基于片段的药物发现——从苗头化合物发现到FDA批准：经验教训与未来挑战Fragment-based Drug Discovery - From Hit Discovery to FDA Approval: Lessons Learned and Future Challenges | Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists

摘要

过去十年，基于片段的药物发现(FBDD)方法在药物候选物的识别和优化中持续增长。这产生了一系列正在进行临床评估的FBDD衍生药物，最近维莫非尼(vemurafenib)作为首个源自FBDD方法的上市药物获得批准。FBDD在产生高质量药物候选物方面的成功源于结构生物学、生物物理表征和严谨的药物化学的结合。我们讨论了决定FBDD方法成功的重要因素，并考虑了未来可能进一步提高FBDD方法影响力和成功率的领域。

引言

随着蛋白质-配体结构信息的日益丰富，基于片段的药物发现(FBDD)[1]在过去十年中已成为发现高质量药物研发起点的重要苗头化合物识别方法。寻找小分子片段结合物并通过基于结构的设计对其进行精炼和扩展的概念，代表了结构生物学和药物化学设计药物候选物最基础且优雅的协同作用之一。该领域最近迎来了新里程碑——用于治疗黑色素瘤的佐博伏(Zelboraf，维莫非尼)[2,3]获得FDA批准，被认为是首个源自FBDD方法的药物。FBDD的实用性进一步体现在越来越多的FBDD衍生分子目前正在进行临床评估（表1）。

FBDD与其他基于筛选的苗头化合物识别策略（如高通量筛选(HTS)[4]）在多个方面有所不同。首先，由于片段的分子结构简单（典型分子量为100-250道尔顿），它们能够比更大的HTS筛选集合（通常分子量在250-500范围内）更高效地采样更大比例的可用化学空间[5-7]。因此，FBDD筛选可以仅使用500-1000个精心选择的片段组成筛选集合就有效进行，并且在使用足够灵敏的测定方法时，能够获得比包含百万以上化合物的HTS筛选更多样化的苗头化合物。

其次，由于其体积小，片段苗头化合物通常比大分子更高效地与其靶标结合[8]。高效结合在允许更选择性、可能更具开发潜力的药物方面的重要性已被认识，配体效率（结合自由能每重原子[8-11]）指标现在在先导化合物优化中常规使用。这种效率提高可能是由于片段能够在结合位点中采用最佳取向，而大分子可能更难实现这种最佳取向。通过仔细的、基于结构的优化，FBDD苗头化合物可以提供配体高效的临床候选物，其分子特性与开发过程中较低的淘汰风险一致[12]。特别是，通过专注于优化极性相互作用，可以控制候选物的关键参数亲脂性[13]，从而提高亲脂性配体效率(LLE[12,14])水平。随着更多FBDD衍生分子进入后期临床试验并开始上市，将有可能评估FBDD中隐含的结构和特性指导优化是否能够更高效地生产药物。

最后，由于片段体积较小，FBDD苗头化合物的结合亲和力通常比HTS衍生苗头化合物所见的要弱得多。这种弱亲和力需要使用不同于HTS方法中最常用的功能生化读数的不同测定方法。通过使用敏感的生物物理技术，包括核磁共振(NMR)[15]、表面等离子共振(SPR)[16]、X射线晶体学[17]、热变性[18]、等温滴定量热法[19]等，可以极其详细地表征蛋白质-配体相互作用。这些技术能够识别非常弱的配体（大多数片段苗头化合物通常以5毫摩尔-10微摩尔的Kd值结合），但对结合位点的位置不敏感。因此，生物物理技术有可能识别与别构或隐蔽结合位点相互作用的苗头化合物。许多生化测定依赖于与特定结合物的竞争，因此可能无法识别这些独特的结合相互作用。生物物理技术还提供额外信息，如结合化学计量、动力学以及识别混淆测定的人工假象（例如基于聚集的结合或不可逆性[20]），这些通常会影响生化筛选，但经常在优化过程的后期才被发现。

