信使RNA（mRNA）疫苗分析方法必须与时俱进，以确保不断发展的mRNA候选产品的身份识别、安全性及有效性。
针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的信使RNA（mRNA）疫苗的成功，使一个多年来稳步发展的领域受到广泛关注。该领域的投资已大幅增加，mRNA技术的多种应用正迅速推进临床前开发和临床试验阶段。
与所有药物或疫苗候选产品一样，拟议的mRNA产品必须满足国际人用药品注册技术要求协调会（ICH）、世界卫生组织（WHO）、美国食品药品监督管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）及全球其他卫生监管机构规定的分析表征监管要求。
与其他大多数药物成分不同，mRNA必须配制成特殊纳米颗粒（最常见的是脂质体），既保护其免于降解，又促进其穿过细胞膜。因此，需要额外的分析手段来确保纳米颗粒配方以及mRNA分子本身的质量和安全性。
mRNA治疗药物早期开发阶段的关键活动是对mRNA和纳米颗粒质量属性进行广泛表征，因为这些属性已知会强烈影响生物功效。鉴于药物开发时间表日益缩短，获取更快、更高通量的分析方法变得至关重要。事实上，在mRNA产品开发和质量控制（QC）测试中使用的分析方法必须与时俱进，以确保这些新型预防性和治疗性药物的身份识别、安全性及有效性。
多样化的分析需求
尽管mRNA候选产品的分析要求比传统生物制品更复杂，但部分测试需求相似而其他则截然不同。SCIEX生物制药行业全球质谱营销经理托德·斯塔威基（Todd Stawicki）表示："蛋白质治疗药物和mRNA治疗药物都需要充分表征，以可靠地识别和量化将影响其功效和安全性的任何质量属性。"他指出需要识别工艺相关杂质——蛋白质治疗药物中的宿主细胞蛋白（HCPs），以及mRNA中的各种基因杂质，如截短转录本或错误DNA模板。
然而差异也很显著。安捷伦科技新加坡解决方案开发科学家布莱恩·廖（Brian Liau）解释道，与蛋白质治疗药物关注翻译后修饰不同，mRNA药物在药物开发发现阶段更强调mRNA、递送系统和细胞摄取的表征。因为与递送后即可发挥作用的工程化蛋白质和单克隆抗体（mAbs）不同，mRNA一旦递送至细胞，会提供指令指导生产执行功能的蛋白质。
催化转化（Catalent）质量控制经理瑞安·汉科（Ryan Hanko）补充道，mRNA产品的制造需要独特的工艺步骤，如体外转录（IVT）和脂质纳米颗粒配制，这自然产生了不同的分析需求。沃特斯（Waters）生物制药高级业务发展经理乔·弗雷德特（Joe Fredette）阐述道，IVT是化学而非基于细胞的工艺，涉及使用RNA聚合酶将DNA转录为mRNA的酶。
关于不同的分析需求，汉科指出mRNA产品需要开发质量控制检测方法来测量IVT步骤后可能残留的酶（如聚合酶或核酸内切酶），以确保其不存在于最终产品中。5'端加帽效率确认和3'端多聚腺苷酸（poly(A)）尾分布测定也是mRNA特有的要求，英特泰克制药服务（Intertek Pharmaceutical Services）业务开发总监阿什利·韦克（Ashleigh Wake）指出。杂质谱也可能与其他分子大不相同，还需要量化任何残留质粒或双链RNA的方法。
此外，弗雷德特表示，mRNA产品的表征和化学、制造与控制（CMC）测试需要脂质分析工作流程，包括液态纳米颗粒（LNP）组成分析以确保配方中脂质的正确混合比例、脂质身份确认以及杂质分析和筛查。
韦克总结道，产品表征的总体要求相似，意图是评估或确认身份、纯度/杂质、稳定性、活性等。"然而，"她强调，"要充分实现这一目标，需要包括允许评估这些属性的mRNA特异性分析手段。"
从早期到晚期开发阶段演变的分析需求
蛋白质和mRNA基础产品开发之间的另一个重要差异在于早期发现阶段的分析负担。廖博士表示，传统药物开发通常涉及单克隆抗体，生物分析要求相对适中，因为即使是次优分子也可用于证明靶点参与和治疗效果。相比之下，mRNA产品需要多个生物过程——包括细胞摄取、内涵体逃逸和蛋白质翻译——在观察到任何效果前必须高效进行。因此，从一开始就需对mRNA和递送载体质量属性进行分析表征。
