摘要
背景
肠道微生物组对维持人体健康和疾病发展至关重要，但对其结构和维持机制的理解有限，阻碍了基于微生物组的健康管理策略的有效实施。我们研究了890名健康韩国人的肠道微生物组组成模式，识别出六个具有独特组成和宿主偏好的集群（I–VI）。
结果
每个集群在微生物相互作用网络中表现出独特的拓扑结构，突显其在维持微生物群落中的不同作用。由拟杆菌属（Bacteroides）和粪杆菌属（Faecalibacterium）主导的集群II在个体间广泛存在，并在网络中心位置。主要由_Oscillospira_和_Coprococcus_组成的集群III与以肠杆菌科和脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）为主的集群IV表现出互斥关系，反映了宿主对不同饮食模式和微生物多样性的偏好。集群V和VI连接不同的微生物群落，而集群I则包含独立的亚群落。
结论
本研究揭示了微生物群落内部复杂的结构和相互作用，为理解肠道微生物组生态学提供了见解，并指导健康提升策略。
背景
肠道微生物组由微生物群（微生物组）、其代谢物和胃肠道中的生物活性分子组成，影响着人类健康和疾病的发展。在胃肠道疾病如艰难梭菌感染（CDI）和炎症性肠病中观察到微生物多样性减少[1, 2]，在肥胖和虚弱相关状况中也观察到类似现象[3, 4]，因此可作为这些疾病的生物标志物。此外，各种疾病患者的肠道微生物组组成也发生了显著变化[5]。例如，艰难梭菌感染通常涉及厚壁菌门和拟杆菌门比例的减少，而炎症性肠病的特点是链球菌和肠球菌比例增加[2, 6]。肥胖与厚壁菌门丰度增加显著相关[7, 8]，而2型糖尿病通常涉及产丁酸菌丰度的减少和机会性病原体丰度的增加[9]。这些发现表明肠道微生物组失调与不良健康状况之间存在复杂联系[10]。
恢复健康个体的微生物组是一种有前途的治疗策略，用于治疗与微生物失衡或破坏相关的疾病。来自健康捐赠者的粪便微生物移植（FMT）已被用于治疗炎症性肠病、糖尿病和癌症等疾病[11, 12]。益生菌和益生元的使用也被建议用于预防和治疗各种疾病，包括炎症性肠病、抑郁症和癌症[13,14,15]。最近，利用明确定义的共生细菌联合疗法出现为一种有前途的策略，可以解决FMT中供体依赖性的局限性，同时通过使用多种细菌菌株恢复核心微生物组结构[12, 16,17,18]。八种成员的联合体（VE303）已显示出预防复发性CDI的效果[19]。同样，来源于健康捐赠者的33种成员联合体（MET-1）在CDI治疗中表现出抗炎效果[20, 21]。
为了制定有效的基于微生物组的策略，进一步理解肠道微生物组群落的复杂性非常重要。一个个体携带300至500个物种，每种产生影响宿主生理的独特代谢物[22]。这种复杂性还因与宿主因素（如年龄、性别、体力活动和饮食）的相互作用而进一步复杂化，这些因素改变了微生物组在维持人类健康中的作用[23]。美国、欧洲、中国和大韩民国的广泛研究努力旨在提高我们对肠道微生物群落结构及其相关因素的理解[24,25,26,27,28]。研究表明微生物组成受宿主因素的影响，如年龄、饮食和体重指数（BMI），尽管这些影响的程度各不相同[25,26,27,28]。
微生物群落内的微生物在多个层面上进行复杂互动，从微生物-微生物相互作用到形成称为肠型的集体结构模式。表征这些结构并考虑微生物相互作用对于制定调节肠道微生物组的策略至关重要。人类肠道微生物群表现出全球结构模式，通常分为三种由拟杆菌属、Segatella属（以前称为普氏菌属）和瘤胃球菌属主导的肠型（ETs）[29]。然而，微生物成对相互作用可以通过共现模式和丰度相关性更精确地检查[24, 28]。这些单独的微生物相互作用共同促成了支持宿主健康的肠道微生物组状态的稳定性和弹性，但它们可能转变为可能对健康产生负面影响的替代状态[30, 31]。鉴于微生物之间的广泛相互作用，将受损的微生物组恢复到健康状态可能涉及引入相互作用的微生物联合体或添加与宿主现有肠道微生物组正向相互作用的微生物。因此，为了将受损的微生物组恢复到健康状态，理解微生物相互作用的各种水平至关重要。
在各种人群中，韩国人口因其独特的饮食模式而特别引人注目。传统韩国饮食以高摄入蔬菜、豆类和鱼、低摄入红肉为特征，并包括独特的烹饪方法，如发酵、煮沸和焯水[32]。这种饮食可以影响微生物组成，与西方饮食模式相比存在差异[33]。在我们之前的研究中，我们展示了特定饮食成分与韩国人肠道微生物群之间的关联，揭示了一种与其他国家人群（包括日本、中国和西班牙）所观察到的不同的微生物概况[28]。
