摘要
用于自由活动动物神经成像的迷你显微镜("miniscopes")主要在短时间（<2小时）内运行，并且通常只对神经活动或脑血流进行成像。相比之下，涉及癫痫发作、脑肿瘤等的中枢神经系统（CNS）疾病模型需要长期（>24小时）成像、远程操作以及同时表征多种神经生理变量的能力（我们称之为"神经监测"）。因此，我们开发了"CloudScope"，这是一种用于自由活动动物自主神经监测的基于云的多对比度迷你显微镜。其基于云的架构支持全球远程操作，并能在中枢神经系统疾病模型生命周期中连续获取多对比度图像。我们展示了CloudScope的神经监测能力，包括利用深度学习（DL）从24小时神经成像数据预测行为、表征自然行为中的神经血管变化、癫痫引起的神经血管干扰以及脑肿瘤微环境的体内细胞和微血管表型分析。最后，CloudScope的架构支持"时间共享"成像，这有可能减少动物使用。综合来看，CloudScope与中枢神经系统疾病模型的神经监测能力为表征其病因和演变建立了一种新范式。
正文
神经监测能力
能够对中枢神经系统微环境中的多个生理变量（例如神经活动（Neu^ACT）、血流量、血容量、氧饱和度和细胞动力学）进行连续（≥24小时）神经成像，对于表征中枢神经系统疾病临床前模型至关重要（补充表1）。我们将这种连续多模态神经成像能力称为"神经监测"。神经监测可以揭示从癫痫到脑癌等各种中枢神经系统疾病的病因、进展和治疗反应，同时允许将这些变化与行为结果相关联。迷你化光学显微镜（"miniscopes"）的最新进展已使自由活动、无约束动物的神经成像成为现实；然而，大多数现有的miniscopes专门设计用于研究健康脑功能，并基于神经活动或血管功能获取单图像对比机制的图像，但通常不同时获取这两种，且在短时间（例如<2小时）内以高帧率（例如10-20 Hz）进行（补充表2）。这种短时间、单模态成像方法限制了大多数miniscopes在中枢神经系统疾病临床前模型中进行神经监测的实用性，因为许多病理变化发生在更长时间尺度上（例如>24小时至数天），并且通常涉及神经和血管功能的失调。此外，技术障碍如缺乏用于远程miniscope操作以实现≥24小时连续成像的架构、用于实时检查图像采集的基于云的图像流、光漂白、图像传感器过热、需要专有电子和光学部件以及有限的电池寿命，使得对中枢神经系统疾病模型进行神经监测具有挑战性。为了克服这些限制，我们开发了一种名为CloudScope的miniscope系统，该系统集成了3D打印的miniscope，用于长期多对比度神经成像，并采用物联网（IoT）网络架构。CloudScope可以追踪自由活动动物中的神经活动（Neu^ACT）、脑血流量（CBF）、脑血容量（CBV）、血管内氧饱和度（Hb^SAT）和细胞。CloudScope使用廉价、商用、爱好者或开源组件实现，以鼓励更广泛的神经科学界使用和增强。一旦CloudScope安装在动物身上，其基于云的架构和图像采集方案就能实现≥24小时的连续多对比度成像，而不会导致传感器过热或光漂白，同时允许从世界任何地方进行体内神经成像。我们通过一系列在健康动物和中枢神经系统疾病模型中持续（≥24小时）的神经监测应用展示了CloudScope的广泛潜力：（1）利用深度学习（DL）从持续获取的神经活动数据预测动物行为；（2）表征自由活动健康小鼠大脑中的神经血管变化；（3）评估癫痫引起的神经活动和神经血管功能的干扰和随后的恢复；以及（4）脑肿瘤演变过程中细胞和血管表型的体内检测。我们相信这些创新及其广泛应用使CloudScope成为表征健康和疾病中中枢神经系统微环境长期体内变化的有力工具。
结果
基于云的远程神经监测
