摘要
背景和目的— 含有Kunitz蛋白酶抑制域的淀粉样β蛋白前体(AβPP)分泌异构体，也称为蛋白酶nexin-2(PN2)，在脑中富集。尽管对其生理功能知之甚少，但PN2/AβPP对某些促血栓蛋白酶的强效抑制作用表明，它可能在血管损伤事件中调节脑血栓形成。
方法— 为研究脑PN2/AβPP在体内的抗血栓功能，我们对脑内特异性且适度过表达PN2/AβPP的转基因小鼠进行了颈动脉血栓形成和实验性脑出血的测量。与野生型小鼠和Tg-rPF4/APP小鼠(一种在血小板中特异性且适度过表达PN2/AβPP并在体内表现出减少血栓形成的模型)进行了比较。
结果— 转基因小鼠脑内PN2/AβPP的适度过表达对颈动脉腔内血栓形成没有影响，但与野生型小鼠(15.9±2.2 mm³[n=6]和935±418 μg/半球[n=12])相比，导致更大的血肿体积和血红蛋白水平(分别为23.1±2.7 mm³[n=6; P<0.01]和1411±202 μg/半球[n=12; P<0.01])。
结论— 这些发现表明，脑PN2/AβPP在调节脑内血栓形成中起重要作用，并且该蛋白的脑内水平与年龄相关的轻微增加可能会显著增强脑出血的程度。
淀粉样β蛋白前体(AβPP)通常被认为是阿尔茨海默病及相关疾病患者脑中积累的淀粉样β蛋白(Aβ)的母体分子。尽管关于参与释放Aβ的AβPP蛋白水解过程已有很多了解，但对AβPP功能的了解仍然很少。AβPP主要以3种长度递增的异构体形式表达(695、751和770个氨基酸)，其中2种较大的异构体含有Kunitz蛋白酶抑制(KPI)域。含有KPI的分泌型751/770异构体AβPP类似于细胞分泌的蛋白酶抑制剂，即蛋白酶nexin-2(PN2)。PN2/AβPP在脑中含量丰富，并且其表达随年龄在脑室中增加。
PN2/AβPP是几种关键促血栓蛋白酶的强效抑制剂。除了脑外，PN2/AβPP在循环血液血小板中也大量表达。最近，我们证明了在转基因小鼠血小板中PN2/AβPP的适度过表达会导致体内血栓形成减少。尽管这些结果支持血小板PN2/AβPP在体内调节血栓形成的功能，但脑PN2/AβPP在限制脑血栓形成中的潜在作用尚不清楚。
为确定小鼠脑内PN2/AβPP水平升高是否与出血严重程度增加相关，对脑内特异性且适度过表达PN2/AβPP的转基因小鼠在颈动脉血栓形成和脑出血实验模型中进行了定量分析，并与在血小板中适度过表达PN2/AβPP的转基因小鼠和野生型小鼠进行了比较。
材料与方法
转基因小鼠
所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院指南，并获得石溪大学机构动物护理和使用委员会的批准。在大鼠血小板因子4启动子控制下在血小板中特异性表达PN2/AβPP的转基因小鼠(Tg-rPF4/APP)或在脑神经元中在小鼠Thy1启动子控制下表达PN2/AβPP的转基因小鼠(Tg-Thy1/APP)的生成和特征描述最近已有报道。在所有实验中转基因和野生型小鼠均为3个月大，且均为纯C57Bl/6背景。
PN2/AβPP的定量免疫印迹分析
使用特异性针对人AβPP的单克隆抗体P2-1或识别人和鼠AβPP的单克隆抗体22C11，通过定量免疫印迹测定分离的小鼠血小板或前脑匀浆中人PN2/AβPP和总PN2/AβPP(鼠+人)的水平。
颈动脉血栓形成
此技术根据Eitzman等人的方案进行，如最近所述。
实验性脑出血
