埃斯特哈特认为人体在不完美中彰显完美。我们每个人在视觉、情感、智力甚至结构上都存在不同程度的差异。生物学家则指出，尽管人体是精妙的装置，却缺乏其他生物拥有的诸多非凡功能，例如扁形虫。仅是这个名字就令许多人不适，但它们毫不在意——进化未赋予它们智力与自我意识。然而它们获得的能力是：即使仅存微小碎片也能再生，几乎能重建大部分身体组织。美国密苏里州堪萨斯城圣路易斯医学研究所科学家发现，扁形虫干细胞的工作机制与先前认知截然不同，正是它们促成了如此复杂广泛的组织再生。扁形虫干细胞的秘密何在？它们如何调控再生过程？这些发现如何应用于医学？我们将在科学家报告中寻找答案。
研究基础
干细胞以其自我维持和分化为其他细胞类型的能力而定义。为平衡这些过程并避免干细胞过度增殖或耗竭，其活性通过称为"微环境"的局部组织微环境进行调控。已知干细胞驻留群落及其微环境在复杂性上差异显著：例如线虫的单能生殖干细胞由单个体细胞调控，而高多能造血干细胞（HSC）则受骨髓多种细胞类型提供的完整因子生态系统调控。
淡水涡虫Schmidtea mediterranea及其大量成体多能干细胞对干细胞微环境提出了独特要求。涡虫干细胞几乎遍布全身，密集填充于结构化器官（如肠道、咽部、神经系统、原肾管、肌肉和表皮）之间的间质空间。在正常情况下，干细胞持续分裂并分化为细胞前体以维持组织稳态，同时保持大量未分化细胞群。再生过程中，它们快速增殖并能迁移至损伤部位。然而尽管具有多能性，涡虫干细胞在培养中极少分裂，无法像水螅等其他无脊椎动物那样通过悬浮细胞再生完整生物体。这表明分化细胞可能在调控干细胞身份、潜能、增殖和分化中起关键作用。涡虫干细胞的独特特性——广泛分布、在正常与再生条件下的动态行为，以及对细胞微环境的依赖性——凸显了其微环境的特殊要求与可能性。破译这种特化微环境的结构与功能，可能揭示多细胞生物极端再生能力背后的机制。
此前，涡虫全身丰富且广泛分布的干细胞阻碍了对其微环境的全面分析，因为机体几乎每种细胞类型都紧邻干细胞。然而空间转录组学技术的发展使获取接近单细胞分辨率的涡虫全身mRNA数据成为可能，从而得以详细研究干细胞在其微环境中的细胞架构。研究人员采用基于10微米微球的Slide-seqV2方法，该微球能捕获包含1-5个细胞的局部细胞微环境中的转录本，创建了稳态与再生过程中的涡虫空间转录组图谱。结合现有再生涡虫单细胞RNA测序数据，这一方法成为识别与干细胞紧密关联、可能参与再生能力调控的细胞类型的有力工具。
研究表明，涡虫干细胞位于多种细胞微环境中，其特征是富含分泌细胞和肠道细胞。意外发现是，尽管分泌细胞紧邻干细胞，但对再生过程中的干细胞功能并非必需。相反，肠道细胞虽通常与干细胞相隔至少一个细胞直径，却在调控干细胞增殖和空间定位中起关键作用。高精度电子显微镜进一步阐明了这些微环境的性质，显示它们缺乏明确的架构或固定组成。此外，干细胞极少（甚至从未）通过细胞连接与分化细胞形成稳定接触。这些观察表明，涡虫干细胞调控主要通过远距离介导机制而非与邻近细胞的直接接触。总体而言，结果表明涡虫干细胞栖息于广阔的、复杂的动态间质微环境，由多种分子和细胞微环境组成。这些多样化的微环境通过丰富的细胞外信号分子环境共同维持稳态与再生，这些信号分子通常源自更远端的组织。
研究成果