物联网架构（图1a）允许通过Wi-Fi连接到互联网的CloudScopes单独使用（图1b）或组装成"miniscope银行"（例如在动物设施或实验室中）（扩展数据图1a-d和补充视频1）。用户可以从世界任何地方登录CloudScope服务器，设置图像采集参数，启动图像采集，并通过图形用户界面（GUI；扩展数据图1e-g）实时观察体内实验。CloudScope（图1c）重量<3.5克，可以安装在自由活动小鼠的头部（图1d），以在宽视场（FoV；~3×3 mm²）上采集图像，空间分辨率高（~5.5-7 μm；扩展数据图1h-q）。补充表2提供了CloudScope与现有miniscopes的比较。为了确保经济实惠和广泛采用，CloudScope的控制电路使用爱好者电子设备和现成组件实现。柔性印刷电路板（PCB）（图1b、c，"柔性PCB"）承载控制10位图像传感器的电子设备，并允许不受阻碍的头部运动。表面贴装蓝色LED（波长范围=~453±20 nm）和绿色（GR）LED（波长范围=~530±20 nm）、垂直腔面发射激光二极管（LS，中心波长=670 nm或680 nm）、非球面透镜（焦距=4.6 mm）和长通滤光片（截止波长=510 nm）实现了多对比度成像（瞳孔尺寸=~1.1 mm，放大倍数=~×0.7），具有绿色荧光（FL）、固有光学信号和激光散斑对比度（图1e）。与参考文献6不同，不需要额外的PCB来安装LED，因为LED直接焊接到32号线规导线（直径=~200 μm；图1c）上，焊点上的任何应变都通过将这些导线用氰基丙烯酸酯胶粘固定在3D打印的孔中来缓解。3D打印的滑块（~2毫米滑动范围；图1e）和锁紧螺丝实现了方便的聚焦（补充图1）。3D打印的头部支架便于将CloudScope连接到小鼠头部（图1d和补充图2a-f，工作距离~2毫米）。一米长的扁平柔性电缆（FFC；~200微米厚度）将CloudScope连接到笼子上的控制模块（图1b），允许动物在24小时成像过程中自由移动（补充视频2和3）。控制模块处理与云服务器的通信（图1b和补充图3）。在其内部，Raspberry Pi和Teensyduino配置为"启动器-响应器"安排，以管理图像采集、基于Wi-Fi的图像传输和照明控制。获取的图像保存到连接到Raspberry Pi的USB驱动器（~64 GB至1 TB）并离线分析。
头部安装的CloudScope（图1d）允许评估多种神经生理变量，包括（1）通过神经毡和神经元胞体中GCaMP6s结合的Ca²⁺的绿色荧光（FL）通道变化评估神经活动变化（图1f和补充图4）或通过FL通道跟踪荧光染料和细胞；（2）通过固有光学信号（IOS）通道映射CBV（ΔCBV，总血红蛋白含量或ΔHbT；图1g）、氧/脱氧血红蛋白含量（ΔHbO和ΔHb）和血管内氧饱和度（Hb^SAT）的变化；以及（3）通过激光散斑对比（LSC）通道量化CBF（ΔCBF）的变化（图1h）。用户可以在"实时流"模式下操作CloudScope，以微调每种对比机制的图像采集参数（补充表3）或使用单一对比机制进行高速（最高~19 fps；扩展数据图2）成像。例如，通过跟踪静脉注射荧光示踪剂的传输（尺寸512×512像素，分辨率=7 μm，速度=~9 fps；补充视频4）来区分脑动脉和脑静脉，或以高时间分辨率图像采集可视化微观尺度的功能连接模式（尺寸128×128像素，分辨率=~25 μm，速度=~19 fps；扩展数据图2和补充视频5）。然后，用户可以切换到"顺序流"模式，以预定义的时间间隔（例如每~5秒）自动循环通过每个通道，同时最大限度地减少图像传感器过热（补充图5）。循环采集的图像在固定时间步长重新采样，以校正帧率的微小变化并获得并发的多对比度数据集。CloudScope操作（例如>10分钟的实时流或>24小时的顺序流；补充视频6和7）不会导致过度加热或光漂白（补充图6和7）。