此程序根据Clark等人的方案进行。简而言之，将500 nL细菌胶原酶/生理盐水(150 U/mL)立体定向递送至尾状核/壳核，深度为4.0 mm，单侧促进胶原降解导致血管破裂。出血开始18小时后，用PBS灌注小鼠，收获脑组织，然后分析血肿体积。或者，将收获的灌注脑组织沿中线矢状面分割，使用分光光度测定法测定出血和对侧半球中的血红蛋白水平，作为测量小鼠病变半球出血程度的指标。
统计分析
比较转基因小鼠和野生型小鼠获得的结果通过组间单向ANOVA后跟Tukey-Kramer事后成对检验(显著性水平为0.05)使用GB-Stat 6.5软件进行分析。
结果
对不同转基因系中转基因编码的人PN2/AβPP表达的分析证实，该蛋白在Tg-rPF4/APP小鼠的血小板中特异性表达，而在Tg-Thy1/APP小鼠的脑中特异性表达。对每个转基因系中PN2/AβPP表达的定量显示，该蛋白的适度过表达水平仅使Tg-rPF4/APP小鼠血小板中或Tg-Thy1/APP小鼠脑中的PN2/AβPP量大约增加一倍。
为确定脑实质中PN2/AβPP的适度增加对腔内动脉血栓形成的影响，我们对Tg-Thy1/APP小鼠进行了定量颈动脉血栓形成实验。在所有实验中，也包括Tg-rPF4/APP小鼠，因为我们最近已证明它们在体内表现出减少的血栓形成。与Tg-rPF4/APP小鼠相反，Tg-Thy1/APP小鼠在血管闭塞时间和血流停止方面没有影响，与野生型小鼠无差异。这表明Tg-Thy1/APP小鼠脑实质中PN2/AβPP水平的适度升高不会影响完整血管腔内发生的血栓形成。
接下来，我们确定了增加的脑实质PN2/AβPP水平对实验性脑出血严重程度的影响。在这种情况下，与野生型小鼠(15.9±2.2 mm³)相比，Tg-Thy1/APP小鼠(23.1±2.7 mm³)和Tg-rPF4/APP小鼠(24.4±4.7 mm³)的血肿体积显著更大(P<0.01)。同样，作为出血严重程度的独立测量指标，出血脑半球中的血红蛋白含量在Tg-Thy1/APP小鼠(1411±202 μg/半球，P<0.01)和Tg-rPF4/APP小鼠(1830±306 μg/半球，P<0.01)中显著高于野生型小鼠(946±418 μg/半球)。这一发现表明，当脑血管破裂时，脑实质PN2/AβPP的轻微增加可以显著减少血栓形成并增加出血的严重程度。
讨论
在本研究中，我们表明Tg-Thy1/APP小鼠是研究脑PN2/AβPP水平适度增加在脑血管损伤期间调节血栓形成作用的有用模型。据报道，脑PN2/AβPP水平随年龄和脑损伤后增加。增加的脑实质PN2/AβPP对颈动脉血栓形成没有影响，因为它无法接触在完整血管腔内激活的促血栓介质。另一方面，在实验性脑出血期间血管破裂时，外渗的促血栓蛋白酶现在暴露于脑实质中的细胞和分泌的PN2/AβPP，导致抑制和更广泛的出血。Aβ肽是AβPP的淀粉样蛋白原性片段，可以影响脑血流。尽管我们未能在Tg-rPF4/APP小鼠中检测到Aβ，但Tg-Thy1/APP小鼠在脑实质中显示出极少量的可溶性Aβ。这是否会对实验性出血期间的脑血流产生影响目前尚不清楚。本研究的结果表明，脑PN2/AβPP水平的轻微增加可能对脑血栓形成产生重大影响，并且与年龄和疾病相关的该蛋白在脑中增加可能有助于出血的严重程度。
致谢
资金来源
本工作部分由美国国立卫生研究院(NIH)资助，资助号为RO1-NS52533，RO1-HL72533和RO1-NS36645。
利益冲突声明
无。
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