摘要：结直肠癌(CRC)仍然是全球癌症发病和死亡的主要原因，约四分之一的患者在诊断时已出现转移性疾病。表皮生长因子受体(EGFR)通过激活下游RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT/mTOR信号通路在CRC发病机制中发挥核心作用，并已成为一个主要的治疗靶点。抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗和帕尼单抗已在特定患者中显示出生存获益，尤其是左侧、RAS野生型肿瘤患者。然而，原发性和获得性耐药限制了其疗效，凸显了预测性生物标志物和新策略的需求。本综述综合了EGFR生物学、治疗整合和生物标志物开发的当前知识，包括RAS和BRAF突变、MSI状态、HER2扩增、EGFR配体(AREG/EREG)、共识分子亚型和液体活检应用。我们还讨论了耐药机制，如通路再激活、受体突变和上皮间质转化，以及新兴方法，包括联合方案、ctDNA指导的再挑战和基因型特异性抑制剂。总之，这些见解强调了CRC精准肿瘤学不断发展的格局以及分子分层在优化EGFR靶向治疗和克服耐药性方面的重要性。
关键词：EGFR；结直肠癌；生物标志物；耐药性；治疗策略；西妥昔单抗；帕尼单抗；液体活检；精准肿瘤学；综述
- 引言
结直肠癌(CRC)在2022年发病率排名第三，新发病例190万例，死亡率排名第三，约24%的病例在初诊时即为转移性[1,2,3]。表皮生长因子受体(EGFR)通过下游信号通路如RAS/RAF/MEK/MAPK和PI3K/AKT/mTOR在促进肿瘤生长、细胞存活和增殖中发挥核心作用，因此已成为一个治疗靶点[4]。CRYSTAL和PRIME试验是首个证明抗EGFR抗体西妥昔单抗和帕尼单抗在治疗转移性CRC(mCRC)中有效性的随机试验，并带来了生存结局的改善[5,6]。然而，临床获益仅限于一部分mCRC患者：右侧结肠癌的一线使用与较差结局相关，携带RAS突变的肿瘤表现出原发性耐药。临床疗效主要见于左侧、RAS野生型(WT)肿瘤患者，但由于继发性(获得性)耐药的发展，应答往往持续时间较短[5,6,7]。识别预测应答或耐药的生物标志物对于优化EGFR靶向治疗的使用至关重要。由于RAS突变的存在是缺乏应答的最明确预测因子，因此在开始治疗前进行常规检测是必要的[8,9,10]。其他生物标志物，如BRAF突变和其他基因组或蛋白质组学特征，正在研究中，以更精确地对患者进行分层并预测结局[11]。因此，需要克服耐药的策略。在本综述中，我们将概述EGFR在CRC中的生物学和信号传导，强调驱动肿瘤增殖和存活的分子机制，总结当前抗EGFR治疗的局面，并讨论预测性生物标志物和耐药机制，以及旨在克服耐药的新兴策略。
- CRC中的EGFR生物学和信号传导
2.1. 生物学
EGFR是一种参与细胞增殖、分化和存活的跨膜糖蛋白[12]。1960年，发现EGF与其受体结合可显著刺激表皮细胞的增殖[13]。异常的EGFR信号与多种癌症的发展密切相关，包括非小细胞肺癌、CRC、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤和胃癌[14]。EGFR，通常称为HER1或ErbB1，属于ErbB受体家族，该家族还包括HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)[15]。这些受体在调节细胞增殖和维持细胞功能方面起着关键作用，通过磷酸化级联反应和生化信号传导[15]。这些跨膜蛋白受体的任何失调都可能导致不受控制的细胞增殖、肿瘤发生甚至转移[14]。在CRC中，EGFR经常过表达，在30–90%的晚期病例中有报道，并且与不良预后和较差结局相关[12,16,17]。已鉴定出七种EGFR配体，包括EGF、转化生长因子-α(TGF-α)、双调蛋白(AREG)、表皮调节素(EREG)、β细胞素、肝素结合性EGF和表皮素[18]。其中，AREG和EREG在CRC生物学和治疗应答预测中尤其相关[19]。
2.2. CRC中的EGFR信号通路
2.2.1. RAS/RAF/MAPK/ERK通路
RAS/RAF/MAPK/ERK通路在肿瘤细胞存活和发育中起着至关重要的作用，ERK影响肿瘤增殖、侵袭、转移、细胞外基质降解和血管生成[20]。配体与EGFR结合激活其细胞内酪氨酸激酶，然后磷酸化受体。磷酸化的EGFR然后结合GRB2，GRB2也结合SOS，导致复合物形成[21,22]。该复合物促进RAS上的GDP-GTP交换，激活RAF激酶(包括BRAF)。然后RAF磷酸化MEK，MEK又磷酸化ERK，放大信号并驱动促进肿瘤发生的转录程序[23]。RAF、MEK和ERK是丝氨酸/苏氨酸选择性蛋白激酶。它们形成级联反应，导致显著的信号放大。然而，这种级联反应可以通过负反馈进行控制。KRAS或BRAF的突变破坏负反馈调节，导致通路组成性激活和不受控制的肿瘤生长[23]。虽然ERK活性是正常细胞发育所必需的，但它的过度激活是癌症进展的主要因素，强调了该级联在CRC生物学中的重要性。
2.2.2. PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路