动物活动通过单独的"行为摄像机"捕获（图1i），并离线注释为三种"行为音节"：最小移动（MM）、中间（INT）或奔跑（R）（图1n）。这些技术进步使我们能够连续将神经活动、CBV、CBF和Hb^SAT变化与动物行为在>24小时内相关联（图1j-n）。正如预期，活动增加的时期伴随着神经活动和CBF升高、血管舒张（CBV增加）、HbO增加、Hb减少和Hb^SAT增加（例如时期E1、E2、E3和E4；扩展数据图3）。在某些情况下，CBF、CBV和Hb^SAT升高，可能与睡眠或觉醒的血液动力学相关，而没有与神经活动或行为成比例的变化（例如时期E4*；扩展数据图3）。相反，我们在异氟醚麻醉下观察到神经活动抑制与Hb^SAT增加同时发生（n=5只小鼠），这与先前报告的脑电图（EEG）活动减少和该麻醉剂诱导的脑氧代谢率降低一致（扩展数据图4）。总体而言，长期神经监测通过多对比度成像以及CloudScope的远程访问能力（图1o）创建了一个平台，用于探究自由活动动物中神经活动和血管动力学之间复杂相互作用。
深度学习可以预测24小时神经监测数据中的个体动物行为
深度学习正越来越受欢迎，成为从神经成像数据预测动物行为的方法。虽然非深度学习方法如复杂主成分分析、动态功能连接（dFC）或共激活模式（CAPs）可用于行为分类，但它们在特异性与敏感性之间的权衡，或需要确定参考区域，通常限制了它们用于预测动物行为（例如MM、INT或R）的能力，特别是当使用短时（例如1分钟）和有限视场（仅3×3 mm²）的神经监测数据时。相反， benchtop神经成像系统每只动物可用的神经成像数据量有限（例如<2小时）通常需要合并多只动物的数据，使考虑每只动物独特特征变得不可行。为了解决这个问题，我们假设可以使用神经监测数据来优化在非生物输入上预训练的深度学习模型，以预测"个体动物"的行为（图2a和补充图8a-e）。
我们使用包含两个深度学习模块的管道：ResNet50（用于提取空间特征）和BiLSTM（用于提取时间特征）（图2b、扩展数据图5a和补充表4）。首先，对于每只动物，从鼠类运动和体感皮层（3×3 mm² FoV中心在相对于前囟的-2/+2 mm前后/内外方向）获取的神经活动图像被分组为连续的1分钟期间，期间动物表现出单一行为音节（MM、INT或R）。这些1分钟图像序列（"神经活动块"）随机分为训练（90%）和测试（10%）子集，并将训练数据集输入深度学习管道。ResNet50/BiLSTM模块末尾的全连接（FC）层预测与每个神经活动块相关的行为音节（图2b）。我们还实施了一种称为梯度加权类激活映射的深度学习解释技术，该技术识别神经活动块中每个图像中对相关行为音节分类有贡献的区域（扩展数据图6）。
在n=5只单独动物中，我们能够重复实现高行为预测准确率（平均每个类别准确率（平均±标准差），在五次折叠中计算，分别为84±4%、94±4%、88±13%、81±5%和79±3%，对应小鼠M1-M5，通过对每只动物随机选择的10%未见数据评估5次）。相应的宏观平均F1分数在五次折叠中总结在补充表6中。如混淆矩阵所示（图2d），使用24小时神经活动数据的预测准确率在每个动物的所有行为音节中都很高。我们表明，相比之下，当相同深度学习模型在神经活动块上训练时，预测准确率会恶化，这些神经活动块具有随机化的行为标签（扩展数据图5b-m）。这些性能指标表明，训练神经监测数据对实现准确的行为预测至关重要。同样，保留神经监测数据中的时间连续性对于确保准确的深度学习预测是必要的（扩展数据图5n-s）。使用仅第一小时神经活动数据（没有24小时神经监测）训练相同的深度学习管道，导致每只动物的预测偏差和显著较低的预测准确率（图2e、f，平均每个类别准确率为48%、38%、34%、58%和36%，分别对应小鼠M1-M5，使用每只动物剩余23小时的未见数据进行评估）。总体而言，这些结果证明了利用"精准方法"的可行性，神经科学家可以在表征自然行为的神经相关物时"个性化"基于深度学习的行为预测。
自然行为中血液动力学变化和神经活动并不总是在同一位置