廖博士评论道："对于工艺放大和GMP（良好生产规范）制造/产品放行，mRNA的化学表征仍然重要。然而，重点往往转向确保配制产品中一致的尺寸多分散性和mRNA包封率，并识别工艺相关杂质。"
斯塔威基补充说，对于mRNA候选产品，酶工艺的放大需要对所有上游原材料——核苷三磷酸（NTPs）、酶、加帽试剂、辅因子和多类脂质——进行重大且困难的放大。"这些成分中的大部分是大型复杂生物分子，具有自身相关的放大、纯化和分析挑战，"他解释道。
汉科根据指出，生产过程中监测的属性也存在差异。在早期开发和工艺放大中，A260浓度检查和渗透压测试是过程观察的主要监测检测，而在GMP制造中，核糖核酸酶（RNase）测试至关重要，以确保最终产品不会受到非产品材料偶然污染的影响。
核心放行测试包括身份测定、最终浓度、杂质含量（如残留蛋白质、dsRNA、rDNA）、加帽效率和多聚腺苷酸尾，以及典型药典评估的安全性和质量属性。
众多关键质量属性
必须监测大量关键质量属性（CQAs）以满足监管机构对mRNA治疗/疫苗产品身份、功能和安全性的评估要求（见表I）。催化转化质量保证高级专家马修·霍华德（Matthew Howard）表示："必须确认已生成特定mRNA序列、mRNA溶液处于目标pH值，并控制任何潜在工艺杂质（溶剂、蛋白质、DNA相关）。"
霍华德还表示，需要确保5'帽和多聚腺苷酸尾的翻译促进和降解预防特性充分。韦克解释道，5'端加帽效率会影响靶蛋白生产和整体免疫原性，而多聚腺苷酸尾的长度/分布对翻译和mRNA的整体保护至关重要。
催化转化质量控制高级科学家马克斯韦尔·梅勒（Maxwell Meller）补充道："mRNA分子的5'端加帽对其递送至靶位点后的完整性至关重要，这是mRNA生产相比其他类型药物的独特要求。然而，加帽材料的表征和监测已被证明耗时且耗费资源。"
弗雷德特指出，对于脂质成分，确认LNP混合物中每种脂质的身份及其以正确比例存在至关重要，因为这些CQAs会直接影响LNP形成和功效。他强调，确保脂质杂质得到良好控制并低于关键阈值也很重要，因为脂质和mRNA杂质都可能对工艺结果产生不利影响，在某些情况下降低mRNA的效力。
需要无RNase区域
mRNA对酶（特别是RNase）降解的敏感性，在处理mRNA基础治疗药物和疫苗时创造了额外的独特要求。例如，汉科观察到使用RNase消除制剂至关重要，实验室应考虑物理空间隔离，以及人员培训和对维持RNase-free区域、设备和个人防护装备（PPE）的认识。
汉科表示，这些措施很重要，因为受损的mRNA样品在这些检测中会显示低于预期的纯度。某些分析（如残留杂质分析）据称不受受损mRNA影响，而其他分析可能仅需根据溶液制备和材料操作提高RNase敏感性。"即便如此，"汉科指出，"无论所需缓解级别如何，都必须了解所有方法的核心方法性能预期。"
时间往往是敌人
mRNA分析面临的一个最大问题在整个生物制药行业普遍存在。"这里的最大敌人是时间，"斯塔威基断言。"不幸的是，许多当前的功能性和生物物理测试仍然太慢，无法在能够干预工艺的时间框架内生成可操作的结果，"他解释道。
例如，斯塔威基强调了基于细胞的功能性检测，这是当今的黄金标准。"该测试是您是否一切正确的最佳早期指标，"他说。"您将配制的mRNA LNP给予细胞，观察是否获得足够产量的正确蛋白质或抗原。问题是可能需要数天才能获得读数。因此，开发人员往往不得不在没有分析数据支持其工艺参数的情况下冒险推进工艺。"
早期开发中使用多种互补技术
mRNA产品的生物分析需要熟悉和更新型分析技术与技术的组合。汉科重申，这也需要控制和消除可能损害产品完整性的RNase酶。
采用各种分析技术来评估这些属性。斯塔威基感兴趣的是，它们来自不同背景：高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）源自蛋白质治疗药物表征；电泳技术（最显著的是毛细管电泳）来自经典分子生物学应用；粒径测量技术则来自聚合物分析或材料实验室应用。