PI3K/AKT/mTOR通路是CRC中另一个关键信号轴，调节蛋白质合成、代谢和细胞存活。在EGFR激活后，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)磷酸化膜脂以生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP3将AKT招募到质膜。AKT随后被激活并磷酸化下游底物，包括mTOR，mTOR是蛋白质翻译和细胞周期进程的关键调节因子。PTEN，一种肿瘤抑制因子，通常通过去磷酸化PIP3来拮抗PI3K活性。PTEN的功能丧失突变或PIK3CA的激活突变(存在于10–20%的CRC病例中)导致通路不受控制的激活[24]。临床上，磷酸化AKT已持续与多种恶性肿瘤(包括CRC)的不良预后相关，凸显了其作为生物标志物和治疗靶点的相关性[25]。
2.2.3. 其他通路和串扰
除了这两个重要级联，EGFR信号还涉及JAK/STAT通路，特别是STAT3[26]，它调节参与增殖、血管生成和免疫逃逸的基因转录[27,28]。磷脂酶C-γ(PLCγ)通路有助于钙信号传导和蛋白激酶C激活，而配体非依赖性的EGFR信号可通过受体向细胞核的易位发生，在那里它直接调节与DNA修复和细胞周期进程相关的基因表达[29]。这些通路之间广泛的串扰使得当一个级联被抑制时能够进行补偿性信号传导，代表了治疗耐药性的一种主要机制30。
- CRC中的抗EGFR治疗格局
3.1. 已批准的单克隆抗体
单克隆抗体西妥昔单抗和帕尼单抗代表了mCRC中EGFR靶向治疗的基石。两者都以高亲和力结合EGFR的胞外结构域III，阻止配体结合，阻断受体自磷酸化，并促进受体内化和降解[31]。对抗EGFR抗体的临床敏感性不仅取决于阻断受体激活，还取决于EGFR被内化和降解的程度。在抗体结合后未能实现足够受体耗竭的肿瘤通常表现出原发性耐药[32]。免疫球蛋白同种型的结构差异赋予了不同的免疫学特性。西妥昔单抗是一种嵌合小鼠/人IgG1抗体，能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，增加了免疫介导的肿瘤控制机制。相比之下，帕尼单抗是一种完全人源化的IgG2抗体，可减少输注相关反应，但缺乏显著的ADCC活性[31]。两种药物最初均基于在化疗难治性疾病中的疗效获批。关键的BOND试验证明了西妥昔单抗可改善应答率和生存期[33]，而早期的帕尼单抗研究则证实了其在重度预处理患者中的活性[34]。
3.2. 联合策略和临床整合
现代抗EGFR治疗的使用已果断转向联合方案。单药治疗现已罕见，因为将抗EGFR抗体与化疗双药联合可提供更优的结局。在mCRC中，最常见的双药是FOLFOX(氟尿嘧啶/亚叶酸钙加奥沙利铂)或FOLFIRI(氟尿嘧啶/亚叶酸钙加伊立替康)。这两种方案都利用了氟尿嘧啶对DNA合成的细胞毒性作用，奥沙利铂诱导DNA交联和凋亡，伊立替康抑制拓扑异构酶I阻止DNA复制和转录。这些方案构成了mCRC一线治疗的标准骨架，并经常与抗EGFR单克隆抗体联合使用。CRYSTAL试验显示，西妥昔单抗联合FOLFIRI相比单独FOLFIRI改善了总缓解率(ORR)(ORR，59.3% vs. 43.2%；比值比，1.91；95%置信区间[CI]，1.24至2.93)和无进展生存期(PFS)(中位PFS，8.9 vs. 8.0个月；风险比，0.85；95% CI，0.72至0.99；p = 0.048)[5]，而PRIME试验表明帕尼单抗联合FOLFOX相比单独FOLFOX显著延长了PFS(中位PFS，9.6 vs. 8.0个月；风险比，0.80；95% CI，0.66至0.97；p = 0.02)[35]。在左侧、RAS WT mCRC的一线治疗中，这些组合实现了约60%的ORR和9–10个月的中位PFS[5,35]。与抗VEGF治疗的头对头比较进一步优化了患者选择。具有里程碑意义的PARADIGM试验(日本，2022年)提供了确凿证据，在RAS WT、左侧mCRC患者中，帕尼单抗联合mFOLFOX6相比贝伐珠单抗联合mFOLFOX6显著改善了总生存期(OS)(风险比，0.82；95% CI 0.68–0.99；p = 0.031)[36]。对FIRE-3和CALGB/SWOG 80405的回顾性分析，以及真实世界研究，一致表明左侧RAS WT肿瘤从抗EGFR治疗中获益显著，与贝伐珠单抗相比具有更高的ORR(74% vs. 62%；比值比，1.77；95% CI，1.39–2.26；p < 0.0001)和更长的OS(风险比，0.77；95% CI，0.68–0.88；p < 0.0001)[37]。相比之下，右侧肿瘤，通常携带BRAF突变和CMS1生物学特征，即使RAS WT，应答也较差[38,39,40]。对于这些患者，抗VEGF治疗仍然是标准。分子前提同样重要。扩展的RAS检测(KRAS和NRAS外显子2–4)是强制性的，因为激活突变使得EGFR阻断无效。BRAF V600E突变，存在于8–12%的mCRC中，预后不良，并且对单药EGFR抑制剂耐药[41]。联合策略如恩考芬尼加西妥昔单抗±比美替尼(BEACON试验)和恩考芬尼加西妥昔单抗联合mFOLFOX6(BREAKWATER试验)正在重塑这一亚组的治疗范式[42,43]。最近，KRAS G12C抑制剂如adagrasib和sotorasib，虽然在CRC中作为单药治疗活性适中，但联合抗EGFR治疗时显示出增强的疗效，突显了基因型特异性组合的扩展作用[44]。在一线治疗之外，抗EGFR治疗在维持治疗和再挑战策略中继续发挥作用。诸如VALENTINO和PANAMA等试验表明，在初始FOLFOX加帕尼单抗治疗后，停用奥沙利铂并继续使用氟尿嘧啶(氟尿嘧啶/亚叶酸钙)加帕尼单抗有助于在降低毒性的同时维持疾病控制[45,46]。再挑战的概念也变得越来越重要。通过使用ctDNA检测来监测当停止抗EGFR治疗后耐药RAS或EGFR突变何时消退，临床医生可以识别出可能从重新开始治疗中获益的患者。诸如CRICKET和CAVE等研究表明，这种方法可以改善ORR和OS[47,48]。这些试验的总结见表1。