淡水涡虫S. mediterranea以其卓越再生能力闻名，这由大量成体多能干细胞支持。尽管在理解涡虫再生机制方面取得显著进展，支持干细胞的特定局部微环境仍很大程度上不明确。为阐明此问题，科学家应用Slide-seqV2空间转录组学技术，识别再生过程中与多能干细胞相关的细胞类型和分子。Slide-seqV2技术通过10微米带唯一条形码的微球捕获组织切片中的mRNA转录本，使分析仅含数个细胞的局部细胞微环境成为可能。将Slide-seqV2数据与单细胞RNA测序结果结合，科学家旨在创建高精度再生涡虫组织空间图谱，特别关注与干细胞紧密关联的细胞类型（1A）。
研究人员在截肢后6小时和48小时（hpa）采集涡虫，对再生组织进行Slide-seqV2分析，并制备组织学和核染色对照样本。该方法直接从涡虫组织捕获大量mRNA转录本，有效消除背景噪声，精确匹配微球与每个片段及其沿身体前后轴的方位。质量过滤后分析了49,341个微球，鉴定出44个主要簇。使用Seurat软件包的LabelTransfer算法确定组织归属，Slide-seqV2数据准确再现了已知的体内表达模式，证实了数据集可靠性。
为确定参与形成干细胞微环境的细胞类型，仅分析包含piwi-1转录本（涡虫干细胞可靠标志物）的微球。在16,140个微球中（占总数32.7%）至少含一个piwi-1转录本。重新聚类piwi-1+微球揭示了意外异质性：仅11%由干细胞转录组谱主导，而大多数包含显著比例的其他细胞类型mRNA（1C）。值得注意的是，54%与干细胞相关的微球显示分泌细胞特征——这是一组先前未与干细胞功能关联的多样化细胞群。而22%显示肠道特征，这与此前关于干细胞位于肠道分支间的定位研究一致。这些结果表明，涡虫干细胞栖息于复杂异质微环境中，再生过程中分泌细胞和肠道细胞对其行为影响最大。
鉴于发现的干细胞微环境异质性与多样性，基于时间差异选择了优先目标进行体内验证和功能测试。确定了每个piwi-1+微球簇中截肢后6小时和48小时样本的比例，识别出几个在某一时间阶段占主导的簇（尽管所有簇均包含两个再生阶段及完整个体的微球）（1D）。其中，mmp-1+分泌微环境和富含porcupine表达的肠道微环境最为丰富。
为评估mmp-1+分泌细胞或porcupine+肠道细胞是否与干细胞直接接触，使用双荧光原位杂交在完整和再生涡虫中对这些细胞类型进行可视化。发现mmp-1+分泌细胞在咽部周围间质中形成环状图案，分布稀疏，数量约为piwi-1+干细胞的三分之一，形状不规则且具明显突起。尽管mmp-1+分泌细胞此前已有描述，但其特性仅限于单细胞RNA测序数据。科学家将这些大型、具突起的mmp-1+细胞命名为"百臂细胞"，以区别于分布相似的其他细胞类型。干细胞也位于porcupine+肠道细胞附近及肠道分支间，但与肠道组织的直接接触极为罕见。
为定量分析空间关系，使用CellPose程序基于高分辨率共聚焦图像对数千个细胞进行分类和定位（2A）。通过双荧光原位杂交和有丝分裂标志物磷酸组蛋白H3（H3P）免疫荧光染色，测量了每个细胞到最近百臂细胞或肠道的最小距离（2B）。
发现piwi-1+干细胞最常出现在距百臂细胞10微米范围内，尤其在完整个体和截肢后6小时。相反，干细胞更常位于距肠道20-50微米处，很少在10微米内。有丝分裂频率仅显示与mmp-1+细胞邻近度的微弱统计不显著相关性。此外，在可视化各种特化干细胞谱系表达因子（zfp-1, gata456-1, gata456-2, six1/2-2, tgs-1和foxA）并比对其空间定位时，发现百臂细胞邻近度对细胞谱系特化的微弱且不一致影响。
