跨越时钟：生物医学中的衰老工程
年龄匹配组织工程的相关性
组织工程旨在使用细胞、生物材料支架和/或生长因子的组合来恢复或替换体内患病、受损或丢失的生物组织，或为基本研究或筛选应用生成体外组织。后者包括微型组织，通常称为"微组织"，以类球体、胚状体、类器官（例如在微孔中）或器官芯片的形式存在。在这些模型系统中，通常不考虑所用细胞的年龄。然而，与年轻细胞相比，衰老细胞在基因组稳定性、表观遗传特征和代谢等各种特征上显示出显著改变[1,2]。在老龄化社会的背景下，需要源自年龄代表性或"年龄匹配"微组织的模型。根据上下文，年龄匹配广泛指与目标时间年龄、生物年龄或功能年龄相匹配。
在组织工程的基础上——该学科应用工程和生命科学原理开发生物功能组织——我们提出了"年龄工程"或"衰老工程"的概念，即应用工程原理对细胞和/或细胞外基质(ECM)进行有针对性的体外年龄(衰老)操控。年龄工程能够开发代表性模型，用于研究一系列年龄相关状况和疾病（例如，神经退行性疾病、糖尿病和癌症）。经过年龄工程的微组织可为年龄特异性药理毒理学、早期诊断生物标志物发现和筛查预防性治疗策略提供生理相关的预测平台。
自然衰老的细胞需要在培养中维持数月、数年甚至数十年，取决于所需组织的年龄，这使得这种方法成本高昂。然而，加速的、人工的（或合成的）衰老可能是一种潜在的高效解决方案。本论坛重点介绍了在体外加速衰老的技术可行工程方法，并讨论了由此产生的衰老微组织的应用，这些应用可作为基础研究和转化研究之间的桥梁。用于衰老研究的微流控器官芯片平台或"微生理系统"已在其他文献中详细阐述，此处不作讨论[3]。我们将重点介绍体外衰老的表征和量化方面的进展，讨论操控培养细胞和ECM衰老的干预措施，或合成类似衰老ECM的基质，并预测其未来应用。
体内衰老及年龄表征
人类衰老是在细胞和组织水平上随时间推移的生理功能下降，并伴随着包括基础ECM在内的组织组成、结构和机械特性变化[1,2,4]。鉴于这些促成因素十分复杂，López-Otín等人建立了一个基于生物分子标志物的综合框架（如端粒缩短、干细胞耗竭、营养感应失调和细胞间通讯改变），这些标志物在正常衰老过程中显现并对实验性加速或延缓有响应[1,2]。经后续研究验证，该框架现支持靶向抗衰老疗法的开发[2,5]。
目前与衰老相关的研究通常在模式生物中进行。由于寿命短，小鼠和大鼠适合研究整个衰老过程。此外，能够获得大量样本并控制环境条件和遗传背景使小鼠和大鼠成为理想的模式物种[6]。其他模型包括猕猴，它们在遗传、解剖和生理方面更接近人类，但需要更多的伦理和经济考量[6]。总体而言，这些体内模型系统的伦理、生物和经济限制突显了对研究衰老的新型人源相关体外系统的迫切需求。
体外组织年龄(衰老)的工程化
个性化衰老工程的细胞来源
人诱导多能干细胞(hiPSCs)的分化是获得个性化、组织特异性细胞的潜在方法。然而，在重编程过程中，这些细胞已被证明会恢复到与胚胎干细胞相当的年轻状态[7,8]。hiPSCs在早期培养中包含残留的与年龄相关的表观遗传特征，但这些特征在后期会逐渐消失[9]。尽管这种缺乏衰老"记忆"对生成年龄匹配的hiPSC衍生模型构成了重大限制，但正如下面所强调的，正在积极探索在培养中重新诱导此类模型衰老的方法[7]。
调节衰老的内在和外在因素
体外衰老可通过改变已知影响体内衰老的内在（细胞）和外在（微环境）因素来调控（图1）[1,2]。控制衰老的一种相对直接方法是通过内在和外在活性氧(ROS)诱导物来操控氧化应激。常见的ROS诱导物包括炎症刺激和暴露于外在因素如致癌物和紫外线辐射，这些随后导致DNA损伤[1,2]。细胞增殖过程中端粒缩短等内在衰老过程可触发DNA损伤反应，进而驱动ROS生成[1,2]。线粒体功能障碍，例如由于线粒体DNA突变，是氧化应激的另一个已知诱导因素[1,2]。此外，基因编辑技术，例如成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)，可应用于体外建模和加速衰老[7]。