- 抗EGFR治疗应答的预测性生物标志物
抗EGFR治疗应答的预测性生物标志物及其各自的含义总结于表2。
4.1. RAS和BRAF突变：已建立的生物标志物
RAS突变预测抗EGFR治疗耐药的发现是CRC精准肿瘤学的一个里程碑式成就。最初，只有KRAS外显子2(密码子12和13)突变被认为是阴性预测生物标志物[51]。然而，将RAS检测扩展到包括KRAS外显子3和4以及NRAS外显子2、3和4后发现，约15–20%被归类为KRAS外显子2 WT的肿瘤携带额外的RAS突变，同样导致耐药[52]。总的来说，RAS突变发生在约50%的CRC病例中，这些患者由于下游MAPK信号通路独立于EGFR状态的组成性激活，无法从抗EGFR治疗中获益53,54。BRAF V600E突变，存在于8–12%的mCRC病例中，与不良预后和侵袭性疾病生物学相关[41]。虽然最初被认为类似于RAS突变的抗EGFR耐药标志物，但BRAF V600E的预测价值已被证明更为复杂。耐药并非绝对，但需要靶向联合治疗(BRAF + MEK + EGFR抑制剂)才能获得临床获益，如BEACON CRC(NCT02928224)[42]和BREAKWATER(NCT04607421)[43]试验所示。其他BRAF突变(非V600E，II/III类)可能不会产生相同程度的耐药，需要个体化的治疗考虑。
4.2. MSI-H/dMMR状态
错配修复缺陷(dMMR)或微卫星不稳定性高(MSI-H)肿瘤通常对抗EGFR治疗无应答，即使RAS WT。它们的高突变负荷和频繁的亚克隆耐药驱动因素使免疫检查点抑制剂成为首选方案，将MSI状态定位为强阴性预测生物标志物[55]。
4.3. 阴性超选择和扩展耐药面板
虽然RAS和BRAF V600E检测有效地将约50%的患者排除在抗EGFR治疗之外，但仍有相当比例的RAS/BRAF WT患者治疗失败[56]。“阴性超选择”的概念应运而生，以识别RAS/BRAF WT人群中的额外耐药机制。PRESSING面板包括HER2(扩增或激活突变)、MET扩增、NTRK/ROS1/RET融合、PIK3CA外显子20突变、PTEN失活改变、AKT1突变、EGFR胞外结构域(EGFR-ECD)突变和MAP2K1突变[57]。实施阴性超选择的研究表明，24–30%的RAS/BRAF WT患者携带至少一种额外的耐药改变[58,59]。Pietrantonio等人[58]报告，在无额外耐药改变的超选择患者中，ORR为71%，中位PFS为12.8个月，而存在基因改变的患者ORR为51%，PFS为7.6个月。同样，Randon等人[60]报告，在无PRESSING2改变的超选择RAS/BRAF WT、微卫星稳定患者中，中位PFS为12.8个月，而携带PRESSING2定义的耐药驱动因素的患者仅为6.8个月，表明这些额外的基因组改变显著恶化抗EGFR治疗的结局。全面的基因组分析显示，当应用广泛的面板时，近一半的RAS/BRAF WT肿瘤患者携带替代性耐药生物标志物[61]。这既强调了CRC的分子异质性，也强调了全面分子分析在优化抗EGFR治疗选择中的潜在价值，尽管必须解决包括成本、组织可用性和周转时间在内的实施挑战。
4.4. HER2扩增
HER2扩增，存在于2–4%的RAS WT mCRC中，提供了一种替代性存活信号，并预测对抗EGFR治疗的耐药[62]。重要的是，它是HER2靶向治疗(如trastuzumab deruxtecan)的阳性预测因子，这在DESTINY-CRC01(NCT03384940)[63]和DESTINY-CRC02(NCT04744831)[64]中得到验证。
4.5. EGFR配体：AREG和EREG作为预测性生物标志物
AREG和EREG已成为抗EGFR治疗应答的有前景的预测性生物标志物。这些EGFR配体在CRC中经常过表达，并且它们的表达升高与RAS WT患者抗EGFR治疗后的改善结局相关[65]。其生物学原理是，具有高AREG/EREG表达的肿瘤表现出“EGFR成瘾”，使其更依赖EGFR信号传导，因此对其抑制更敏感[66]。多项回顾性和前瞻性研究表明，原发肿瘤中AREG和EREG的高mRNA表达与接受抗EGFR治疗患者的更优ORR、PFS和OS相关[67,68]。重要的是，AREG/EREG状态似乎提供了超越RAS突变状态的独立预测价值，可能有助于识别最有可能从治疗中获益的RAS WT患者亚群。临床实施中仍存在挑战，包括缺乏标准化检测、临界值变异以及关于最佳样本来源(原发肿瘤与转移灶)的不确定性。多数验证研究是回顾性的，专门设计用于测试AREG/EREG指导治疗选择的前瞻性试验有限[19]。正在进行的开发稳健、临床验证检测的努力可能使AREG/EREG成为多生物标志物方法中优化抗EGFR治疗选择的宝贵组成部分。