麻醉或头部固定动物的神经成像表明，神经活动的超慢波动（≤0.1 Hz）导致附近小动脉的血管运动，从而产生跨越数百微米的CBV同步变化。类似地，神经活动耦合的血液动力学变化（功能性充血）构成了许多广泛使用的神经成像方法的基础，包括血氧水平依赖（BOLD）功能性磁共振成像（fMRI）和固有光学信号成像。虽然"抽搐、眨眼和烦躁"或动物睡眠状态的变化已被证明会改变头部固定小鼠的脑血液动力学，但动物行为对超慢频率范围内的神经血管耦合的影响仍未得到充分表征。为了解决这个问题，我们对自由活动动物中在超慢频率范围内发生在鼠类运动和体感皮层（3×3 mm² FoV中心在相对于前囟的-2/+2 mm前后/内外方向，n=5只小鼠，标记为M1-M5）的神经活动和血管变化进行了神经监测。与传统研究中通常限于10-15分钟连续成像的清醒动物相比，神经监测使我们在同一动物中能够在~100倍更长的持续时间（1,440分钟或24小时）内进行神经血管成像（参见图1j-m和补充视频6中代表性动物的时间序列）。
在宏观空间尺度（在整个3×3 mm² FoV上），神经活动和CBF与每个动物的活动水平（F^ACTIVE，当动物处于INT或R状态时）强烈相关（图3a、b，平均Spearman相关系数±标准差=0.83±0.03和0.77±0.07，分别用于神经活动与和CBF与F^ACTIVE，n=5只动物）。在此空间尺度上，每个动物的神经活动和CBF水平也强烈相关（图3c；平均Pearson相关系数±标准差=0.79±0.05，n=5只小鼠）。与先前观察一致，正Pearson相关系数表明，在每只小鼠中，平均神经活动和CBF变化是同步的。
为了确定这些CBF变化是否可归因于表面动脉或静脉的血管运动，我们开发了一种技术，用于从CloudScope获取的总血红蛋白含量的宽视场图像中量化动脉/小静脉直径变化（补充图9）。该技术使我们能够在视场（3×3 mm²）上追踪体内血管运动，该视场比双光子成像研究中报告的视场大30倍（0.5×0.5 mm²）。类似于参考文献中计算的血管运动相干性，我们将血管对之间的"血管运动同步"（Ves^SYNC）定义为它们在15分钟时期内直径变化时间序列之间的相关性。与在头部固定体内实验中报告的脑动脉和静脉直径变化耦合不同，我们发现自由活动动物中的Ves^SYNC变化很大（图3d-f；在n=4只动物，M1-M4中）。此外，动脉与静脉之间的Ves^SYNC分布范围从正值到负值（图3f），这与先前报告的这两个血管类别表现出不同的时间波动和频率谱一致。
接下来，我们假设异质性动脉Ves^SYNC（例如图3d）可能与空间异质性神经活动诱导的CBF反应相关。为了测试这一点，我们计算了表现出峰值神经活动（前50%）和峰值CBF（前50%）的实质区域之间的空间重叠系数（κ）（图3g和补充视频8）。这种空间重叠（κ）较低，即所有（n=5）动物的0.40±0.04（图3h），这表明在自由活动动物中峰值CBF和神经活动的空间共定位较差。如此低的κ值与先前报告一致，这些报告描述了非神经元起源的血液动力学波动的存在和功能性充血反应的空间"溢出"特征。总体而言，这些发现表明，虽然神经活动和CBF在宏观尺度上的时间域中保持耦合，但在自然动物行为期间，它们在微血管尺度上可能表现出低空间重叠。
神经监测揭示了癫痫引起的神经血管干扰和恢复的轨迹
最近的证据表明，癫痫发作（主要被认为是神经电事件）会导致大脑血流动力学显著失调。然而，我们对癫痫发作的血管影响的理解仍然不完整，因为大多数癫痫实验只研究大脑功能几分钟（从癫痫发作开始到结束）。相比之下，神经监测使我们能够在整个一天内持续探查大脑，在癫痫发作诱导前后（通过腹腔注射GABA^A拮抗剂戊四氮（PTZ）诱导，图4a-d，来自小鼠M2）。利用CloudScope的多对比度能力，我们观察到神经活动的广泛体内变化，伴随着CBV、CBF和Hb^SAT的同时变化，以及多次自发癫痫发作（例如，SZ^P1和SZ^P2），如果没有24小时神经监测，这些癫痫发作将会被错过。