在开发抗体药物偶联物（ADC）时，连接子结构对其稳定性、均一性、细胞毒性效力、耐受性以及药代动力学（PK）具有重要影响。
选择合适的连接子对于优化ADC的治疗潜力和安全性至关重要。理想的连接子应在系统循环中保持稳定，以防止药物过早释放，同时能够在肿瘤微环境中实现高效且特异性的载荷释放。然而，许多现有的连接子容易在非肿瘤组织中发生非特异性释放，导致脱靶毒性。
为了改善ADC治疗效果，开发能够避免脱靶毒性的新型连接子至关重要。
连接子通常根据其连接机制分为可裂解型和不可裂解型。超过80%的临床批准ADC使用可裂解型连接子，例如Inotuzumab ozogamicin（Besponsa）和Brentuximab vedotin（Adcetris）。目前使用的其他类型的可裂解连接子包括组织蛋白酶裂解型、酸裂解型、谷胱甘肽裂解型、Fe(II)裂解型以及新型酶裂解型连接子。其中，组织蛋白酶裂解型连接子已被广泛研究，并成功应用于多种获批的ADC中。
图1. ADC的一般结构及化学触发剂、连接子-抗体连接和连接子-载荷连接的作用 图片来源：ACROBiosystems
组织蛋白酶裂解型连接子
2017年，Caculitan等人发现缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）连接子对多种组织蛋白酶（包括组织蛋白酶B、K和L）表现出广泛的敏感性。然而，只有组织蛋白酶B在癌细胞中广泛表达，而其对其他组织蛋白酶的敏感性可能导致正常细胞的脱靶毒性。
为了提高选择性，Wei等人设计了一种基于环丁烷-1,1-二甲酰胺（cBu）的连接子，该连接子主要依赖于组织蛋白酶B。研究表明，通过cBu-Cit连接的药物释放被组织蛋白酶B抑制剂抑制超过75%，而组织蛋白酶K抑制剂则几乎没有影响。与Val-Cit连接子相比，带有cBu-Cit连接子的ADC在体外显示出更强的肿瘤抑制作用。
研究表明，即使对接连子进行细微的结构修饰，也会显著影响其性能。Zheng等人开发了一种缬氨酸-丙氨酸（Val-Ala）连接子，其亲水性和稳定性优于Val-Cit。Reid和Salomon等人也报告称，在多种不同条件下，含有(L,L)-二肽连接子的ADC表现出增强的抗肿瘤功效。
图2. 含有cBu-Cit-PABC的ADC结构 图片来源：ACROBiosystems
基质金属蛋白酶家族裂解型连接子
基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在乳腺癌、宫颈癌和卵巢癌等多种肿瘤组织中高表达。研究表明，MMP-2在促进癌细胞转移和调节肿瘤生长信号通路中起着关键作用。
MMP-2还可以降解肿瘤微环境中的细胞外基质成分，从而增强肿瘤侵袭和转移。利用这些特性，研究人员开发了各种酶反应性药物递送系统。与正常细胞不同，肿瘤微环境以缺氧和酸性为特征，为癌症治疗中的可控药物递送提供了有效的生物触发器。
Mu等人引入了一种新型ADC——FMSN-Dox-H2-AE01，利用人血清白蛋白（HSA）包覆的介孔二氧化硅纳米颗粒作为生物相容性药物载体。强效化疗药物多柔比星被封装在该ADC的介孔结构中，并通过抗EGFR抗体（AE01）实现精确定位肿瘤。
颗粒表面存在HSA和抗体增强了生物相容性并防止药物提前泄漏。该系统允许由MMP-2触发的选择性生物降解，确保对癌细胞的特异性细胞毒性，同时尽量减少对正常细胞的影响。
该系统的体外研究显示了显著的效果，癌细胞死亡率达到了约85-90%。此外，FMSN-Dox-H2-AE01对药物释放提供了高效的控制，其释放由MMP-2水平和pH条件调控。这些结果突显了酶响应型FMSN-Dox-H2-AE01在癌症治疗中的潜力。
图3. (A) 抗EGFR（AE01）和HSA功能化介孔二氧化硅纳米颗粒的示意图。(B) FMSN-DOX-H2-AE01的作用机制图 图片来源：ACROBiosystems
Katrin等人开发了一种蛋白酶激活型ADC，靶向IgM用于治疗IgM阳性B细胞淋巴瘤。通过将源自IgM抗原的屏蔽单元整合到全长抗体中，他们设计了一个复杂的结构。屏蔽单元与含有双蛋白酶位点的合成连接子融合，分别被MMP-2/9和膜型丝氨酸蛋白酶识别，确保在肿瘤微环境中激活。
这种基于鸡抗IgM抗体与MMAE结合的设计展示了靶向结合、内化和受控细胞毒性载荷释放的能力，有效诱导肿瘤细胞死亡。研究结果显示，与未屏蔽版本相比，屏蔽型CH2-aIgM对IgM阳性细胞的结合显著减少，但在蛋白酶处理后恢复活性。
图4. 屏蔽型aIgM ADC的设计和作用模式 图片来源：ACROBiosystems
新型酶裂解型连接子