在本研究中，我们旨在通过识别这些群落内的不同子结构来调查肠道微生物群落的组织。这项工作是我们之前对健康韩国队列研究的延伸，在该研究中我们主要关注分类组成及其与宿主因素的关系[28]。我们密切分析了微生物相互作用，以识别由宿主偏好和其相互作用网络中的拓扑特征区分的微生物群。这项研究推进了我们对肠道微生物生态系统结构的理解，并提供了有关可能普遍存在于某些群体中或占据社区中心或外围位置的微生物角色的宝贵见解。这些发现有可能促进旨在调节肠道微生物组以改善人类健康的治疗方法的发展。
结果
微生物特征：扩增序列变异、属和种
韩国肠道微生物数据集来源于890名个体粪便样本的16S扩增子测序，包含44,020个扩增序列变异（ASVs）。通过对每个样本稀疏处理至10,000条读取，这一数量减少到19,632个ASVs（图1a）。这些ASVs被分类为217个属和199个种（图1b, c）。最丰富的前50个属和种分别占总读取数的85%和52%。顶级属和种分别对应于属级和种级注释读取的98%（附加文件1：图S1a）。
图1
序列读取计数分布和分类单位的流行情况。a 测序读取和扩增序列变异（ASVs）的数据流。b-d 属、种和ASV计数及其流行情况（左面板），补充了最丰富或流行的分类群的累积读取分数（右面板）。仅展示在至少10%个体中检测到的ASVs。
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通过信息内容分析识别结构单元
在此分析中，我们试图识别三个不同微生物特征单元（ASVs、属和种）中具有最高信息含量的最佳微生物分类级别，使用香农熵。对于ASVs，过滤掉出现在少于10%样本中的那些，从而专注于436个ASVs（图1和附加文件1：图S1b, c）。关于信息保留，ASVs保留了原始信息含量的75%，而属和种分别保留了71%和44%。ASVs比属分类提供更高的分辨率，因为一个属可能由多个ASVs表示（图1b, d）。根据增强的分辨率和信息量，ASV被选为后续分析的微生物单位。
不同宿主群落中的微生物多样性和组成
应用双聚类分析ASV存在/缺失谱，以调查肠道微生物群的结构及其相关的宿主群。基于同质性，识别出两个宿主群和六个ASV群（图2a和附加文件1：图S2a）。第一个宿主群（HC1，n = 537）包含的ASVs显著少于第二个群（HC2，n = 353）（Mann-Whitney U检验，p < 0.01；图2b），并且表现出较低的Chao1和香农熵（附加文件1：图S2d）。此外，两个宿主群表现出不同的微生物组成；HC1中以_Bacteroides_为主，而HC2中以_Segatella_为主。这些宿主群与我们之前使用UniFrac距离和高斯混合模型研究中识别出的两个ETs相似[28]，其中一个ET以_Bacteroides_为主，另一个以_Segatella_为主。因此，我们检查了宿主群与ETs之间的一致程度。值得注意的是，83%的HC1对应于_Bacteroides_ ET，69%的HC2对应于_Segatella_ ET（附加文件1：图S2b），这表明宿主群与ETs有所不同。Segatella ET包含的ASVs少于_Bacteroides_ ET；然而，它们的分布不如本研究中观察到的宿主群那么明显（图2b和附加文件1：图S2c）。
图2
个体和扩增序列变体（ASVs）的分类。a 蓝色和白色单元格分别代表个体中ASVs的存在和缺失。双聚类揭示了两个个体组和六个ASV组。b 直方图描述了第一宿主群（HC1）和第二宿主群（HC2）中每个个体的ASVs分布。c 绘制了每个ASV的流行率和HC1偏好，以及ASV群的边缘分布。HC1和HC2之间的流行率差异表示为HC1中观察到和预期的ASV频率的对数比值。d 上面四个面板显示了每个ASV群的分类组成，下面的面板显示了每个ASV群的读取计数。