我们可视化了癫痫发作期间神经血管变化的时空演变（图4e-g，~75秒），其中可以识别出与癫痫发作开始和结束同时发生的血管收缩期（图4f，20-40秒）和低灌注期（图4g，20-40秒）（图4e，0-45秒），以及这些血液动力学变化的部分恢复（图4f、g，50-70秒）在癫痫发作终止后（图4e，50-70秒）。类似地，对四次药物诱导癫痫发作和三次自发癫痫发作在n=4只动物（M1-M4）群体中观察到神经活动、CBV、CBF和Hb^SAT的变化（扩展数据图7和8以及补充视频9和10）。我们还开发了一个神经监测仪表板，以同时可视化这些神经生理变量的变化（补充视频11）。从药物诱导（SZ^D）和自发（SZ^SP1和SZ^SP2）癫痫发作中，每种神经生理变量恢复到其癫痫前基线大约需要1小时。
在癫痫发作期间观察到的实质性血液动力学变化（图4i-k，例如在小鼠M2和M4中）发生在神经活动动力学相似的癫痫发作期间（图4h）。例如，小鼠M2（癫痫发作评分=5，基于修订的Racine量表）表现出比M4（癫痫发作评分=5）更大的血管收缩（图4i）和降低的Hb^SAT（图4k），尽管两只小鼠表现出相似的癫痫诱导神经元激活（图4i）。M2和M4之间的总体CBF变化也不同（图4j）。成像揭示了所有药物诱导和自发癫痫发作之间的神经血管变化（扩展数据图9a-d、i-l）。此外，与先前证明的全身性脑电图抑制和皮层小动脉血管收缩一致，在癫痫发作终止后的前~60分钟内，神经活动被抑制（图4l）、血管持续收缩（图4m）和CBF减少（图4n）。这些变化转化为M2的Hb^SAT降低，但M4没有（图4o）。对所有癫痫发作观察到类似趋势的神经活动、CBV和CBF（扩展数据图9e-h、m-p）。总的来说，这些数据表明，使用以神经活动为中心的技术研究癫痫发作（例如脑电图）的传统做法可能导致对潜在神经病理学的不完整表征。
为了突出这一缺点，我们通过神经活动与CBF状态空间映射了每只小鼠的神经血管轨迹（图4p-q）。标识健康、癫痫和癫痫后抑郁阶段的灰色、橙色和蓝色标记显示M2中出现多次自发癫痫发作，但M4中没有。神经活动的功率谱图（图4r、t）表明，在当前实验模型中，自发癫痫发作的特征是低频（0-15 mHz）神经活动升高，类似于药物诱导癫痫发作期间观察到的情况，并且可能伴有其后活动减少（图4s、u）。总体而言，这些观察结果突显了神经监测作为全面表征癫痫等中枢神经系统神经病理学的神经血管轨迹和异质性的工具的效用。
脑肿瘤演变的神经监测
我们利用神经监测来表征脑肿瘤演变（胶质瘤发生）过程中潜在的细胞和血管变化，研究了n=2只动物（M6和M7）。与不能再现体内脑肿瘤微环境（BTME）复杂性的体外细胞迁移测定相比，宽视场（~3×3 mm²）和高空间分辨率（~7 μm）的脑肿瘤携带小鼠的72小时神经监测使我们能够在肿瘤起始（TI）阶段期间在体内追踪鼠胶质瘤细胞（图5a、b和补充视频12）。例如，当我们追踪n=100个标记有绿色荧光蛋白（GFP）的GL261胶质瘤细胞时（图5b），我们观察到动态事件（补充视频12），如胶质瘤细胞合并（例如区域R1中的细胞C1和C2；图5c）；胶质瘤细胞侵入现有血管（例如区域R2中的细胞C3和C4；图5d）；以及胶质瘤细胞向其他脑区域的长距离迁移（例如区域R3中的细胞C5；图5e）。我们能够量化体内胶质瘤细胞的迁移动力学，包括其路径曲折度和速度（图5f-k）。我们观察到，相互作用的细胞（例如细胞C1/C2；图5f、i）或具有相似命运的细胞（例如细胞C3/C4；图5g、j）可能表现出显著不同的迁移动力学。一些胶质瘤细胞还被观察到在TI阶段期间迁移长距离（>100 μm），而没有与其他胶质瘤细胞合并或侵入现有血管（图5h、k）。表征整个胶质瘤细胞群体的迁移动力学，包括位移、迁移曲折度、速度和与微血管的接近度，使我们能够对这些细胞进行体内表型分析（图5l-o），类似于用双光子成像进行的测量，但视场大>30倍（例如3×3 mm²对比0.5×0.5 mm²）。我们还在另一只动物M7中对胶质瘤细胞进行了体内表型分析（扩展数据图10）。此外，神经监测使我们能够量化预先存在血管中血流的衰减（例如图5a中的区域R4，在图5q、s中显示24小时期间的代表性），因为胶质瘤细胞"共选择"并在该血管周围增殖（图5p、r）（补充视频13）。
