摘要
肠道微生物群组成的变化与多种慢性疾病相关，包括肥胖和炎症性疾病。老年人的微生物群表现出比年轻人更大的个体间差异。本研究显示，178名老年受试者的粪便微生物群组成形成了若干组，与他们在社区、日间医院、康复机构或长期护理机构的居住地点相关。然而，按饮食对受试者进行的聚类也按照相同的居住地点和微生物群分组将他们分开。微生物群组成的分离与虚弱程度、共病、营养状况、炎症标志物以及粪便水中的代谢物显著相关。长期护理机构中个体的微生物群多样性明显低于社区居民。社区相关微生物群的丧失与虚弱程度增加相关。总体而言，数据支持饮食、微生物群和健康状况之间的关系，并表明饮食驱动的微生物群变化在衰老过程中健康下降速度方面发挥作用。
肠道微生物群对发育和成年期的稳态至关重要。组成变化已与炎症和代谢紊乱相关联，包括成年人的炎症性肠病、肠易激综合征和肥胖症。人类肠道微生物群的组成在操作分类单元（OTU）水平上具有个体特异性，并在健康成年人中随时间保持稳定。老年人（>65岁）肠道微生物群的组成在个体之间差异极大，与年轻人的核心微生物群和多样性水平不同。衰老过程的一个特征是免疫衰老，表现为持续的NF-kB介导的炎症和幼稚CD4+ T细胞的丧失。微生物群对肠道稳态至关重要，而先天和适应性免疫系统的慢性激活与免疫衰老相关。先前已在微生物群的特定组分和促炎细胞因子水平之间建立了相关性，但这些并未将年轻人与老年人区分开来。微生物群组成的变化也与虚弱相关，尽管是在来自单一居住地点的小队列中。
牙齿状况恶化、唾液功能、消化和肠道传输时间可能影响衰老过程中的肠道微生物群。一个可控制的环境因素是饮食，已在动物模型、小规模人体研究和长期研究中显示会影响微生物群组成。然而，大型人类队列中饮食、微生物群组成和健康之间的联系尚不清楚。为了检验老年人肠道微生物群变异对社区中免疫衰老和虚弱的影响这一假设，我们确定了178名老年人的粪便微生物群组成。我们还收集了饮食摄入信息，并测量了一系列生理、心理和免疫参数。饮食分组与微生物群和健康数据集的分离相关；最健康的人生活在社区环境中，饮食不同，其微生物群与长期居住护理机构中的人有明显区别。炎症增加和虚弱增加的测量支持饮食-微生物群与这些加速衰老指标的联系，并表明如何通过调节肠道微生物群进行饮食调整以促进更健康的衰老。
微生物群与居住地点
我们先前确定了161名老年人（>65岁）粪便微生物群组成中相当大的个体间变异性，其中包括43名接受抗生素治疗的人。为了调查饮食、环境、健康和微生物群之间的联系，我们分析了178名非抗生素治疗的受试者，我们也获得了他们的饮食信息，并按社区居住环境分层：（1）社区居住，n=83；（2）参加门诊日间医院，n=20；（3）短期（<6周）康复医院护理，n=15；（4）长期居住护理（长期居住），n=60。受试者的平均年龄为78（±8标准差）岁，范围为64至102岁，所有人均为高加索人（爱尔兰）种族。我们包括了13名年轻成年人，平均年龄为36（±6标准差）岁。我们从16S rRNA基因V4扩增子生成了540万序列读数，平均每位受试者28,099（±10,891标准差）读数。
UniFrac β多样性分析表示微生物群落之间的相似程度。UniFrac主坐标（PCoA）分析47,563个OTU（在97%序列同一性下分组）表明，使用加权和未加权分析，社区居住和长期居住受试者之间存在明显分离。13名年轻对照者的微生物群与社区居住受试者聚集在一起。18种其他非UniFrac β多样性指标支持按居住地点进行的微生物群分离（补充图1）。
当我们检查OTU丰度时，我们发现了一个主要由长期居住受试者组成的集群，与大多数社区居住和年轻健康受试者分离（图1c）。家族水平的微生物群分配显示，长期居住微生物群具有更高比例的拟杆菌门，而社区居住受试者中厚壁菌门和未分类读数的比例更高（图1c）。在属水平上，社区居住受试者粪便微生物群中毛螺菌科的Coprococcus和Roseburia更为丰富（补充表1显示了按社区位置差异丰富的属的完整列表）。与长期居住受试者相关的属包括Parabacteroides、Eubacterium、Anaerotruncus、Lactonifactor和Coprobacillus（补充表2）。与社区相关的属属于较少的家族，毛螺菌科占主导地位。因此，个体的微生物群组成根据他们在单一民族地理区域内居住的位置而分离，在一个同质队列中，气候、文化、国籍和极端环境的混杂效应不是因素。