4.6. 共识分子亚型(CMS)和侧向性
除了单个基因改变，转录组分析已识别出CRC的四种CMS，每种都具有独特的生物学和治疗意义。CMS2(经典/上皮)肿瘤，以WNT和MYC通路激活为特征，高度依赖EGFR，并持续从抗EGFR治疗中获益[69,70]。相比之下，CMS1(免疫)和CMS4(间充质)亚型与EGFR阻断的内在耐药相关，CMS1肿瘤通常具有高突变负荷和免疫浸润，而CMS4肿瘤表现出基质激活和上皮间质转化，两者都削弱了EGFR依赖性。CMS3(代谢)亚型可能从抗EGFR治疗中获益，但结局不如CMS2一致。
4.7. 肿瘤侧向性：解剖学和遗传学差异
虽然不是一个单一的分子生物标志物，但原发肿瘤位置(侧向性)已成为抗EGFR治疗应答的有力临床预测因子[40]。左侧RAS WT肿瘤持续获得显著获益，而右侧肿瘤大多耐药。这种区别反映了源于胚胎学和分子进化的潜在生物学差异。近端结肠(盲肠、升结肠和近端三分之二横结肠)起源于中肠，由肠系膜上动脉供血，而远端结肠(远端三分之一横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠)起源于后肠，由肠系膜下动脉供血。这种胚胎学差异建立了不同的血管供应、淋巴引流和上皮生物学，这些共同导致了不同的肿瘤发生途径[71]。右侧(近端)结肠癌更常通过锯齿状瘤变途径发生，其特征是CpG岛甲基化表型(CIMP)、MLH1的表观遗传沉默和高微卫星不稳定性(MSI-H/dMMR)。这些肿瘤通常携带BRAF V600E突变、PIK3CA改变、CMS1免疫亚型生物学，并表现出具有高肿瘤突变负荷的超突变景观，与较差的预后相关，但增强了免疫检查点阻断的敏感性。相比之下，左侧肿瘤主要通过染色体不稳定(CIN)途径演变，遵循经典的腺瘤-癌序列，伴有APC缺失、KRAS激活和TP53/SMAD4失活。它们通常是微卫星稳定，富含EGFR配体表达(AREG/EREG)，表现出CMS2经典亚型生物学，并且更常为RAS WT，这解释了当RAS/BRAF WT时，它们对EGFR信号传导的更大依赖性以及对抗EGFR治疗的更优应答[38,39,40]。此外，右侧结肠暴露于更高浓度的胆汁酸和富含促炎微生物群(如具核梭杆菌)的环境，这些微生物促进诱变和免疫逃逸[71]。相比之下，左侧结肠更受Wnt/β-catenin信号传导和上皮更新动态的影响。因此，侧向性不仅仅是解剖学上的，而是反映了决定预后并指导治疗选择的更深层次的胚胎学、分子和微环境异质性。左侧肿瘤对抗EGFR治疗应答更好，而右侧肿瘤通常从抗VEGF策略或MSI-H/dMMR情况下的免疫治疗中获益更多38,39,40。
- 液体活检和循环肿瘤DNA(ctDNA)应用
液体活检和ctDNA分析的引入彻底改变了mCRC中的分子评估，解决了组织检测的多个局限性。与静态组织检测不同，液体活检提供微创采样，捕获来自多个转移部位的肿瘤异质性，能够实时监测分子进化，并允许在整个治疗过程中进行连续评估[72]。这些特征使ctDNA成为一种检测方法和动态生物标志物。在抗EGFR治疗的背景下，ctDNA分析对三种应用特别有价值：(1) 开始治疗的基线选择，(2) 治疗应答的早期评估，以及(3) 再挑战治疗候选者的识别[73,74]。
5.1. 基线选择
液体活检和ctDNA可以识别RAS和BRAF突变，与组织检测具有高度一致性(当ctDNA肿瘤分数≥1%时，一致性≈90%)。重要的是，ctDNA可能检测到存在于转移部位但原发肿瘤中不存在的耐药突变，从而避免无效的抗EGFR治疗[75,76]。PARERE试验表明，34%组织RAS/BRAF WT肿瘤的患者在基线ctDNA中携带RAS/BRAF突变，另外30%具有其他潜在耐药改变[77]。因此，ctDNA通过在治疗开始前揭示隐藏的耐药驱动因素来增强患者选择。
5.2. 早期应答监测
连续ctDNA监测提供了治疗效果的动态信息。PLATFORM-B研究表明，在第3周期时ctDNA主干突变的减少强烈预测了PFS(HR = 0.23，p = 0.001)[78]。耐药RAS/BRAF突变分数的升高先于临床进展，允许在影像学进展前数月进行检测。具有“早期分子应答”的患者达到77.5%的应答率，而“早期分子进展”患者为25%(p = 0.008)。因此，ctDNA作为治疗有效性和进展风险的早期替代标志物。
5.3. 再挑战治疗
对抗EGFR治疗的耐药通常源于获得性RAS或EGFR-ECD突变，这些突变在停药后会消退。CITRIC试验(EudraCT 2020-000443-31)[79]证实，ctDNA中RAS、BRAF和EGFR-ECD突变的清除预测了再挑战的获益。与仍为ctDNA阳性的患者相比，ctDNA确认清除的患者PFS显著改善，将ctDNA清除确立为启动三线再挑战的验证性生物标志物。同样，在RASINTRO研究(NCT03259009)[80]中，在难治性疾病中，抗EGFR再挑战在基线ctDNA RAS/BRAF WT的患者中更有效，特别是在显示早期分子应答(ctDNA显著下降>50%)的患者中。总之，这些发现将ctDNA清除定位为再挑战资格和早期治疗监测的预测性生物标志物。