成功FBDD活动的关键要素

由于FBDD方法的优势以及高通量X射线晶体学和生物物理测定的日益可用，许多团队现在正在开展FBDD方法，单独使用或作为HTS或其他苗头化合物生成方法的补充。FBDD概念可以成功地以多种方式应用，个别策略通常基于特定组织的特定优势，但在成功的FBDD工作中出现了一系列共同的基本主题：i)高质量的片段库；ii)方便获取蛋白质-配体结构信息；iii)可靠的测定方法来表征和监测弱结合；iv)严格的基于结构的优化。图1展示了FBDD苗头化合物识别工作的典型进展。有效的片段筛选集合可以在数量上很小（例如，500-10,000个成员），但必须设计良好且化学多样性高（综述见例如[21]和参考文献），以便有效地进行苗头化合物后续工作。大多数片段集合广泛遵循"三规则"[22]（分子量<300，cLogP<3，氢键受体<6，供体<3），尽管许多专注于更小的分子，从而更高效地覆盖多样性空间。由于FBDD筛选中使用的高化合物浓度，需要高预测或测量的水溶性（>0.1-2毫摩尔）。增加三维性程度或包含已知药物中的"特权"子结构等因素也被使用。严格的质控以去除不良分子（聚集物、氧化还原不稳定或反应性分子）可以减少假阳性。去除这些有问题的化合物会增加初始苗头化合物是特异性和可优化结合物的可能性，这反过来应该更可靠地将苗头化合物转化为可行的先导系列。虽然无偏见、结构多样的片段集通常会对一系列靶标提供良好的命中率[23]，但针对特定蛋白质靶标家族设计的特定集合也被有效使用[24]。

片段筛选通常使用生物物理技术（X射线、SPR、NMR或Tm）或稳健的高浓度生化测定进行。所使用的测定必须能够可靠地检测具有弱结合亲和力（例如，约1毫摩尔）的苗头化合物，并且还应适合于识别初始苗头化合物以及通过Kd或IC50测定对类似物进行排序，以支持初始片段优化过程。通常，显示在多个测定中具有活性的苗头化合物会被优先考虑，并且随后在X射线晶体学中显示出更高的成功率。如果初级筛选的测定通量有限，片段库的虚拟筛选也经常被报道。然而，与大分子相比，简单片段的对接和评分可能更具挑战性，特别是对于效率较低的结合物[25]。此外，由于片段的微小变化可能改变其晶体学确定的结合模式，片段的虚拟筛选应谨慎对待。

虽然可以将晶体学用作初级筛选[17]，但更常见的方法是结合生物物理和生化测定，在结构确定之前对苗头化合物进行分类。由于片段筛选通常会产生比合理推进更多的苗头化合物，一个关键决定是哪些片段应优先进行药物化学优化。这一点可能是最关键的，因为通常需要大量化学资源进行优化，以产生具有适当效力和特性的分子，使其成为有用的药物或工具分子。在优先排序过程中考虑的因素可能包括配体效率（和LLE）、知识产权格局、结合模式的新颖性、对相关靶标的特异性、合成可行性以及片段扩展方向的多样性。片段到先导化合物的优化通常旨在通过利用基于结构的假设来有效获取新相互作用同时增加化合物亲和力，从而保持（或增加）效率指标（LE和LLE）。虽然保持LE/LLE将提供具有受控cLogP的高效先导化合物，但它不会确保具有良好药物特性的先导化合物（即良好的溶解度、良好的体内药代动力学、适当的特异性和缺乏有问题的CYP450相互作用等）。片段到先导化合物优化中严谨的药物化学的重要性不容低估。在早期片段优化中，结合通常较弱，这需要常规使用高灵敏度测定来推动构效关系(SAR)，以及一支习惯于在传统药物发现工作中通常看不到的亚微摩尔效力范围之外操作的化学家团队。

图2-FBDD苗头化合物识别和进展的关键部分

为说明此过程，图2总结了维莫非尼[2,3]的发现过程。从一个弱效、非选择性的苗头化合物（7-氮杂吲哚）开始，X射线晶体学数据（最初在替代激酶Pim-1中）允许优化为配体高效的先导化合物PLX4720。最终优化以改善分子的整体特性，导致PLX4032（维莫非尼）的产生，其配体效率略有降低但仍良好。初始片段在整个过程中以红色突出显示。

FBDD已在许多生物靶标上取得成功，X射线结构支持的增加推动了其扩展应用[26]。早期成功领域包括激酶[27-31]、其他ATP酶（Hsp90一直是测试FBDD策略的重要载体[32-36]）等。最近，已报道扩展到更广泛的可溶性靶标[37]、蛋白质-蛋白质相互作用界面[38]以及现在的膜结合靶标[39,40]。

FBDD的主要吸引力在于其潜在的低入门门槛，即不需要大型筛选集合（与HTS相比）。使用精心选择的片段集合（许多商业提供）和亲和力/活性测定，可以轻松生成一组苗头化合物。X射线结构确定的访问也将确认其结合模式，但要充分利用这些片段苗头化合物，必须将它们优化到效力水平（通常为0.1–1微摩尔），使其可能可靠地开始在生物系统中显示效果。FBDD的另一个重要好处是，由于这种优化过程使用简单的起点，允许在扩展片段时最大限度地灵活，同时仍将特性（如LogP、分子量）保持在最佳类药空间中。

