特征，包括与WT SMCs相比增加的迁移和糖酵解通量。增加线粒体呼吸作用使用烟酰胺核苷(NR)不仅降低糖酵解并增加Acta2 R179C/+ SMCs的氧化磷酸化(OXPHOS)，还驱动分化并减少迁移。此外，实验表明22%的Acta2 SMC-R179C/+小鼠在LCAL手术后死亡，幸存的小鼠表现出神经元细胞丢失和缺氧性脑损伤的证据，同时受伤颈动脉内有MMD样闭塞性病变，而WT小鼠没有任何这些表型，所有这些表型均可通过NR治疗在Acta2 SMC-R179C/+小鼠中得以预防。这些数据表明，通过改变细胞代谢来驱动Acta2 R179C/+ SMCs的分化和静止可以减弱Acta2 SMC-R179C/+小鼠中的MMD样疾病，突显了未成熟且高度迁移性SMCs在MMD发病机制中的作用。
【引言】烟雾病(MMD)是一种常见的儿童中风原因，其特征是远端颈内动脉(ICAs)及其分支的闭塞和代偿性侧支血管形成。MMD的并发症包括脑缺血和出血性中风，其中缺血事件（短暂性脑缺血发作或缺血性梗死）是最常见的表现。远端ICAs在MMD中的分子发病机制尚未明确。动脉闭塞病变的组织学检查提供了一些见解，显示缺乏动脉粥样硬化的特征，如泡沫细胞和胆固醇及钙沉积。相反，动脉腔内充满了对平滑肌细胞(SMC)标记物呈阳性的新生内膜细胞。ACTA2致病变异是MMD的主要风险因素，同时也为MMD的分子病因提供了线索。ACTA2杂合致病变异易患胸主动脉疾病，其中一部分变异还易患类似MMD的疾病。ACTA2在SMCs而非内皮细胞中表达，因此将SMCs与MMD的发病机制联系起来。这些个体的脑血管疾病表现为典型的远端ICA闭塞性病变，以及其他独特特征，包括缺乏侧支血管、近端ICA扩张、脑动脉直化和脑室周围白质高信号。
【结果】Acta2 R179C/+ SMCs具有增加的糖酵解通量。我们证实从升主动脉提取的Acta2 R179C/+ SMCs具有较低水平的SMC分化标志物（平滑肌肌球蛋白重链[SM-MHC]、SMA、转胶蛋白[SM-22α]和钙调蛋白-1），并且迁移和增殖增加，同时SMA细丝形成减少。Seahorse分析显示，与WT SMCs相比，Acta2 R179C/+ SMCs维持更多的干细胞特性，包括增加的细胞外酸化率（ECAR，表示糖酵解）和较低的氧气消耗率（OCR，反映电子传递链活性）。一致地，Acta2 R179C/+ SMCs也产生较少的线粒体活性氧（ROS）。与WT SMCs相比，Acta2 R179C/+ SMCs的MitoTracker Deep Red (MTDR)染色较低，表明线粒体功能或质量减少。此外，来自Acta2 SMC-R179C/+小鼠主动脉的单细胞转录组数据显示，突变型SMC簇显著降低了8种线粒体DNA(mtDNA)编码的电子传递链复合物亚基表达。最后，Seahorse细胞外通量分析确认即使只有67%的SMCs携带突变，Acta2 SMC-R179C/+组织的最大OCR仍低于WT组织。
增强OXPHOS驱动Acta2 R179C/+ SMCs的分化和静止。由于增加OXPHOS能驱动干细胞分化，WT和Acta2 R179C/+ SMCs暴露于NR，一种增加OXPHOS的NAD+前体。Seahorse分析证实NR显著提升OXPHOS，表现为突变型SMCs的基础、ATP相关和最大OCR增加。乳酸测定证实NR暴露也减少了Acta2 R179C/+ SMCs的高厌氧糖酵解活性。NR处理还增加了Acta2 R179C/+ SMCs的分化，表现为SMC收缩标志物水平的增加和迁移的减少。NR处理不影响增殖，也不增加Acta2 R179C/+或WT SMCs的凋亡或坏死。Acta2 R179C/+ SMCs还在含半乳糖没有葡萄糖的培养基中暴露，以及低和高葡萄糖培养基。半乳糖在糖酵解过程中不产生ATP；因此，细胞通过其他能量来源提升OXPHOS。含半乳糖的培养基也增加Acta2 R179C/+ SMCs的OCR。虽然WT SMCs在低葡萄糖培养基中表现出增加的分化标志物，Acta2 R179C/+ SMCs仅在含半乳糖的培养基中表现出分化标志物的增加和迁移减少。
Acta2 R179C/+ SMCs的电子传递链缺陷通过NR逆转。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1-α(PGC-1α)通过增加线粒体转录因子A(TFAM)的转录促进线粒体生物发生，这随后增加mtDNA复制、ETC基因表达和OXPHOS。PGC-1α和TFAM水平在Acta2 R179C/+ SMCs中降低，但两者都随NR处理而增加。尽管如此，NR处理并未增加低表达的mtDNA编码ETC复合物亚基mt-Co1和mt-Nd1或Acta2 R179C/+ SMCs中的低MTDR染色。单细胞转录组数据确认突变型SMC簇在体内表现出降低的mt-Co1表达。尽管如此，透射电子显微镜(TEM)分析发现基于基因型或NR处理，突变型和WT SMCs之间的线粒体嵴形态、数量或面积没有差异。这些数据表明，Acta2 R179C/+ SMCs的氧化能力降低是由于线粒体功能障碍而不是线粒体质量减少。