5.4. 新兴应用
新兴的循环生物标志物如循环非编码RNA(例如，circ-EGFR)也在研究中。这些分子在肿瘤微环境中充当microRNA海绵。早期研究表明，circ-EGFR可以通过简单的血液检测预测西妥昔单抗应答。这些新兴检测方法可能将液体活检的范围从DNA突变扩展到基于RNA的预测工具[81]。
- 耐药机制
尽管有靶向药物如西妥昔单抗和帕尼单抗可用，但耐药仍然是一个主要问题[56]。虽然这些药物改善了非突变KRAS WT mCRC患者的生存期，但它们仅对一部分患者有效[56,82,83]。对这些抑制剂的耐药是不可避免的，通常由于多种分子机制而在1–2年内发生[17,84]。
6.1. 原发性耐药
近年来，已鉴定出EGFR和EGFR特异性配体中的某些改变导致原发性(固有)耐药[85,86]。
6.1.1. RAS家族突变
RAS是编码GTP结合蛋白(如KRAS、NRAS和HRAS)的基因家族。这些蛋白在EGFR相关信号通路中发挥重要作用[87,88]。RAS基因的突变可导致效应通路的下游激活。这些突变在CRC中很常见，约50%的CRC患者为阳性[89,90]。外显子2-KRAS突变：外显子2 KRAS突变占所有KRAS突变的85–90%[87]。多项试验表明，携带KRAS外显子2突变的患者对抗EGFR治疗应答不佳[91,92]。扩展RAS：NRAS和其他KRAS突变：在随机III期CRYSTAL研究的更新分析中，研究人员重新评估了KRAS外显子2 WT肿瘤患者，以检查KRAS外显子3和4以及NRAS外显子2、3和4中的额外RAS突变。Van Cutsem等人发现，约15%的这些患者实际上携带这些扩展突变。这些突变的存在预测了在西妥昔单抗联合化疗中应答不佳，PFS(7.2 vs. 6.9个月，HR = 0.81，p = 0.56)或OS(18.2 vs. 20.7个月，HR = 1.22，p = 0.50)未见显著改善[93]。
6.1.2. RAF家族突变
如上所述，一小部分WT RAS突变患者对抗EGFR治疗无应答。这些患者通常在EGFR信号通路下游有突变。其中包括BRAF突变，最常见的是V600E等位基因[94]。该突变导致丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路激活，导致不可控制的细胞增殖95。
6.1.3. PIK3CA/PTEN信号通路激活
EGFR的另一个下游通路是PIK3CA/PTEN信号通路。PIK3CA的突变和PTEN表达的缺失常导致这些通路激活，最终导致肿瘤形成。这通常是EGFR非依赖性的，因此对EGFR抑制无应答[96]。
6.1.4. JAK/STAT信号通路激活
JAK和STAT是参与细胞增殖、分化和凋亡的细胞因子受体信号组分[97]。STAT3是一种转录因子，在某些癌症(包括CRC)中上调[97]。由JAK依赖的细胞因子信号(自分泌和旁分泌)以及酪氨酸激酶如SRC和EGFR驱动的持续STAT3激活可驱动癌症发展。它显著促进肿瘤形成、血管生长、组织侵袭、转移和免疫逃逸[98]。
6.1.5. 上皮间质转化(EMT)
EMT是一个复杂的过程，其中上皮细胞转化并获得间充质特征[99,100]。Buck等人表明，维持严格上皮表型的CRC模型对抗EGFR治疗的敏感性是经历EMT的模型的7倍[101]。这可以通过EGFR依赖性来解释；上皮CRC细胞维持对EGFR-RAS-MAPK信号传导的强烈依赖以进行增殖和存活。其完整的上皮表型，包括E-cadherin介导的粘附，保留了受体表达和下游通路激活，使其高度易受EGFR阻断的影响[101]。相比之下，在EMT过程中，肿瘤细胞经历转录重编程，减少EGFR依赖性并激活旁路通路，如MET、TGF β、PI3K和基质相互作用[102]。这种转变削弱了EGFR依赖性并赋予对抗EGFR治疗的耐药性。EMT也可以在治疗过程中出现。Lin等人[103]证明Smad4缺失促进EMT并减弱西妥昔单抗敏感性，而Bray等人[104]在患者样本中观察到在获得西妥昔单抗耐药时EMT标志物增加。
6.2. 获得性耐药
几乎所有转移性CRC患者最初对抗EGFR治疗有应答，但大多数肿瘤在3–12个月内进展[105]。获得性耐药的机制如下：
- RAS/RAF信号通路中的获得性突变：除了在原发性耐药中的作用，KRAS突变占获得性耐药病例的50%[106]。Misale等人表明，在10例西妥昔单抗治疗后进展的KRAS WT转移性CRC患者中，6例产生了KRAS突变[107]。
- 替代性生长因子受体通路的激活：肿瘤通过上调替代信号通路来逃避EGFR抑制，这些通路包括：
6.2.1. IGF-1R通路激活：IGF-1R是属于跨膜酪氨酸激酶家族的受体之一。其与配体结合后，激活RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT通路[108,109]。IGF-1R与EGFR通路之间存在强关联，因为IGF-1R信号已被证明可增加EGFR的激活[110,111,112]。
6.2.2. MET过表达：MET癌基因是编码肝细胞生长因子(HGF)的酪氨酸激酶受体的基因。该受体的激活启动一系列细胞内信号通路，包括PI3K/AKT、RAC1/细胞分裂控制蛋白42(CDC42)，驱动细胞增殖和存活113。