组织硬度增加是衰老的一个特征性表现，由ECM变化引起，包括微结构和生化组成的改变，导致机械转导改变[4]。这些ECM变化由胶原蛋白浓度和交联的改变，加上纤连蛋白展开引起，进而导致组织硬度和粘弹性的变化[4]。此外，细胞微环境中蛋白质聚集增加形成不溶性斑块，如在神经退行性疾病中所见[4]。这些变化可通过动态水凝胶系统在体外模拟，其中ECM由外部刺激调控。示例包括光响应、热响应、磁响应和酶响应水凝胶[4]。来自衰老组织的脱细胞ECM也可用作支架，加速年轻细胞的衰老（图2）。此外，使用重组合成蛋白质制成的水凝胶可作为脱细胞ECM的替代品，从而在更受控的环境中研究系统变化的基质组分影响。
尽管上述策略适用于细胞系，但需要替代策略来衰老更复杂的、异质性组织模型，如类器官。许多类器官具有支持干细胞的生态位，这些干细胞补充分化的衰老细胞[10]。在这种模型中，使用遗传或代谢修饰逐渐消除干细胞群将至关重要[5]。除诱导氧化DNA损伤外，还可通过调节表观遗传修饰触发干细胞衰老[2]。这可用于模拟衰老组织中干细胞的耗竭，并研究恢复干细胞池的方法。或者，可通过选择性衰老或消除对干细胞维持重要的细胞和细胞外生态位组分来调控干细胞群和效力。
衰老导致衰老细胞的积累，进而通过衰老相关分泌表型(SASP)破坏组织稳态，其中细胞分泌包括免疫调节剂和炎症细胞因子在内的因子[1,2,5]。尽管与衰老和压力相关，越来越多的证据表明衰老细胞在促进组织发育、功能和再生方面可发挥重要作用[11]。然而，关于不同类型的衰老细胞及其在组织稳态中的确切作用的问题仍需解答，这些问题可通过共培养平台研究组织特异性SASP介导的免疫相互作用来解决。分析衰老细胞分泌的蛋白质有助于阐明它们在衰老中的作用。随后，候选蛋白质可被测试用于加速体外衰老。此外，微重力应用是一个新兴前沿领域。长时间暴露于微重力可诱导类似衰老的表型，与线粒体功能障碍和氧化应激相关，表明微重力可作为重要工具[12]。最后，通过靶向表观基因组编辑（如CRISPR引导的工具）或小分子表观遗传修饰剂，可实现对衰老相关表观遗传特征的主动调控[2,5]。
衰老在组织工程中的应用
在工程化组织中加速衰老对于理解与年龄相关变化的过程和后果至关重要——例如改变的组织结构、破坏的细胞信号传导和降低的再生能力——以及其根本原因，包括细胞衰老和干细胞耗竭。此类衰老组织还将能够测试新疗法，例如使用高通量筛选老年治疗药物和衰老细胞清除药物，否则很难评估（图1）。
此外，衰老工程可在类器官中产生老年表型，这目前难以实现。大多数hiPSC衍生的类器官表现出胎儿样、不成熟的表型，通常需要长期体外培养（约6个月）或移植到动物体内以增加其成熟度[13]。衰老工程可创建表现出晚发型病理特征功能衰退的微组织。此类衰老类器官将对个性化医学具有重要价值，例如用于测试年龄依赖性药物功效及发现衰老生物标志物（图1）。最后，调控类器官内的衰老还将能够研究干细胞（生态位）衰退和靶向恢复，从而加速干细胞疗法的发展。
结论与未来展望
建立能够控制衰老时钟的体外平台（图2）可显著加速年龄匹配组织的工程化，从而创建更具代表性和预测性的体外模型。此外，衰老工程可用于生成用于预测性疾病建模和药物筛选的组织特异性、年龄匹配的细胞、基质和组织。为推进这一领域，专家共识将需要就验证"衰老"表型的生物标志物标准化达成一致。我们认为，控制衰老时钟代表着从被动观察衰老标志物的出现向导致功能衰退的衰老特征精确操控的范式转变。该领域还将受益于人工智能的开发和应用，以整合多样化的读数（如成像和基因表达）并捕获衰老工程微组织中的系统性衰退。重要的是，所产生的微组织需要与衰老的人体组织和ECM样本进行稳健的基准测试。最终，这些模型可加速个性化老年治疗药物和延长人类健康寿命的靶向干预的发现。
致谢
作者感谢荷兰科学研究组织(Netherlands Organisation for Scientific Research)资助的"材料驱动再生"引力计划（项目编号024.003.013）提供的资金支持。
罗马·特鲁肯米勒是300MICRONS GmbH公司的联合创始人、股东和管理董事，该公司活跃于微工程3D细胞培养解决方案领域。
【全文结束】