同一脑肿瘤携带小鼠在随后的肿瘤聚集（TA）阶段的神经监测使我们能够比较TI和TA阶段之间的BTME演变。TI阶段的BTME（在图5a、b中标记的区域R5上显示D2-D3后24小时；补充视频14），其特征是胶质瘤细胞迁移和共选择（图6a）、稳定的微血管（图6b）以及CBF稳定或衰减的区域（图6c）。相比之下，TA阶段在同一脑区域的BTME（在D8-D9期间24小时；补充视频15）的特征是胶质瘤细胞聚集（图6d）在一个由血管生成血管组成的密集微血管龛内（图6e）和升高的CBF（图6f）。由于肿瘤引起的微血管重塑导致的固有光学信号通道信噪比（SNR）的恶化与先前报告一致，尽管这些研究没有像我们这里那样对比肿瘤生长阶段。然后，我们基于通过CloudScope连续获取的体内微观（细胞）、中观（血管形态）和宏观（功能）数据对这些独特的BTME进行表型分析（图6g-h）。TI阶段BTME的特点是最小细胞增殖（胶质瘤细胞低分数面积或FA^C）、最小血管生成（血管低分数面积或FA^V）、稳定的微血管密度（MVD）、微血管长度（MVL）、微血管曲折度（Tort）和平均CBF（AVG^CBF）以及时间异质性CBF（CoV^CBF）（图6g）。相比之下，TA阶段BTME的特点是胶质瘤细胞增殖（FA^C升高）由血管生成增强的扩张血管龛支持（FA^V、MVD和Tort升高）、AVG^CBF升高以及低CoV^CBF（图6h）。最后，我们表征了体内胶质瘤演变的动态（补充视频16）。关键的是，这些多尺度体内神经监测数据使我们能够区分TI阶段BTME和TA阶段BTME（图6i）。此外，尽管在TA阶段BTME中神经血管单元被胶质瘤细胞破坏（补充图10），但该阶段的CBF变化仍与动物活动相关，类似于TI阶段（图6j、k；R=0.80和0.90，分别对应TI与TA的CBF时间序列和F^ACTIVE之间）。总体而言，神经监测能够探查脑肿瘤生命周期的关键方面，使CloudScope成为理解胶质瘤发生早期步骤、测试疗法和开发基于体内胶质瘤细胞-BTME相互作用的临床生物标志物的有力工具。
讨论
表征中枢神经系统疾病临床前模型的启动、进展和结束（即生命周期）伴随的神经血管变化，需要一种可以连续运行多天的多对比度成像系统。CloudScope实现了在自由活动动物中24小时或更长时间的自主体内神经成像。我们成功地对关键的体内神经生理变量进行了神经监测，例如神经活动、CBF、CBV、Hb^SAT和细胞追踪。这种多对比度能力使中枢神经系统疾病微环境的基于图像的表型分析成为可能，跨越细胞/神经元（微观）、血管/血液动力学（中观）和组织（宏观）空间尺度。此外，多个CloudScopes并行运行适用于制药公司或合同研究组织（CROs）的高通量应用，如药物筛选。使用爱好者电子设备、开源软件和3D打印材料确保了CloudScope对用户的经济实惠，并可被资源不足的研究和教育环境使用。
24小时神经监测数据的获取使我们能够测试使用深度学习框架从神经活动记录预测动物行为的可行性。我们成功地使用传统ResNet50和BiLSTM模块组合预测了动物的行为状态，其性能通过Grad-CAM可视化。可以设想扩展这种神经监测信息的深度学习框架，包括更强大的基于"transformer"的架构用于行为分类。我们通过仅使用该动物的数据（不与其他动物的数据合并）来训练和预测其行为，实现了每个动物的高平均每类预测准确率（>75%），这为开发新一代深度学习管道以揭示个体特异性特征奠定了基础；然而，应该注意的是，预测准确率取决于每个行为音节可用的训练数据量。例如，与MM音节（94±8%）相比，动物M5的R音节的较低准确率（64±15%）可能是由于在24小时成像期间为M5观察到的R音节数量相对较少。