Western blot分析表明，Acta2 R179C/+ SMCs中的复合物I、III和IV的蛋白质水平降低，NR部分恢复了这些水平。对个别ETC复合物的评估表明，Acta2 R179C/+ SMCs的复合物I活性和复合物IV活性降低，NR处理均恢复了这两种活性。根据基因型或NR处理，复合物III活性没有显著差异。虽然NR处理在WT和Acta2 R179C/+ SMCs中均有NAD/NADH比值增加的趋势，但未达到显著水平。尽管NR处理增加了ETC活性，但Acta2 R179C/+ SMCs的ROS水平未随NR处理而增加。因此，NR通过增加ETC活性而不是通过增加线粒体生物发生来减少Acta2 R179C/+ SMCs的糖酵解代谢并改善线粒体功能。
为了确认线粒体功能与SMC分化之间的联系，在WT SMCs中使用siRNA降低了与复合物IV相关的Cox4i1水平。三种不同的siRNA显著减少了Cox4i1的表达，并显著减少了SMC收缩基因Acta2、Cnn1、Tagln和Myh11的表达。综上所述，这些结果表明有缺陷的线粒体ETC会破坏SMCs的分化。
NR预防了Acta2 SMC-R179C/+小鼠血管损伤引起的MMD样闭塞性病变。使用Microfil灌注和离体微型计算机断层扫描(CT)成像，我们发现Acta2 SMC-R179C/+小鼠左侧大脑中动脉(MCA)显著拉直，基底动脉狭窄，这一发现在SMDS患者中同样存在。由于Acta2 SMC-R179C/+小鼠没有明显远端ICA闭塞或脑缺血的证据，我们在8周龄的Acta2 SMC-R179C/+和WT小鼠中进行了LCAL，以诱发MMD样病变。LCAL后，22%的Acta2 SMC-R179C/+小鼠在术后5天内死亡，而没有WT小鼠死亡。雌性Acta2 SMC-R179C/+小鼠的死亡率高于雄性。尸检发现突变小鼠没有颅内出血、主动脉破裂、壁内血肿或胃肠道扩张。然而，突变小鼠在术后第1天和第2天表现出与海马和纹状体脑部缺血损伤一致的行为缺陷，我们使用已建立的小鼠神经评分量表对其进行量化。雌性Acta2 SMC-R179C/+小鼠在术后第1天的神经评分显著增加，表明神经行为变化加剧，两性在术后第2天都有评分增加的趋势。表现出更高神经缺陷评分（评分≥3）的小鼠在第二天死亡，我们得出结论，评分为≥3的小鼠应提前安乐死以便进行组织采集和脑组织病理学分析。为进一步评估脑缺血，不论神经评分如何，雌性WT和Acta2 SMC-R179C/+小鼠在术后第3天被处死并进行TTC染色以识别脑梗死。我们证实了一只神经评分为3的Acta2 SMC-R179C/+小鼠显示出大面积梗死，而在WT小鼠中未观察到缺血性损伤。所有评分为<3的Acta2 SMC-R179C/+小鼠都没有大面积梗死。综合上述数据支持了脑缺血性中风是Acta2 SMC-R179C/+小鼠LCAL术后早期死亡的原因。
雌性和雄性Acta2 SMC-R179C/+小鼠在LCAL后生存率较WT小鼠显著降低，NR治疗显著提高了Acta2 SMC-R179C/+小鼠的生存率。NR刺激显著降低了Acta2 SMC-R179C/+雌性小鼠在术后第1天的神经评分。NR处理不影响增殖。NR刺激后，Acta2 R179C/+ SMCs的凋亡或坏死没有增加。Acta2 R179C/+ SMCs在含半乳糖的培养基中表现出OCR增加，而含高葡萄糖的培养基则没有这种效果。WT SMCs在低葡萄糖培养基中表现出分化标志物的增加，而Acta2 R179C/+ SMCs仅在含半乳糖的培养基中表现出分化标志物的增加和迁移减少。
NR处理显著减少了Acta2 SMC-R179C/+小鼠LCAL后的死亡率和神经元损失。NR刺激使左侧LMC重塑恢复正常，表明Acta2 SMC-R179C/+小鼠LCAL后CBF有所改善。未经处理的Acta2 SMC-R179C/+小鼠在LCAL术后左脑半球LMCs直径和迂曲度增加，而NR处理显著减少了这种重塑，包括将血管直径和迂曲度降至与WT小鼠相似的水平。
总之，我们的研究提供了对SMDS患者中MMD样大动脉闭塞性病变分子发病机制的深入见解，并确定了潜在的治疗方法。我们定义了一个改变的Acta2 R179C/+ SMC表型，其特点是不完全分化并保留干细胞特征，包括增加的糖酵解和迁移。虽然神经外科干预仍然是MMD的标准治疗方法，但我们确定了一种潜在的药物方法，通过增加OXPHOS和通过NR管理提供NAD+前体来治疗MMD。NR驱动SMC分化并在体外防止SMC迁移，并在Acta2 SMC-R179C/+小鼠中防止神经元损伤和死亡。未来的研究将确定不完全SMC分化以及对NR的反应是否可以推广至其他儿童期起始的MMD或MMD样脑血管病变。鉴于线粒体氧化代谢受损与主动脉瘤相关，NR也可能在预防SMDS患者的主动脉生长方面提供益处。NR的安全性和治疗潜力已在众多临床试验中得到验证，使其成为治疗MMD样病变脑血管病并改善SMDS患者预后的有希望候选者。
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