为详细研究细胞相互作用，科学家应用相关光电子显微镜（CLEM）通过mmp-1+信号识别百臂细胞（2C）。CLEM技术精确匹配荧光与电子显微图像，揭示百臂细胞是充满电子致密分泌囊泡的大型不规则形状细胞（2D）。肠道细胞具有分支交错的突起，而干细胞则具有染色质小体（2E）。
百臂细胞体位于干细胞附近，但未观察到直接接触（2F）。然而其突起可接近干细胞至130纳米（2G）。相比之下，干细胞与肠道细胞通常相隔至少1200纳米（2H），这与光学显微镜数据一致。总体而言，这些结果表明涡虫干细胞与百臂细胞存在紧密空间关联但无直接接触，且与肠道细胞空间分离，证实了空间转录组学关于两种细胞类型在干细胞微环境中积累的结论。
为验证百臂细胞或肠道是否参与调控再生过程中的干细胞功能，研究人员首先表征了百臂细胞中富集的基因。先前单细胞RNA测序数据中此类细胞较少，可能因技术限制或组织解离方法特点。因此开发了RNA-FACS-seq技术，结合组织固定、快速RNA标记和低输入样本测序（3A）。
涡虫被解离固定后，使用HCRv3技术对mmp-1（百臂细胞标志物）染色，随后通过FACS直接将mmp-1+细胞分选至Smart-seqV4裂解缓冲液。mmp-1+细胞被准确识别和分选，使研究人员能够比较完整和再生个体中mmp-1+与mmp-1−细胞的基因表达谱（3B）。数十个先前未描述的百臂细胞基因通过原位杂交确认，并与mmp-1表达共定位。
为评估百臂细胞在再生中的作用，使用RNA干扰（RNAi）降低52个与百臂细胞共定位基因的表达，并分析完整和再生涡虫（截肢后2天和14天）的piwi-1表达水平、干细胞分裂频率（H3P标志物）和mmp-1表达（3D）。尽管干细胞分裂速度有微小变化，但四种RNAi变体（smed30002881, dync1li, ets-2和mmp-1）导致到第14天mmp-1+细胞表达丧失（3C–3E）。值得注意的是，ets-2抑制个体几乎完全丧失百臂细胞基因表达（3F），表明百臂细胞本身耗竭而非仅mmp-1表达降低。
随后，利用ets-2(RNAi)表型，研究人员直接检验百臂细胞丧失是否影响再生。在额外RNAi周期后，对ets-2(RNAi)再生个体进行二次截肢（3G）。ets-2耗竭显著降低完整和再生个体中mmp-1+细胞数量（3H）。然而在任何阶段均未观察到对干细胞增殖（H3P密度；3I）的影响，关键再生阶段保持不变：3天时前极恢复（3J）、7天时光感受器再生（3K）及7天时脑神经节大小（3L, 3M）。
为检验百臂细胞是否参与耗竭干细胞池的恢复，进行了亚致死辐射（将干细胞数量减少至原始水平的5-10%）结合ets-2 RNAi和尾部再生。尽管mmp-1+细胞数量显著减少，但ets-2(RNAi)个体与对照组在分裂干细胞密度（H3P标志物）和辐射后存活率方面均无显著差异。总体而言，这些数据表明尽管mmp-1+分泌细胞（百臂细胞）与干细胞紧密关联并可能适度影响其增殖，但它们最终对全 organism 再生并非必需。
研究人员随后检验了通过Slide-seqV2鉴定为在piwi-1+微环境中富集的肠道细胞是否调控邻近干细胞。通过交叉比对单细胞RNA测序数据和原位杂交确认肠道富集潜在基因，证实其对肠道细胞的高度特异性。