6.2.3. HER2扩增：HER2是一种受体酪氨酸激酶，属于与EGFR相同的家族，即HER家族。HER2结合导致与EGFR共同的信号通路激活，包括MAPK和PI3K/AKT通路[114]。Bertotti等人分析了mCRC异种移植模型中的基因型-应答相关性，发现HER2基因扩增与西妥昔单抗耐药特异性相关，并且这种耐药可以通过给予HER2抑制剂来克服115。
6.2.4. EGFR S492R突变：S492R突变最初由Montagut等人[116]鉴定为一种获得性EGFR胞外结构域突变，在西妥昔单抗治疗的选择压力下出现现。从机制上讲，第492位的丝氨酸被精氨酸取代发生在EGFR结构域III内，该结构域是西妥昔单抗的结合位点。这种氨基酸替换改变了受体构象并破坏了抗体-受体界面，阻止西妥昔单抗有效结合。结果，西妥昔单抗失去了其抑制效应[117,118]。重要的是，帕尼单抗结合EGFR上不同的表位，并对携带S492R突变的肿瘤保持活性，这解释了为什么具有这种突变的患者可能仍然对帕尼单抗有应答，但对西妥昔单抗无应答[116,119]。这一机制进一步得到结构研究的证实，包括Sickmier等人[119]的研究，该研究表明S492R突变(根据编号惯例也称为S468R)阻断了西妥昔单抗与EGFR结构域III的结合。总之，这些发现确立了EGFR S492R作为西妥昔单抗获得性耐药的临床相关机制。
6.2.5. VEGF信号通路改变
血管内皮生长因子是一种驱动血管生成的信号分子。它与三种不同的受体结合：VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。这些受体介导血管增殖和通透性的变化[120]。Bianco等人观察到，西妥昔单抗耐药细胞分泌的VEGF和VEGFR1水平高于亲本的西妥昔单抗敏感细胞[121]。
- 克服耐药的策略
已经开发了几种策略来克服CRC中对抗EGFR治疗的原发性和获得性耐药，重点在于联合治疗、分子指导的再挑战和新型靶向方法。
7.1. 再挑战策略
当与基于血液的分子检测结合时，抗EGFR抗体的再挑战是一种简单而有效的治疗方法。来自四项试验(CAVE、VELO、CRICKET和CHRONOS)的汇总分析评估了114名难治性mCRC患者(ctDNA RAS/BRAF WT)的抗EGFR再挑战。再挑战产生了17.5%的总缓解率和72.3%的疾病控制率，中位PFS为4.0个月，中位OS为13.1个月。值得注意的是，无肝转移的患者PFS和OS显著更长，表明转移部位可能影响获益[122]。此外，一项系统综述和荟萃分析评估了mCRC中的抗EGFR再挑战，包括13项临床研究中的402名患者，大多接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。汇总分析报告了20.5%的客观缓解率、67.4%的疾病控制率、3.5个月的中位PFS和9.8个月的中位OS。ctDNA RAS WT的患者获益最大，突显了ctDNA指导患者选择的作用[123]。另一项对14项研究(包括520名患者)的系统综述评估了mCRC中的抗EGFR再挑战。汇总分析显示客观缓解率为17.7%，疾病控制率为61.7%，中位PFS为2.4–4.9个月，中位OS为5–17.8个月[124]。
7.2. KRAS突变
已经研究了纳入KRAS抑制剂的策略以克服耐药。Adagrasib，一种KRAS-G12C抑制剂，在一项1/2期试验中进行了研究。经预处理的KRAS-G12C突变mCRC患者接受了adagrasib单药治疗或adagrasib联合西妥昔单抗。客观缓解率(ORR)分别为19%和46%，中位缓解持续时间(DOR)为4.3个月和7.6个月，中位PFS为5.6个月和6.9个月[125]。同样，sotorasib是另一种在mCRC中研究的KRAS-G12C抑制剂。在III期CodeBreaK 300试验中，160名经预处理的KRAS G12C突变mCRC患者被随机分配接受sotorasib 960 mg加帕尼单抗、sotorasib 240 mg加帕尼单抗，或研究者选择(trifluridine/tipiracil或regorafenib)。中位随访13.6个月后，客观缓解率分别为30.2%、7.5%和1.9%，960 mg组的中位OS未达到，240 mg组为11.9个月，研究者选择组为10.3个月[126]。高剂量静脉注射(非口服)维生素C可以通过利用其改变的葡萄糖代谢，选择性地诱导KRAS和BRAF突变CRC细胞凋亡。这些突变细胞显示GLUT1表达增加，并强烈依赖有氧糖酵解(Warburg效应)来满足能量和生物合成需求。维生素C的氧化形式脱氢抗坏血酸(DHA)通过GLUT1/GLUT3转运蛋白进入细胞，并被还原回维生素C，消耗谷胱甘肽、硫氧还蛋白和NADPH，导致ROS积累、GAPDH抑制和能量危机，从而触发细胞死亡(图2)。维生素C还通过将RAS从质膜置换、阻断PKM2磷酸化和降低GLUT1水平来干扰糖酵解，进一步限制糖酵解活性。这种双重代谢破坏可能使KRAS和BRAF突变细胞对治疗敏感，并帮助克服对抗EGFR治疗的耐药[127]。一项针对未经治疗的mCRC的III期随机试验比较了标准化疗(FOLFOX ± 贝伐珠单抗)加或不加高剂量静脉注射维生素C(1.5 g/kg/天，持续3天)。在整个队列中，添加维生素C并未改善PFS、OS或应答率。然而，在预设的亚组分析中，RAS突变肿瘤患者在维生素C联合化疗时显示出显著的PFS获益(9.2 vs. 7.8个月；p = 0.01)，表明在这个分子亚群中可能存在选择性优势。