从根本上讲，FBDD只是高灵敏度筛选/结构驱动药物化学的一种改进形式，可以单独使用或与其他苗头化合物发现方法（如HTS或合理设计）结合使用。FBDD和HTS苗头化合物集合的整合经常可以识别重叠，以建议有益的优化途径，从而增加整个数据集的价值，超过单独每个筛选的价值。这种整合在制药公司中特别有用，因为能够并行生成HTS和FBDD数据集，加上大型公司和商业化合物集合（通常>>100万个化合物）的 readily availability，可用于快速扩展围绕片段苗头化合物的构效关系(SAR)，并找到效力更强但仍高效的结合物。在没有直接初级片段筛选的情况下，FBDD概念也可用于分析HTS数据集：通过对代表HTS苗头化合物子结构的分子使用高灵敏度测定，可以在将此衍生片段重新生长为更有效类似物之前识别最小药效团。

当前问题与未来方向

许多FBDD工作依赖于广泛的X射线结构支持来指导优化，但对于某些靶标，X射线支持仍然不常规，其他方法（如NMR结构）不切实际并阻碍FBDD方法。例如，许多蛋白质靶标作为多组分复合物的一部分存在，这些复合物通常不适合X射线结构测定。此外，在某些情况下，最适合晶体学的分离蛋白质可能与体内生理环境的相关性有限。这导致优化由生物相关性有限的系统指导，当然，这个问题并非FBDD方法所特有。在使用X射线或其他技术（特别是在原生或溶液相中）生成结构信息方面进一步改进，将大大促进FBDD和其他合理设计方法的优化过程。在缺乏结构数据的情况下扩大FBDD方法的使用[41]也可能允许解决一些结构上不太容易处理的靶标。在这方面，进一步改进信息学方法以合理指导优化和SAR研究，特别是当它们可以依赖于 readily availability的大公司类似物集合时，将扩展FBDD的实用性。

鉴于FBDD方法依赖于将结构信息转化为具有良好药物特性的高效力分子，我们在理解配体-蛋白质相互作用以辅助此过程方面仍有很大提升空间。对于大多数靶标，识别片段苗头化合物通常是可能的，但可靠地将这些苗头化合物转化为药物候选质量的分子仍然不是常规的，许多片段苗头化合物被证明不可优化。更好地预测哪些片段可优化而哪些不太可优化的能力将大大帮助团队专注于最佳系列和分子。随着药物发现开始解决新靶标，其中许多基于其结合位点的拓扑结构被认为可能不太易与配体结合。特别关注蛋白质-蛋白质相互作用的调节，并推测可能需要大面积表面相互作用才能有效破坏。小片段的体积小可能会阻碍与这些表面的有效相互作用，但针对蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的片段筛选可能仍然是一个强大的方法[42]。

结论

在成功生成其首个上市药物的基础上，FBDD继续作为一种有价值的苗头化合物识别工具，可以单独使用或作为更广泛、综合策略的一部分。如果具备合适的筛选集合、测定方法、结构支持和优化策略，FBDD是为各种生物靶标寻找高质量苗头化合物的有力方法。虽然它不是万能的，不能提高难以处理或选择不当的靶标的可药性，但它通常会为与蛋白质靶标相互作用提供最佳的可行化学物质机会。将此苗头化合物优化为具有药物或工具用途的分子在某些情况下可能很困难，但随着我们生成生物相关蛋白质结构的能力提高以及对结构导向设计的理解加深，FBDD的力量将进一步增强。

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特里·休斯(Terry Hughes)目前领导葛兰素史克(GSK)在美国宾夕法尼亚州科利奇维尔园区的片段到先导化合物化学团队。他在制药行业拥有十余年药物化学经验，从事从苗头化合物识别到先导化合物优化的工作，重点是基于结构的设计。terry.v.hughes@gsk.com

伊恩·鲍德温(Ian Baldwin)已在GSK及其前身公司工作11年。他在分析数据和领导许多基于高通量筛选(HTS)活动的先导化合物发现项目方面拥有专长。他目前领导GSK内基于片段的药物发现化学家团队。

伊恩·丘彻(Ian Churcher)领导早期药物化学部门，负责葛兰素史克全球研发中的新型苗头化合物识别策略。除了为葛兰素史克公司筛选集合的化学战略做出贡献外，该团队还为从苗头化合物识别到先导化合物优化的FBDD项目组合提供药物化学支持。

本文发表于2011年11月14日出版的《国际药物发现》(International Drug Discovery)第6卷第5期。版权归出版商所有。

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