通过RNAi检验肠道富集基因在调控干细胞增殖中的作用时，研究人员在完整和截肢涡虫中可视化piwi-1和H3P（4A和4B）。与百臂细胞基因敲低不同，抑制两个肠道基因——Smed-unc-9和微管蛋白α（tub-α）——导致截肢后48小时伤口激活干细胞增殖出现明显障碍：tub-α(RNAi)涡虫完全缺乏该时期的特征性有丝分裂激增，而完整个体的基础增殖水平保持不变或略有升高（4C和4D）。鉴于表型显著性，对tub-α基因进行了更详细分析。
在tub-α(RNAi)涡虫中，干细胞数量及其增殖水平在完整动物或截肢后6小时均无变化，但在48小时增殖显著受抑——正值再生诱导的"组织丧失响应"阶段（4E–4G）。这些障碍伴随再生缺陷：芽基形成减少或缺失、脑神经节恢复减弱、组织溶解频繁发生（4H–4K）。尽管肠道整体形态保持不变，但依赖干细胞的极性信号（notum和wnt1）在48小时受损，伤口区域肌肉无显著变化。此外，tub-α(RNAi)涡虫不摄取染色食物，表明摄食功能受损。
为直接评估肠道对干细胞定位和增殖的影响，研究人员使用CellPose分析了对照unc-22(RNAi)个体和tub-α(RNAi)涡虫的空间分布（5A）。后者在距肠道20微米内干细胞较少，40微米外较多（5B）。截肢后48小时肠道附近的增殖降低（尤其在10-20和30-40微米范围内），尽管完整tub-α(RNAi)个体总体增殖略有升高趋势。
为研究tub-α在再生中的更广泛效应，在截肢后48小时对tub-α(RNAi)个体和对照组进行单细胞RNA测序。数据整合揭示33个簇，对应已知涡虫细胞类型多样性（5C, 5D）。tub-α抑制后数量相对最少的是两个具干细胞特性的簇——14和18（5E）。差异表达分析还显示对特征为肠道基因porcupine的簇8的显著影响（5F）。根据先前研究，如载脂蛋白B和转录因子nkx2.2等肠道基因在再生中起关键作用。在tub-α(RNAi)作用下，apoB1表达增加40%，apoB2降低22%，nkx2.2适度增加29%。原位杂交证实apoB基因的空间表达模式保持不变。
总体而言，这些数据表明肠道组织尤其是tub-α在干细胞定位、损伤诱导增殖和成功再生中起关键作用。因此，若百臂细胞对恢复无关紧要，则肠道与干细胞的相互作用反而是再生成功的关键因素。
百臂细胞和肠道细胞的功能分析揭示了涡虫干细胞微环境的两个显著特征。首先，即使最近的邻近细胞（百臂细胞）对维持干细胞功能在生长和再生过程中也无足轻重。其次，调控干细胞活性的肠道细胞并不与它们形成直接物理接触。考虑到空间转录组测序揭示的微环境多样性，问题产生：涡虫干细胞是否与任何分化细胞类型形成细胞连接？
细胞连接在电子显微照片中表现为相邻细胞膜沿线的电子致密区域。为验证电子显微样本中这些结构的完整性，分析了通常存在黏附和紧密连接的表皮和肠道组织。发现表皮中存在对应黏附连接的平行电子致密区域，肠道中则存在表征紧密连接的单条电子致密线。此外，观察到原肾管细胞与间质吞噬细胞之间的同型连接，以及原肾管与吞噬细胞之间的异型相互作用（6A）。
为确定干细胞是否与分化细胞形成连接，研究人员重建了CLEM数据集和额外电子显微图像集中每个干细胞的体积，总共分析了263个干细胞和200个分化细胞（6B和6C）。细胞鉴定基于已知的超微结构特征。发现69.5%的分化细胞包含细胞连接（6D），而在所有分析的263个干细胞中仅发现一个潜在连接——干细胞与吞噬细胞突起之间的微弱相互作用，其电子密度低且显著弱于典型黏附或紧密连接（6E）。