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线性判别效应大小（LEfSe）分析[34]揭示了宿主群之间的显著特征。HC1组的个体消费大量的牛奶、乳制品、面条、面包和饮料，而HC2组的个体消费大量的水果、鱼和土豆（附加文件1：图S2e）。此外，HC2组的个体表现出更大的腰围和BMI，参与更多的体力活动，并且比HC1组的个体年龄更大。这些特征也与ETs相关；然而，关系略有不同，谷物消费与_Bacteroides_ ET相关，而贝类消费与_Segatella_ ET相关（附加文件1：图S2f）。当独立考虑个体特征时，年龄是区分HC1和HC2的最显著因素，HC1组的个体平均比HC2组的个体年轻约7岁（附加文件1：表S1）。每个宿主因素的平均值列在附加文件1：表S1中。
表现出不同宿主偏好和分类组成的微生物群
双聚类将ASVs分组为六个集群，标记为ASV集群I-VI（图2a, c）。这些ASV集群显示了对宿主集群的不同偏好。来自集群I的ASVs在HC2中略为普遍（24%）比在HC1中（18%），其中_Segatella_是最丰富的，其次是_Bacteroides_（图2c, d）。集群II中的ASVs在HC2中更频繁出现，平均流行率为74%，相比之下在HC1中为55%（图2c）。此集群贡献了总读取的最大比例，占40%。主要属是_Phocaeicola_和_Faecalibacterium_，显著代表的物种是_Phocaeicola plebeius_和_Faecalibacterium prausnitzii_（图2d）。来自集群III和VI的ASVs在HC2中比在HC1中更为常见，超过一半的这些ASVs在HC2中出现频率至少是HC1的两倍。ASV集群III主要由_Oscillospira_和_Coprococcus_组成，而ASV集群VI由_Segatella_和_Ruminococcus_组成（图2d）。
ASV集群IV在HC1中更为普遍（平均流行率：37%）比在HC2中（平均流行率，15%）（图2b）。值得注意的是，集群IV中的所有ASVs在HC1中都比在HC2中更常发现。Enterobacteriaceae和_Bacteroides fragilis_在此集群中占主导地位（图2d）。集群V中的ASVs在HC1和HC2之间相对均匀分布，平均流行率分别为27%和26%（图2c）。该组主要由_Bacteroides_组成，特别是_Bacteroides ovatus_（图2d）。
微生物相互作用网络分析
通过构建ASVs之间的相互作用网络并分析不同集群中ASVs的拓扑特征，研究了微生物群落的更细结构。在检查同一集群内的相互作用时，ASV集群II、III、IV和VI表现出高共现模式，所有可能的集群内ASV对中分别有87%、100%、75%和85%显示出显著关联（图3a）。相反，集群I和V中的ASV对分别只有22%和16%显示出显著的集群内共现（图3a）。
图3
微生物关联分析。a ASV集群间的共现，显示显著关联的ASV对（错误发现率[FDR] < 0.05）与所有潜在对的比例。共现对标记为+1，避免对标记为−1。b ASV集群间的定量关联，表示显著关联与所有潜在对的比例。c 显著相关（FDR < 0.05）的ASV对比例相对于所有可能对的比例。d 使用显著共现（FDR < 0.05）和皮尔逊相关系数> 0.3的ASV对构建的ASV交互网络。方向性通过置换测试确定。圆形节点表示ASVs，颜色表示ASV集群，大小表示序列读取计数。e 内向（上图）和外向（下图）交互的分布。f 从一个ASV集群到其他集群的成对交互计数。
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关于跨集群的交互，ASV集群II、III和VI表现出高度的集群间共现，但与ASV集群IV表现出负共现模式（图3a）。相反，ASV集群I和V与其他ASV集群的关联较弱。
考虑到定量关联，15%、17%和19%的所有组内ASV对在ASV集群II、III和IV中分别表现出显著关联（错误发现率[FDR] < 0.05；图3b）。同时考虑共现和定量关联时，我们在ASV集群II、III和IV中识别出强的组内关联（p = 9 × 10⁻¹⁴¹, 4 × 10⁻⁷⁷, 8 × 10⁻⁴⁵，分别是二项式检验，图3c）。此外，每个ASV集群表现出独特的跨集群关联模式。
ASV集群在交互网络中的多样化拓扑位置