7.3. BRAF突变
与黑色素瘤相反，单独使用BRAF抑制剂在CRC中取得了适度的结果[128]。然而，BRAF抑制剂与其他药物的联合使用显示出改善的结局。例如，在BEACON试验中，患者被随机分配接受恩考芬尼、比美替尼和西妥昔单抗的三联疗法，或恩考芬尼和西妥昔单抗的双联疗法，或西妥昔单抗化疗。三联疗法的中位OS为9.0个月，对照组为5.4个月，确认的应答率为26%，对照组为2%。恩考芬尼和西妥昔单抗的双联疗法也改善了生存期(中位OS 8.4个月)[42]。此外，BREAKWATER试验比较了恩考芬尼加西妥昔单抗联合mFOLFOX6与标准治疗(化疗加或不加贝伐珠单抗)在未经治疗的BRAF突变mCRC患者中的疗效。西妥昔单抗 + mFOLFOX6显著改善了中位PFS(12.8 vs. 7.1个月；p < 0.001)和OS(30.3 vs. 15.1个月；p < 0.001)[43]。CodeBreak 301是一项正在进行的III期试验，研究sotorasib、帕尼单抗和FOLFIRI与FOLFIRI加或不加贝伐珠单抗在一线治疗中的疗效[129]。
7.4. EGFR突变
EGFR突变在CRC中是一种罕见的突变，但它可能对预后和治疗产生重大影响。在基线时，外显子18至21的EGFR突变发生率分别为2.6%、0.5%、0.8%和3.8%[130]。然而，某些EGFR突变的频率可能在使用抗EGFR抗体治疗后增加。例如，一项研究报告称，EGFR p.S492R突变在基线时不存在，但在帕尼单抗治疗后以1%的频率出现，在西妥昔单抗治疗后以16%的频率出现[131]。EGFR突变导致对西妥昔单抗耐药，但根据具体突变，帕尼单抗可能仍然有效。例如，S492R、K467T和R451C等突变可能对帕尼单抗有应答，而G465E、S464L、G465R和I491M与耐药相关[118,132]。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在mCRC中的使用已得到研究。在未选择的患者中，使用厄洛替尼作为维持治疗或拉帕替尼联合卡培他滨并未产生任何显著结果[133,134]。但在EGFR突变患者中，有病例报告证实奥希替尼的疗效，应答可能持续一年以上[135,136]。
7.5. PI3K/AKT通路，包括激活的PIK3CA突变和PTEN缺失
PI3K/AKT通路的改变，包括激活的PIK3CA突变和PTEN缺失，通过激活与EGFR-MAPK信号平行的生存信号通路，导致对抗EGFR治疗的耐药。这些异常可能发生在RAS WT肿瘤中，并部分解释了西妥昔单抗和帕尼单抗的异质性应答，特别是PIK3CA外显子20突变与降低的应答和更差的结局相关[137]。此外，PTEN表达的缺失解除了对PI3K通路的负调控并导致组成性AKT激活，也与对抗EGFR治疗的应答受损相关[138]。评估PI3K或AKT抑制剂作为单药或联合用药的早期临床试验显示出有限的临床活性和适度的疗效，主要受限于毒性。这些药物在未选择的CRC人群中未显示出足够的获益以推进到成功的III期开发，强调了需要改进生物标志物驱动的患者选择和合理的联合策略[139]。
7.6. 人表皮生长因子受体2(HER-2)扩增
HER2扩增通过激活独立于EGFR的平行ERBB家族信号通路，维持下游MAPK和PI3K/AKT信号传导，即使在RAS/BRAF WT肿瘤的mCRC患者中，也使西妥昔单抗和帕尼单抗效果降低，从而作为EGFR抑制剂的旁路耐药机制发挥作用[62]。HER2扩增存在于约2–4%的mCRC中[62]。几项研究已经研究了mCRC中的HER-2阻断。在MyPathway篮子研究中，治疗难治性、HER2扩增的mCRC患者接受了帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的双重HER2阻断。在57名可评估患者中，主要终点ORR为32%，包括1例完全缓解和17例部分缓解[140]。另一项研究(II期)将RAS/BRAF WT、HER2阳性mCRC患者随机分配接受曲妥珠单抗加帕妥珠单抗或西妥昔单抗加伊立替康，并在进展后允许交叉至双重HER2阻断。尽管主要终点中位PFS在治疗组之间相似(分别为4.7 vs. 3.7个月)，但双重HER2抑制实现了更高的ORR(34.6% vs. 28%)，注意到对治疗有应答的患者与无应答者相比，HER2/CEP17比值(14.7 vs. 6.5；p = 0.005)和基因拷贝数(29.7 vs. 13.2，p = 0.004)显著更高[141]。HERACLES-A评估了曲妥珠单抗和拉帕替尼双重HER2阻断在KRAS WT、化疗难治性HER2阳性mCRC患者中的疗效。在32名可评估患者中，客观缓解率为28%，包括1例完全缓解和8例部分缓解，另有41%达到疾病稳定。中位PFS为4.7个月，中位OS为10.0个月，1例患者在超过7年的随访中维持完全缓解[142]。HERACLES-B是另一项单臂II期试验，评估帕妥珠单抗和曲妥珠单抗-emtansine(T-DM1)双重HER2靶向治疗在标准治疗难治的RAS/BRAF WT、HER2阳性mCRC患者中的疗效。