可以通过更长时间成像或在将它们用于深度学习管道之前合并不频繁的行为音节来解决这个问题。神经监测信息的深度学习模型也可用于阐明健康或疾病条件下的学习机制，例如中风后康复或帕金森病患者。神经监测信息深度学习的跨模态使用，例如当从神经活动中预测CBF变化模式时，可以帮助我们更好地理解神经血管动力学及其在不同中枢神经系统神经病理学中的干扰。探索Grad-CAM或LIME等深度学习可解释性技术也可能有助于更好地将深度学习特征与其神经生物学基础相关联。我们相信，24小时多对比度神经监测和行为数据结合其他已建立的深度学习管道，例如CEBRA框架，可以扩展CloudScope在中枢神经系统疾病和神经科学应用中的影响和效用。
接下来，我们将神经监测应用于探索自由活动动物在健康和疾病条件下（包括癫痫和脑肿瘤）神经活动和脑血液动力学之间复杂的相互作用。我们可视化和表征神经血管动力学超过24小时的能力可能对理解癫痫的原因、后果和复发至关重要。神经监测也可用于筛选抗癫痫药物，以及滴定其剂量和时间以获得最佳疗效。由于神经监测使动态BTME的多尺度表型分析成为可能，可以设想将其与已知阻止肿瘤细胞迁移的辐射治疗或化疗药物（如小檗碱）结合使用，以定制治疗并优化疗效（即精准医学方法）。我们还使用神经监测识别了脑肿瘤干细胞样细胞的关键栖息地——血管周围龛，通过识别被胶质瘤细胞共选择的微血管区域。在抗血管生成或抗共选择药物治疗期间对这些龛进行成像，可以帮助阐明对这些疗法产生耐药性的机制。总体而言，这些数据说明了神经监测对一系列中枢神经系统病理的效用，以及CloudScope改变我们对疾病微环境的理解并催化更有效治疗和体内生物标志物开发的潜力。
我们设想了几项令人兴奋的发展，以进一步增强CloudScope的效用。例如，修改其设计以获取更宽视场（例如8×10 mm²）的图像将使整个鼠皮层的神经监测成为可能。深度学习方法（例如DeepWonder）可以应用于从CloudScope图像中解析单个神经元胞体的神经活动时间序列。采用支持高速图像采集的超低功耗图像传感器将允许神经监测更快的神经血管事件。包括额外的~590 nm IOS通道可以提高血管内氧饱和度测量的信噪比。实施额外的蓝色、红色或近红外FL通道将实现一系列新的神经监测应用，例如成像神经元-星形胶质细胞串扰、识别脑肿瘤演变期间的神经元-胶质瘤相互作用以及测试用于促进颅骨骨缺损愈合的新组织工程结构的疗效。CloudScope也可以与电润湿透镜配对，允许在长期实验中方便地聚焦。结合微型脑电图或神经化学传感器将进一步扩展CloudScope的神经监测能力。神经监测也可以与多个行为摄像机和高级行为分析工具（如DeepLabCut）结合使用，以深入了解神经活动-行为关系。当与植入式药物输注泵或光遗传学刺激等干预措施结合时，神经监测的力量可用于筛选潜在的候选药物并微调其疗效。为CloudScopes设计气密密封或灭菌协议将使感染性脑疾病模型（如结核分枝杆菌）的神经监测成为可能。
可以通过使用Raspberry Pi的以太网端口或个人Wi-Fi热点来增强CloudScope的Wi-Fi带宽。高带宽互联网访问与基于云的存储相结合，可以通过为世界各地的研究人员提供不受限制的体内成像实验和数据访问，使中枢神经系统疾病和神经科学研究"民主化"。通过利用Raspberry Pi的CPU核心进行嵌入式实时处理，可以使CloudScope自动识别何时达到预设标准（如神经活动阈值或行为刺激），并在"顺序"和"实时流"模式之间切换，实现"智能"神经成像范式。最后，我们的基于Web的架构支持"时间共享"多模态成像，通过将同一动物用于多次体内成像实验，有可能减少动物使用和浪费。鉴于其现有能力和未来增强，我们相信基于CloudScope的神经监测有潜力促进全球神经科学合作，降低研究的入门障碍，并实现对健康和疾病中大脑的新研究。
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