饮食与微生物群的一致性
饮食数据（178名受试者中的168名，加上5名经皮内镜下胃造口术（PEG）喂养的受试者）通过半定量的147项食物频率问卷（FFQ）收集，按10种消费频率加权。数据通过对应分析（CoA；图2a）可视化。第一个CoA轴描述了超过11%的数据集方差，以及社区居住和长期居住受试者之间食物消费的大多数差异。最具区分性的食物类型是蔬菜、水果和肉类，其消费沿第一个特征向量逐渐变化。FFQ和微生物群β多样性的Procrustes分析用于共同可视化数据（图2b）。基于饮食或微生物群的分离沿两个数据集的第一个轴共同分离（未加权和加权UniFrac，图2b；Monte-Carlo P值<0.0001）。将完全链接聚类和欧几里得距离应用于第一个特征向量（图2c）揭示了四个饮食组（DGs）。DG1（"低脂/高纤维"）和DG2（"中脂/高纤维"）包括98%的社区和日间医院受试者，而DG3（"中脂/低纤维"）和DG4（"高脂/低纤维"）包括83%的长期居住受试者。有关饮食组的完整描述，请参见补充说明和补充表3。
健康食物多样性指数（HFD）与三个微生物群多样性指数呈正相关（补充图2a），所有四个指数在社区和长期居住受试者之间显示出显著差异（补充图2b），表明健康、多样的饮食促进更多样化的肠道微生物群。按饮食组而非居住地点分析证实，微生物群和饮食在DG1中最多样化，在DG3和DG4中最少多样化（补充图3）。Procrustes分析同样显示饮食组与微生物群组成分离相关（补充图3）。此外，微生物群与长期居住的持续时间相关，居住超过一年的居民的微生物群与社区居住受试者的分离最大（补充图4）。对于这些长期居住的大多数居民，饮食与最近入院的受试者不同（补充图4）。持续护理时间的检查（补充图4c）显示，饮食变化比微生物群变化更快；饮食和微生物群都朝着远离社区类型的方向移动。在长期居住1个月后，所有受试者都有长期居住饮食，但需要一年时间微生物群才明显成为长期居住类型。总体而言，数据表明微生物群的组成由饮食的组成和多样性决定。
社区环境与粪便代谢组
粪便代谢物与克罗恩病中的微生物群组成和炎症评分相关。因此，我们对来自29名受试者的粪便水进行了代谢组学分析（NMR光谱），这些受试者代表（通过UniFrac）三个社区环境。（日间医院受试者通过微生物群和饮食分析与社区居住者紧密聚集，未包括在内。）代表性NMR谱图显示在补充图5中。初步PCA（主成分分析）分析显示根据社区环境分离的趋势（数据未显示）。因此，根据聚类组构建了成对统计模型。获得了比较社区和长期居住受试者以及社区和康复受试者的NMR光谱的有效且稳健的模型（图3）。将社区与长期居住受试者分开的主要代谢物是葡萄糖、甘氨酸和脂质（在长期居住受试者中水平较高），以及戊二酸和丁酸（在社区受试者中水平较高）。微生物群属水平和代谢组数据的共惯性分析揭示了两个数据集之间的显著关系（P值<0.01）（补充图6和补充说明）。尽管有三名长期居住受试者，但在微生物群和代谢组数据集中，对角线将社区与长期居住分开。其他感兴趣的代谢物是乙酸盐、丙酸盐和缬草酸，它们在社区居住者中更丰富（补充图6）。