31名重度预处理患者接受帕妥珠单抗加T-DM1直至进展或出现毒性，主要终点为客观缓解率。该试验未达到其预设的ORR阈值，ORR为9.7%，但观察到高疾病控制率(67.7%)和4.1个月的中位PFS。值得注意的是，在HER2表达3+的肿瘤中，持续超过4个月的临床获益(应答或疾病稳定)显著高于表达较低(2+)的肿瘤(p = 0.03)[143]。DESTINY-CRC02是一项多中心、随机II期研究，评估两种剂量的抗体-药物偶联物trastuzumab deruxtecan(5.4 mg/kg vs. 6.4 mg/kg)在重度预处理、HER2阳性mCRC患者(包括RAS WT和RAS突变肿瘤)中的疗效，主要终点为ORR。Trastuzumab deruxtecan显示出抗肿瘤活性，5.4 mg/kg剂量的ORR为37.8%，而6.4 mg/kg为27.6%。亚组分析未显示KRAS突变和KRAS WT患者之间的差异[64]。此外，HER-2检测可以使用ctDNA进行。一项II期研究评估了帕妥珠单抗和曲妥珠单抗双重HER2阻断在通过肿瘤组织或循环肿瘤DNA基因分型选择HER2扩增的mCRC患者中的疗效。该试验达到了其主要终点，在组织阳性(30%)和ctDNA阳性(28%)患者中显示出相当的客观缓解率，而在接受标准挽救治疗的匹配真实世界对照队列中未观察到应答[144]。
7.7. MET扩增和HGF过表达
MET的扩增或其配体HGF的过表达导致尽管EGFR被抑制，MAPK和PI3K通路仍被激活，促进肿瘤生长和存活[145,146]。这种机制主要与初始抗EGFR治疗应答后的获得性耐药相关[145]。临床前数据支持联合抑制EGFR和MET作为克服这种耐药通路的策略[146]。
7.8. 肿瘤异质性和克隆进化
在接受抗EGFR治疗的mCRC患者中，循环肿瘤DNA分析揭示了携带KRAS、NRAS、MET、ERBB2、FLT3、EGFR和MAP2K1突变的耐药亚克隆的增殖。这些改变在停用EGFR抑制后通常会消退，突显了适应性耐药背后的克隆进化的动态性质。重新引入抗EGFR单克隆抗体可以导致重新获得治疗应答，支持使用基于ctDNA的方法来指导EGFR再挑战147。
- 未来方向
未来在克服mCRC抗EGFR治疗耐药方面的进展将越来越依赖于精细的分子分层、动态生物标志物监测和合理的联合策略。虽然传统的RAS和BRAF检测仍然是初始患者选择的基础，但将全面的基因组分析扩展到包括HER2扩增、MET扩增和其他遗传变异，使得患者超选择策略成为可能。通过这种扩展分子方法选择的患者将获得更高的应答率和改善的临床结局[148]。此外，通过液体活检进行实时监测将通过检测临床进展前的获得性耐药突变来改变管理范式。这将允许个性化的治疗策略，包括治疗中断、治疗转换，或在耐药克隆消退后使用抗EGFR药物进行再挑战[148]。针对EGFR轴和交叉通路的新型治疗方式正在积极研究中。下一代EGFR靶向药物提供了克服经典耐药机制的潜力。寡克隆抗体如MM-151可以结合EGFR胞外结构域的多个区域。这种抗体在对抗EGFR抗体治疗后产生耐药的患者中显示出应答[149]。双特异性抗体如Amivantamab，靶向EGFR-MET，在与化疗联合用于右侧CRC时已显示出疗效[150]。此外，几种抗EGFR抗体药物偶联物正在研究用于治疗CRC[151]。此外，鉴于KRAS代表胰腺癌中的主要致癌驱动因素和抗EGFR治疗耐药的关键介质，新型治疗方法如pan-KRAS抑制剂目前正在积极研究中。这些药物已显示出令人鼓舞的初步活性，可能有助于恢复对EGFR抑制的敏感性，特别是在与抗EGFR治疗联合使用时[152]。
- 结论
EGFR靶向治疗已经改变了mCRC的管理，但其获益仅限于精心选择的患者。RAS和BRAF突变、MSI状态和肿瘤侧向性仍然是耐药的最强预测因子，而较新的生物标志物如PRESSING面板、CMS分类和EGFR配体正在优化患者选择。液体活检和ctDNA监测的兴起是一项重大进步，允许实时跟踪肿瘤进化、早期检测耐药和实施再挑战策略。展望未来，将ctDNA动态与转录组分析和基因型特异性治疗相结合，为克服耐药和延长EGFR阻断的持久性提供了最佳机会。EGFR治疗的未来不在于更广泛的应用，而在于更深的精准，使用更智能的生物标志物策略来最大化获益，避免无效治疗，并改善患者的生存期和生活质量。
作者贡献：概念构思，N.A.和A.S.；方法论，N.A., M.M., H.S., L.A.M.和A.S.；验证，L.A.M.和A.S.；数据整理，N.A., M.M.和H.S.；初稿撰写，N.A., M.M.和H.S.；审阅与编辑，N.A., M.M., H.S., L.A.M.和A.S.；可视化，N.A.；监督，A.S.；项目管理，A.S.。所有作者均已阅读并同意发表的稿件版本。
基金：本研究未获得外部资助。
机构审查委员会声明：不适用。
知情同意声明：不适用。
数据可用性声明：本研究未创建或分析新数据。数据共享不适用于本文。
利益冲突：作者声明无利益冲突。
参考文献：(略，由于篇幅限制，此处省略参考文献列表，但原文中包含完整的参考文献。)
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