还分析了干细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用。注意到横穿间质的肌肉细胞常显示ECM完整性破坏，这与肌肉组织表达的细胞外基质蛋白一致。而包围干细胞的细胞外基质与其他间质区域无差异。总体而言，电子显微分析数据显示涡虫中干细胞与分化细胞之间的稳定连接极为罕见（若存在）。这种结构独立性表明涡虫干细胞在灵活且组织松散的微环境中运作，而非依赖与邻近细胞的持续物理连接。
为更详细研究干细胞所处微环境，研究人员分析了体积电子显微数据集，并将其结果与空间转录组测序数据比对。从第一个电子显微数据集中随机选择21个干细胞（排除冷冻损伤、无核或图像不全的细胞）。为每个选定细胞重建其完整体积及其最近邻细胞，实现相应微环境的三维重建（7A）。
三维重建显示干细胞微环境具有显著变异性：干细胞几乎紧邻间质所有主要细胞类型（7B）。在21个研究案例中未发现重复或典型微环境。为识别规律，为每个干细胞创建最近邻细胞表，并与先前用于分析细胞连接的100个分化细胞进行比较（6B和6C）。发现构成结构化组织（如肠道、表皮和肌肉）的细胞具有同质微环境，而干细胞和间质分化细胞处于高度变异的微环境中，其中分泌细胞、肌纤维、吞噬细胞和其他干细胞占主导（7C）。
值得注意的是，在21个研究干细胞中仅有一个的直接邻近细胞为肠道细胞，证实干细胞与肠道细胞的直接接触极为罕见。分泌细胞和背腹肌纤维也是常见邻近细胞，且分泌细胞在干细胞附近略有富集，这与电子显微分析和空间转录组测序数据一致。吞噬细胞是最常见邻近细胞，几乎与所有干细胞和分化细胞相邻，通常通过空间转录组测序分辨率无法分辨的细长突起。总体而言，这些结果表明涡虫干细胞栖息于多样化间质微环境中，其中存在分化细胞之间的分支接触网络，但与干细胞几乎完全缺乏稳定连接。
尾声
在本研究中，科学家试图破解涡虫之谜——这种生物能在严重身体损伤后再生。研究发现干细胞及其异常行为起着巨大作用。
在大多数动物中，干细胞依赖邻近细胞发出指令。但涡虫干细胞行为不同。它们不听从直接邻居，而是接收来自机体更远端细胞的指令。成年涡虫干细胞可转化为任何细胞类型，不同于大多数动物的干细胞（通常严格限于生成少数细胞类型）。这种严格控制有助于防止不受控生长——可能导致癌症的过程。
利用先进的空间转录组学方法，科学家研究了单个细胞及其环境中活跃的基因。这揭示了意外的邻近细胞，包括一种先前未描述的大型细胞——表面具有众多指状突起。研究人员以希腊神话中多臂巨人赫卡同克瑞斯命名这些细胞为"百臂细胞"。然而，尽管这些细胞紧邻干细胞，却丝毫不影响其功能。这一发现与典型干细胞与微环境关联逻辑相悖。
不是邻近细胞接管控制，最严格的指令来自肠道细胞——数据集中第二常见类型。这些远端细胞似乎影响涡虫干细胞在再生过程中的位置和功能，即使相距甚远。研究表明，涡虫干细胞无需固定、基于接触的微环境运作。实际上，干细胞附近不存在特定细胞类型或因素控制其身份。
科学家指出，更重大的发现是：至少在涡虫中，干细胞所处环境并非恒定。相反，它是动态的：干细胞栖息地本质上由干细胞及其后代在分化过程中创造的"朋友"形成。
这些结果对理解人类再生原理具有重要意义。它们表明，成功组织再生可能不仅取决于干细胞存在，更取决于其微环境特性——灵活、化学活跃且能在无严格结构框架下指导分裂和分化过程。理解这些机制为开发通过调控细胞信号和组织相互作用（而非仅依赖移植或基因治疗）来刺激机体自体再生能力的治疗策略开辟了道路。
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