为了进一步研究微生物短链脂肪酸（SCFA）的产生，通过鸟枪法宏基因组测序研究了产生SCFA的微生物基因的频率。我们对29名受试者中的27名的125.9千兆碱基（Gb）细菌DNA进行了测序，并组装了总长度为2.20 Gb的重叠群，包含251万个预测基因（补充表4）。与降低的微生物群多样性一致（补充图3），长期居住受试者的组装宏基因组数据中预测的总基因显著较少，N50值较高（N50是包含最少（最大）重叠群的最小重叠群的长度，其组合长度至少代表组装的50%），与康复或社区受试者相比（补充图7）。然后，宏基因组搜索了丁酸、乙酸和丙酸产生的关键微生物基因，揭示了与长期居住受试者相比，社区和康复受试者中丁酸和乙酸产生酶（BCoAt和ACS，分别）的基因计数和覆盖范围显著更高（补充图8和补充表5）。与长期居住受试者相比，社区受试者中丙酸相关基因（PCoAt）的覆盖范围也显著更高，但基因计数的更高并不显著（补充表5）。这些观察结果与丁酸、乙酸和丙酸与代谢组中长期居住和社区受试者之间主要分裂方向的关联一致；候选属包括用于丁酸产生的Ruminococcus和Butyricicoccus（补充图6），但需要在更大队列中验证。从宏基因组推断的微生物群功能因此与至少一种可以影响健康的测量代谢物相对应。
微生物群-健康相关性
炎症标志物（血清TNF-α、IL-6和IL-8以及C反应蛋白（CRP））在长期居住和康复受试者中的水平显著高于社区居住者（补充图9）。长期居住受试者在各种健康参数（补充表6和7）上得分也很差，包括查尔森共病指数（CCI，涵盖19种医疗状况的稳健生存预测指标）、老年抑郁测试（GDT）、Barthel指数、功能独立性测量（FIM）、简易精神状态检查（MMSE）和微型营养评估（MNA）。
使用分位数（中位数）回归测试检查了健康参数与微生物群组成之间的相关性，调整了性别、年龄和社区设置的加性模型（补充方法）。中位数回归比基于普通最小二乘的线性回归对极端值的权重更小，因此受异常值的影响更小。模型调整了可能影响测试参数的药物（补充表8）。药物的影响通常很小（补充表8）。由于种族完全是爱尔兰高加索人，因此不需要模型调整。调整年龄和位置后，男性和女性的微生物群组成没有差异。
表1显示了微生物群UniFrac分析（图1）的主要分离与几种健康/虚弱测量之间的显著关联。例如，在仅针对长期居住受试者的未加权UniFrac PCoA的PC1轴上沿完整范围的微生物群的正向变化与炎症相关（CRP增加13.9 mg l^-1），其他炎症标志物与微生物群显著相关（IL-6和IL-8，整个队列）。如预期，社区居住受试者之间的变异性最小，但在长期居住受试者中，最显著的关联与功能独立性（FIM）、Barthel指数和营养（MNA）相关，其次是血压和小腿周长。后者可能归因于饮食和/或微生物群对肌肉质量、肌肉减少症和因此对虚弱的影响。这通过调查虚弱和粪便代谢物之间的联系得到支持（概率主成分和协变量分析；PPCCA）。因此，FIM和Barthel指数是粪便水代谢组的重要协变量（补充图10），乙酸盐、丁酸盐和丙酸盐的水平随着这两个指数的更高值（即不太虚弱的受试者）而增加。在社区居住受试者中，微生物组成与营养（MNA）之间也存在强烈关联，与血压的联系较弱，之前已建立与微生物群的关系。拟杆菌门:厚壁菌门比例与体重指数（BMI）之间没有相关性，尽管与长期居住受试者中的整体微生物群存在相关性。老年抑郁测试（GDT）的测量显示与PCoA轴2的微生物群显著关联（表1）。
我们将微生物群-健康相关性的混杂因素归因于药物、抗生素治疗（在1个月排除窗口之前）以及与微生物群对饮食影响无关的饮食-健康相关性（补充说明）。
总体而言，将健康社区受试者与不太健康的长期居住受试者分开的微生物群主要趋势与虚弱增加和健康状况较差的标志物相关，调整了性别、年龄和位置。由于位置在很大程度上决定了饮食（图2），调整位置会减少饮食的影响，并且由于在长期居住环境中也存在微生物群-健康关联的明确证据，我们推断因果关系是饮食-微生物群-健康方向。
微生物群结构与健康老龄化
肠道微生物群可以被分配到三种肠型之一，由拟杆菌属、普雷沃菌属和瘤胃球菌属驱动。最近的一项研究仅检测到拟杆菌属和普雷沃菌属肠型，它们分别与富含蛋白质和碳水化合物的饮食相关。使用这些方法，我们使用六种方法中的五种预测了两个集群的最优数量，尽管支持比先前研究弱（补充图11）。与先前研究一致，两个集群与拟杆菌属和普雷沃菌属相关，但与瘤胃球菌属无关。尽管来自三种方法的肠型分配非常不同（补充图11），但社区受试者更频繁地属于普雷沃菌属肠型。