斯塔威基评论道："由于mRNA治疗药物是如此庞大、异质的复合物，关键在于需要表征候选产品的哪部分或哪些部分。"对于mRNA组分，他指出首选毛细管电泳甚至平板凝胶电泳方法。对于脂质和LNPs的表征，HPLC与带电气溶胶检测（CAD）或LC-MS通常是首选方法。对于完整的mRNA-LNP复合物，粒径测量或低温电子显微镜等技术更受青睐。
廖博士表示，早期开发中一些常见活动是mRNA密码子优化和选择最佳5'和3'非翻译区（UTRs）。由于这涉及从文库中克隆编码序列并与不同UTRs组合成多个质粒，桑格测序、毛细管或平板凝胶电泳以及聚合酶链式反应（PCR）仍是该开发阶段的主要分析方法。
弗雷德特指出，药物mRNA组分的表征和CMC测试包括一系列核酸（DNA/RNA）分析工作流程，以确认mRNA的身份和纯度，包括5'帽分析、多聚腺苷酸尾分析、寡核苷酸作图（类似于肽作图，但用于核酸）以及基于MS的测序。
韦克同时指出，MS也用于确定加帽效率和多聚腺苷酸尾分布等关键质量属性。她补充说，所有这些分析都是在更传统的质量控制要求（如测定[紫外(UV)/HPLC]分析、残留溶剂、金属等）之外进行的。
为确认mRNA候选产品的生物活性，可使用经过充分研究的阳离子或可电离脂质递送系统在体外转染标准细胞系。廖观察到："对于此类早期实验，通常无需使用高度纯化的mRNA或单分散脂质纳米颗粒制剂。相反，通常使用整体动态光散射和泽塔电位测量来确保纳米颗粒具有近似正确的尺寸和表面电荷特性，以允许高效细胞转染。然后可根据适当情况通过荧光显微镜、酶测定或免疫染色确定生物活性。"
晚期开发中寻求更简单、更稳健的解决方案
从开发早期到GMP环境通常使用相似的分析技术。例如，弗雷德特观察到，LC和LC-MS工作流程在开发所有阶段以及制造过程监测中都有价值。
然而，廖评论道，由于工艺优化和放大的目标通常与早期开发研究大不相同，某些情况下需要不同的分析技术。"在工艺优化和放大过程中，mRNA序列是固定的，其生物活性已知，重点是监测和/或提高工艺产量和mRNA质量属性，"他说。
廖补充道，LC-MS对于监测体外转录反应进展和确定5'加帽等关键质量属性的状态非常有用。同时，尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）和场流分级（FFF）-MALS等基于分离的技术可能有助于监测LNPs的特性并优化复合过程。
斯塔威基指出的一个重要趋势——在蛋白质治疗药物中也观察到——是随着项目进展，对更稳健和更简单技术的偏好，梅勒表示同意。例如，他指出，虽然LC-MS是表征和定量加帽物种的 promising工具，但更简化的方法更适合常规使用。"在质量控制环境中，"梅勒说，"色谱分析必须简化为HPLC检测，以优先考虑速度和高效数据分析。"
韦克总体认为，与用于其他模式的方法相比，许多用于全面理解mRNA的方法或方法在质量控制领域是新颖的。"为充分满足所有监管要求，有必要更多地使用下一代测序等技术，这些技术在GMP环境中并不典型，"她解释道。
然而，韦克表示，对于加帽等其他考虑因素，所使用的技术更为熟悉，往往 heavily基于MS。尽管如此，她指出，整体样品制备方法通常是新颖且具有挑战性的。"我们和其他实验室正在开展大量工作，开发平台方法以克服这些挑战，同时考虑最佳科学、高质量数据和监管合规性，"她总结道。
正在进行的重大创新
事实上，人们正在大力推动mRNA疫苗和治疗药物的分析进步。"科学家们研究mRNA已有数十年，但大部分努力集中在优化分析方法以实现生产级技术，"斯塔威基主张。"随着基因疗法的爆炸式增长和现在对mRNA的浓厚兴趣，您会看到科学家和仪器公司投入大量资金和创新，开发最佳分析解决方案来支持这项工作。"
例如，SCIEX推出了电子活化解离（EAD）作为ZenoTOF 7600中的新型MS碎裂技术。斯塔威基表示，该技术最初针对小分子和蛋白质治疗药物推出，但公司后来了解到EAD技术也对分析mRNA产品非常强大。"EAD对寡核苷酸和LNP表征具有惊人效用，例如可在单次实验中对脂质进行敏感且完整的结构表征，包括双键位置和异构体构型。"