除了为ADC开发的经典β-葡萄糖醛酸酶裂解型连接子外，β-半乳糖苷酶在一些肿瘤中过度表达，同样表现出水解活性。Kolodych等人引入了一种含β-半乳糖苷酶裂解型连接子的ADC，该连接子在体外被10 U/mL β-半乳糖苷酶迅速水解。
他们的ADC通过该β-半乳糖苷酶裂解型连接子将曲妥珠单抗与MMAE连接，其IC50低于Val-Cit连接型ADC和Kadcyla。进一步的体内研究表明，在1 mg/kg剂量下，该ADC在异种移植小鼠模型中实现了57%和58%的显著肿瘤体积缩小，优于相同剂量下的Kadcyla。
类似地，Bargh等人引入了一种靶向硫酸酯酶的硫酸酯酶裂解型连接子，类似于肿瘤细胞中的β-半乳糖苷酶。该连接子对硫酸酯酶高度敏感，并在HER2+细胞中表现出更高的细胞毒性和选择性，相较于不可裂解型和Val-Ala ADC。
图5. 糖苷酶和硫酸酯酶裂解型触发剂的结构。(A) 含β-葡萄糖醛酸酶裂解型连接子的ADC结构。(B) β-葡萄糖醛酸酶和含β-葡萄糖醛酸酶裂解型连接子的ADC释放机制。(C) 含硫酸酯酶裂解型连接子的ADC结构和释放机制 图片来源：ACROBiosystems
ACROBiosystems开发了一系列专门用于ADC连接子筛选和验证的蛋白酶，重点关注连接子裂解。这些蛋白酶包括组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、MMP-2、MMP-7、MMP-9、β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶。
产品特点
- 天然构象： HEK293表达的蛋白质确保天然结构。
- 强大且一致的酶活性： 确保批次间的可重复性。
- 高纯度： 经SDS-PAGE和SEC-MALS验证。
附加特点
- ADC分析和表征： 进行连接子筛选和稳定性评估。
- 药物释放评估： 确保高效的细胞内载荷递送。
来源：ACROBiosystems
分子 | 目录号 | 产品描述
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组织蛋白酶B | CTB-H5222 | 人组织蛋白酶B / CTSB蛋白，His标签（MALS验证）
组织蛋白酶B | CTB-M52H9 | 小鼠组织蛋白酶B / CTSB蛋白，His标签（MALS验证）
组织蛋白酶L | CAL-H52H3 | 人组织蛋白酶L / CTSL1蛋白，His标签（活性酶）
组织蛋白酶L | CAL-M52H3 | 小鼠组织蛋白酶L / CTSL1蛋白，His标签（MALS验证）
组织蛋白酶S | CTS-H52H9 | 人组织蛋白酶S / CTSS蛋白，His标签（活性酶，MALS验证）
MMP-9 | MM9-C52H3 | 食蟹猴MMP-9蛋白，His标签（活性酶）
MMP-9 | MM9-H5221 | 人MMP-9蛋白，His标签（活性酶）
MMP-9 | MM9-H5229 | 人MMP-9蛋白，His标签（活性酶）（MALS验证）
MMP-9 | MM9-H52H9 | 人MMP-9（20-707）蛋白，His标签（活性酶，MALS验证）
MMP-9 | MM9-M52H1 | 小鼠MMP-9（20-471）蛋白，His标签（活性酶，MALS验证）
MMP-2 | MM2-M52H9 | 小鼠MMP-2（30-460）蛋白，His标签（活性酶）
MMP-7 | MM7-H5249 | 人MMP-7 / PUMP1蛋白，His标签（活性酶）
β-葡萄糖醛酸酶/GUSB | BEB-H52H3 | 人β-葡萄糖醛酸酶/GUSB蛋白，His标签（活性酶）
β-半乳糖苷酶-1 | BG1-H52H3 | 人β-半乳糖苷酶-1蛋白，His标签（活性酶）
组织蛋白酶B的酶活性。来源：ACROBiosystems
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产品 | 目录号 CTB-H5222
人组织蛋白酶B / CTSB蛋白，His标签（活性酶）
底物 | 荧光肽底物Z-LR-AMC
酶活性（pmol/min/μg） | > 2,500
MMP-9的酶活性。来源：ACROBiosystems
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产品 | 目录号 MM9-H5221
人MMP-9蛋白，His标签（活性酶）
底物 | 荧光肽底物Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2
酶活性（pmol/min/μg） | > 2,500
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