为了更好地理解ASV关系，我们使用显示显著共现和定量关联的ASV对构建了定向交互网络（图3c）。使用置换测试估计方向性，该测试确定了一个ASV的存在是否显著增加了遇到另一个ASV的可能性。
集群II中的ASVs紧密位于交互网络的三个区域，并与其他集群中的ASVs形成连接（图3d和附加文件1：图S3a）。此外，ASV集群II表现出许多向外连接，主要指向ASV集群I、V和VI（图3e, f），表明它们的存在可能对这些其他ASVs产生积极影响。
集群III和IV中的ASVs在同一集群内形成了多重连接，但这两个集群彼此断开连接（图3d, f）。集群V和VI中的ASVs广泛分布在网路中，并与其他ASV集群形成连接。具体来说，ASV集群V连接到集群II和IV，这两个集群以更多内向连接为特征而非外向连接（图3f）。类似地，集群VI中的ASVs主要与集群II和III形成内向连接（图3d, f）。集群I中的成员建立了与主网络分离的子网络（图3a和附加文件1：图S3b, c）。
具有高连通性的分类群和ASVs
我们进一步评估了在交互网络中表现出最高交互水平的分类群和ASVs。连通性最高的ASVs主要属于_Oscillospira_属、_Oscillospiraceae_科和Eubacteriales目（图4a）。
图4
按分类群划分的微生物相互作用。a 连接度最高的扩增子序列变体（ASVs）的分类分解。每个图表显示了目、科、属和种级别的前五个分类群，其余单位标记为“其他”，未分类的ASVs标记为“未分类”。b Oscillospira ASV 4和_Oscillospira_ ASV 6之间的子网络，说明具有最多外向连接的ASVs。节点颜色表示ASV的流行率，边界颜色表示外向连接的数量。c 以_Bacteroides ovatus_ ASV 1为中心的交互子网络。d 以_Akkermansia muciniphila_ ASV 1为中心的交互子网络。每个ASV以其最具体的分类名称标记，并按相同分类ASVs中的序列读取排名。
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两个_Oscillospira_ ASVs显示了最多的外向连接，主要与_Oscillospiraceae_和_Bacteroides_ ASVs相连（图4b）。在这两个ASVs周围的子网络中，它们充当中央枢纽，周围环绕着各种其他ASVs。此外，这些_Oscillospira_ ASVs比与其相连的ASVs更为流行。
在_Bacteroides_属中，一个_B. ovatus_ ASV表现出最多的外向连接，与其它_Bacteroides_、Akkermansia muciniphila、Parabacteroides distasonis_和Rikenellaceae ASVs相连（图4c）。这个_B. ovatus ASV连接了两组ASVs，一组以较高的流行率为主要特征，主要属于_Bacteroides_属，另一组以较低的流行率为主要特征，包括不太占主导地位的微生物如_A. muciniphila_和_P. distasonis_（图4c, d）。
Akkermansia muciniphila_因其抗肥胖特性和缓解代谢功能障碍的能力而闻名[35,36,37]；因此，我们重点关注其与其他微生物的相互作用。我们确定了两个_Oscillospira ASVs和一个_Alistipes onderdonkii_ ASV与_A. muciniphila_ ASV相连（图4d）。这些ASVs比_A. muciniphila_ ASV更为丰富和流行。
讨论
本研究揭示了六个不同的微生物集群，每个集群都有特定的与宿主和其他微生物物种的相互作用（图5）。ASV集群III和VI显示出对HC2个体的强烈亲和力，这些个体以食用富含水果、土豆和鱼类的传统饮食及低加工碳水化合物为特征。ASV集群III的主要分类群_Oscillospira_和_Coprococcus_可能与此饮食模式相关，因为它们拥有能够利用膳食纤维的基因[38, 39]。在ASV集群VI中，_Segatella copri_是最丰富的物种，广泛被认为与非西方饮食相关，这种饮食富含抗性淀粉和膳食纤维[40, 41]。这种遗传能力可能影响关联宿主的饮食偏好。这些发现表明，HC2个体的高纤维摄入可以促进ASV集群III和VI相关微生物的生长，从而增强该宿主集群内的微生物多样性。此外，集群III和VI中的_Coprococcus_和_S. copri_通过生产短链脂肪酸对宿主健康做出贡献，这对宿主健康有积极影响[39]。然而，HC2中未观察到明显的健康益处，表明需要额外的临床评估，包括肠道健康和炎症标志物的测量，以全面评估效果。