斯塔威基还提到了SCIEX新推出的BioPhase 8800多毛细管CE仪器，该仪器允许同时对相同或不同样品执行最多八项分析。"我们正在探索如何利用BioPhase的高通量能力用于各种mRNA应用，"他说。
廖根据表示，安捷伦最近开发了一种通过LC-MS快速分析mRNA 5'加帽的改进方法。由于mRNA是如此大的分子，此分析需要酶解。既定方法需要两个具有挑战性的样品制备步骤：使用生物素化寡核苷酸探针进行亲和捕获，以及使用RNase-H对亲和捕获的mRNA进行位点特异性切割。
由于亲和纯化效率低下，该方法对某些mRNA序列无法可靠工作，因此安捷伦开发了一种改进的样品制备方法，包括在溶液中进行位点特异性切割（无需亲和捕获），然后使用基于二氧化硅的柱子纯化切割的寡核苷酸和mRNA样品基质。使用热稳定RNase-H酶也缩短了样品制备时间。
整个过程——样品制备、分析和数据处理——仅需75分钟，并允许在无需进一步样品清洁的情况下将目标寡核苷酸与mRNA样品基质分离。"当与专门设计的冲洗协议结合使用以减轻柱上样品基质积聚时，该方法产生了优异的线性度、灵敏度和重现性，"廖表示。
霍华德重点介绍了目前正为细胞中蛋白质表达评估而改进的几种 promising技术，例如用于检测细胞内双链RNA水平的流式细胞术和抗原特异性荧光检测表达蛋白质，这两种技术都能为细胞摄取、RNA扩增和蛋白质生产提供快速结果。"此类直接测量可缩短体内抗原研究的周转时间。新技术 certainly看起来很有前景，可能在接下来的几年内实用，"他相信。
韦克将注意力转回NGS技术；尽管总体上并非新技术，但其在GMP环境中的应用是，对于mRNA产品，NGS的引入对实现所需质量控制至关重要。同样，她说电子显微镜是评估包封产品的关键技术，以及建立体外释放性能的方法。然而，这样做需要调整主要与美国药典4型溶出测试相关的试剂盒。
韦克也重申了开发平台分析技术的重要性。她表示，持续改进适用于确定mRNA是否真正包封在纳米颗粒系统中且脂质体内部pH值正确的平台方法，对早期产品很有希望，无需 extensive开发。随着产品进入后期阶段，这些相同方法得到优化并最终针对每个特定产品进行验证。"然而，"韦克认为，"在开发周期中尽早了解这些关键方面 necessitates需要一种通用方法。"
mRNA分析仍处于早期阶段
重要的是要记住，mRNA技术本身正在快速进步并持续发展。因此，mRNA治疗药物和疫苗分析方法的开发者不仅面临这些生物分子及其递送载体的复杂性挑战，还面临开发灵活方法以适应mRNA结构和最终配方持续变化的需求。
例如，韦克指出，迄今为止mRNA产品已开发为注射剂，但吸入和鼻腔递送提供了可行的替代方案。"这些给药途径不仅能帮助实现改善的生物利用度，还能在没有医疗主导给药系统的情况下，以 less侵入性的方式递送产品，"她解释道。
弗雷德特建议，科学家应思考随着组织发展需要部署的分析平台和工作流程，以及如何最好地协调一切，从方法开发和方法/数据转移；到确保数据完整性、可追溯性和合规性；再到所需的服务和支持水平。
"我认为我们甚至还没有开始接近mRNA治疗药物分析的稳定状态，"斯塔威基表示。"自从Moderna的elasomeran（Spikevax）和辉瑞-BioNTech的tozinameran（Comirnaty）成为改变世界的疫苗以来，我们 consider mRNA治疗药物的空间继续快速增长。许多公司 now正在开发自扩增mRNA和环状mRNA等mRNA变体。此外，科学家们正在为mRNA疗法开发新型载体和靶向策略。是的，我们 still处于这项技术革命的初期阶段，"他总结道。
作者简介
辛西娅·A·查伦纳（Cynthia A. Challener）博士是《药物技术》（Pharmaceutical Technology）杂志特约编辑。
文章详情
《药物技术》
第46卷，第2期
2022年2月
页码：16–21
引用信息
引用本文时，请注明：C. Challener，《mRNA治疗药物与疫苗分析》，《药物技术》46(2)(2022)。
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