摘要
肌肉萎缩是一种影响日常活动能力的疾病，随着全球人口老龄化迅速增加。尽管啮齿类动物模型在研究中具有重要价值，但其免疫反应、代谢、应激反应和肌纤维组成等方面与人类存在差异。本研究建立了一种基于人类细胞的体外模型，通过衰老诱导的人类间充质干细胞（MSCs）分泌的SASP因子作用于人类肌管，导致肌管直径缩小，表明该模型适用于肌肉萎缩研究。RNA测序显示，SASP暴露会上调PDK4表达，而PDK4抑制剂DCA可逆转肌管直径缩小。通路分析表明，SASP通过激活氧化磷酸化（OXPHOS）和促进线粒体功能相关基因表达影响能量代谢。
研究背景
肌肉萎缩与肌肉质量和功能下降相关，但其分子机制尚未完全阐明。啮齿类动物研究表明，衰老细胞移植可导致骨骼肌相关活动能力下降，但人类与啮齿类在生理特征上的差异限制了研究适用性。本研究构建了人类MSCs与骨骼肌细胞共培养模型，通过SASP因子模拟肌肉萎缩的肌纤维萎缩过程。
研究方法
- 细胞培养：使用Takara Bio的人类间充质干细胞（MSCs）和Hu5细胞（永生化人类成肌细胞），通过doxorubicin诱导MSC衰老。
- 染色与基因表达分析：采用γH2AX/Hoechst染色评估DNA损伤，实时PCR检测衰老相关基因（CDKN2A、MMP3等）和SASP标志物（IL1B、IL6等）表达。
- 肌管直径测量：通过IX71显微镜摄影并使用Cell Sens软件测量肌管直径。
- RNA测序：分离纯化肌管后提取RNA，进行转录组分析。
研究结果
- SASP诱导模型验证：
- doxorubicin处理的MSCs表现出显著的γH2AX阳性细胞增加（图1B,C）。
- 衰老相关基因CDKN2A、MMP3、MMP9、TIMP1表达上调（图1D）。
- SASP标志物IL1B、IL6、IL8、TNF表达显著升高（图1E）。
- 分化7天的Hu5肌管肌球蛋白重链（TNNT1）、鸢尾素（FNDC5）、MYF6表达增加，而MYF5（成肌细胞标志物）下调（图1F,G）。
- DCA对肌管的影响：
- SASP处理使肌管直径从对照组的25.3 μm降至18.1 μm（p<0.01），而DCA（5 mM）处理组肌管直径恢复至28.4 μm（图2E,F）。
- RNA测序显示SASP处理组DHRS2（-5.82倍）、PVALB（-1.76倍）、INHBE（-2.18倍）表达下调，而ANPEP（+1.80倍）、IL21R（+1.75倍）上调。
- 线粒体功能调控：
- Ingenuity通路分析显示，DCA可激活氧化磷酸化（Z-score=2.8）和电子传递链（Z-score=3.1），抑制线粒体功能障碍（Z-score=-2.3）（图5A-D）。
- PPARGC1A（线粒体生物合成主调节因子）及其下游基因UCP1、SOD2、MFN2表达在DCA处理组上调，SASP处理组下调（图6D-F）。
- 细胞周期与泛素-蛋白酶体系统：
- SASP处理组的"细胞周期G2-M期"（p=0.0012）、"DNA合成"（p=0.0008）相关基因表达下调。
- DCA处理组的20S蛋白酶体亚基（PSMB1、PSMB4、PSMB7、PSMB9、PSMB10）表达上调（图7A-D）。
机制解析
- PDK4作用：
- PDK4通过抑制丙酮酸脱氢酶复合物磷酸化，减少糖酵解至TCA循环的碳流，导致ATP生成效率下降和ROS积累。
- SASP诱导的IL-6、IL-1β与PDK4共表达增加（单核测序数据支持SASP作为PDK4诱导剂的作用）。
- IGFBP家族调控：
- IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7通过抑制IGF-1通路抑制肌肉再生，本研究发现该家族与SASP信号通路存在关联（图5A）。
- 潜在生物标志物：
- 虽未发现分泌型标志物候选物，但筛选出CAVIN3（与肌膜小窝相关）、EIF3A（翻译起始因子3亚基）、IPO7（核转运受体）、DHCR24（脂代谢基因）、PURB（嘌呤富集元件结合蛋白）等细胞内定位基因表达变化。
研究结论
本研究建立的体外模型揭示了：
- SASP通过抑制线粒体氧化磷酸化和激活PDK4导致肌管萎缩。
- DCA通过激活OXPHOS和改善线粒体功能逆转萎缩。
- 该模型可为肌肉萎缩病理研究和药物筛选提供重要工具，尽管需进一步阐明PDK4与SASP因子间的调控关系。
局限性
- 未能鉴定出分泌型生物标志物候选物，可能因SASP的多样性和细胞特异性所致。
- 需通过蛋白质组学方法进一步验证RNA测序结果。
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