图5
扩增子序列变体（ASV）集群组织。该图说明了ASV集群之间的关系，展示了突出的丰富分类群和相关宿主因素。箭头表示潜在的支持角色。
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相比之下，ASV集群IV主要在HC1中观察到，并以_B. fragilis_和肠杆菌科成员的显著存在为特征。_Bacteroides fragilis_以其通过生产荚膜多糖促进肠道定植的作用而闻名[42]，而这两个分类群都与机会性感染和组织定植相关[43, 44]。HC1内的微生物多样性低于HC2中观察到的，微生物多样性的减少表明肠道健康受损。因此，集群IV中的ASVs可能会损害肠道健康。然而，这些发现强调了进一步研究以更好地了解健康后果的必要性。
ASV集群II以在其肠道中的高普遍性和丰度为特征，似乎构成了肠道微生物组的基础元素。值得注意的是，_F. prausnitzii_以其在健康成年人中的高丰度而著名，可能由于其产丁酸能力和抗炎作用有助于健康微生物组[45]。此外，被鉴定为ASV集群II中第二丰富的物种_P. plebeius_也可能通过其处理膳食纤维的能力促进良好健康[46]。本研究进行的相互作用分析进一步阐明了这些微生物的关键作用，展示了ASV集群II与集群I、VI和V之间的广泛连接。这些相互作用表明ASV集群II在维护其他微生物方面具有促进作用。
我们的研究还揭示了ASV集群I内的孤立微生物亚群落，包括_Streptococcus_、Veillonella parvula_和_Haemophilus parainfluenzae。交互网络分析揭示了_Streptococcus_和_V. parvula_之间的依赖关系，这种关系先前在口腔中报告过[47]，表明类似的相互作用可能发生在肠道中。此外，观察到_Streptococcus_和_H. parainfluenzae_ ASVs之间的显著相互作用。两者都参与上呼吸道感染[48,49,50]。这一发现表明_H. parainfluenzae_和_Streptococcus_在肠道和呼吸道中可能存在合作行为，可能影响感染途径。
交互水平在分类群之间有所不同，Oscillospiraceae ASVs与其他微生物显示出强烈的关联。在属水平上，Oscillospira_和_Bacteroides_与其他ASVs高度连接。这些微生物可能在构建交互和促进丰富的微生物生态系统方面发挥关键作用，这可能为宿主带来健康益处。此外，我们的交互分析发现了与_A. muciniphila_相关的ASVs，例如_B. ovatus ASV 1，这是一种公认的具有潜在健康益处的微生物。这种关系提供了一个通过战略性引入其相关微生物来增强有益微生物增殖的机会。然而，由于交互是在条件发生假设下推断的，它们的依赖性应通过共培养实验和代谢组学分析进行验证。
尽管我们的研究提供了对韩国个体肠道微生物群总体结构的见解，但其分析深度有限。我们只能识别出通常存在于人体肠道中的估计300-500种细菌的一部分[22]。此外，尽管我们的一些观察结果与先前的研究一致，但缺乏功能分析使我们的研究无法解决微生物-微生物和微生物-宿主相互作用的机制。我们的发现可以通过全宏基因组鸟枪法测序进一步证实，遗憾的是，这超出了本研究的范围。此外，纵向和干预研究对于全面评估观察到的微生物群落结构的稳定性和动态性至关重要。尽管存在这些限制，我们的发现为理解微生物组织的不同方面奠定了基础，为未来更全面的研究和实证验证铺平了道路。
结论
总之，我们阐明了韩国个体肠道微生物群的组织结构，识别出具有独特特征的微生物群，并提出了它们对肠道微生物群稳定性的作用。然而，关于驱动微生物群落形成的因素、饮食和其他环境因素对微生物群的影响，以及利用有益细菌相互作用增强人类健康的潜力等方面仍未解决。这些领域需要对微生物相互作用的复杂性进行更深入的研究。尽管如此，我们的研究为未来旨在修改肠道微生物群以改善人类健康的研究奠定了基础。
(全文结束)