为了识别微生物群中的模式，我们建立了属的共丰度关联（补充图12a），然后将相关属聚类为六个共丰度组（CAGs）（补充图12b）。这些不是肠型的替代品，肠型是由受试者驱动的，在这个老年队列中支持不足，但它们描述了在统计学上显著的共丰度组中跨受试者组发现的微生物群结构（补充说明）。这些CAG中的主导属是拟杆菌属、普雷沃菌属、瘤胃球菌属、Oscillibacter、Alistipes和中心Odoribacter CAG。这些CAG关系称为Wiggum图，其中属丰度可以表示为与丰度成比例的圆盘（补充图12），归一化过丰度（图4），或差异过丰度（补充图13）。在整个队列对应的Wiggum图中（补充图12），从瘤胃球菌CAG向Oscillibacter CAG的路径显示产生丁酸的属数量减少，而能够代谢发酵产物的属数量增加。
为了简化健康相关的微生物群数据，我们使用了通过OTU聚类确定的八个受试者划分（图1c）。这些八个划分叠加在图1a数据的UniFrac PCoA分析上，定义了8个受试者组（图4，1A至4B组）。这些是微生物群组成谱系内的分离点，代表了通过未加权UniFrac数据的置换多变量方差分析（MANOVA）测试定义的具有显著不同微生物群的个体。然后，我们为这些8组中的微生物群构建了个别Wiggum图（图4）。从健康社区居住受试者到虚弱长期护理居民的转变伴随着独特的CAG优势，最显著的是在普雷沃菌属和瘤胃球菌属CAGs（社区相关CAGs）和Alistipes和Oscillibacter CAGs（长期居住相关CAGs）的丰度方面。
我们对图4的分析表明，从社区相关健康到长期居住相关虚弱有两条路径（1A–4A和1B–4B），我们参考健康相关性进行了检查。社区和整个队列分析确定了与轴2的抑郁关联——下路径中的受试者GDT评分更高。通过整个队列分析，IL-6和IL-8水平在上路径中更高（图4和补充图14），而CRP水平在仅长期居住分析的下路径中更高。此外，与社区仅分析相反，下路径中的受试者收缩压和舒张压更高。这种明显不一致通过长期居住受试者中主要PCoA轴上舒张压的高度显著变化得到解释，强调了分层队列的价值。上路径中的受试者年龄较大，但比下路径中相似年龄的受试者具有更高的Barthel和FIM评分（补充图14），与更健康的衰老一致。沿着整个队列的PCoA轴1移动（即，从社区到长期居住，从左到右，图4）与瘤胃球菌属和普雷沃菌属丰度的减少以及Oscillibacter CAG丰度的增加相关，伴随着小腿周长和体重的减少（表1）以及IL-6水平的增加。沿着长期居住PCA的轴1移动（即，在两个右臂之间），Oscillibacter CAG减少，拟杆菌属CAG丰度增加，FIM和Barthel指数降低，CRP水平增加（图4）。
考虑长期居住队列中的微生物群-健康相关性（图4），沿轴2向上移动，突显了与虚弱增加、肌肉质量减少和精神活动较差的关联，远离社区型微生物群。
健康-微生物群相关性在回归模型调整位置后在统计学上仍然显著。尽管其他因素无疑有助于健康衰退，并且在回顾性研究中难以完全调整，我们数据最合理的解释是饮食塑造微生物群，然后影响老年人的健康。在发达国家的年轻人中，由饮食决定的微生物群组成差异可能产生微妙的影响。这些很难与健康参数相关，但在免疫生理受损的老年人中变得更加明显。这通过长期居住队列中更强烈的微生物群-健康关联得到支持，并且现在有合理的理由认为微生物群相关加速与衰老相关的健康衰退。人口老龄化现在是西方国家的普遍特征，甚至在发展中国家也成为一种新兴现象。老年人肠道微生物群与炎症的关联以及本研究和先前研究中概述的饮食与微生物群之间的明确关联支持通过设计用于促进更健康老龄化的饮食干预来调节微生物群的方法。具有定义食品成分的膳食补充剂，促进微生物群的特定组分，可能对维持老年人健康有用。在社区基础上，微生物群分析，可能与代谢组学结合，提供了基于生物标志物识别处于风险中或经历不太健康老龄化的个体的潜力。
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