早期结直肠癌患者血浆外泌体中KRAS突变检测的性能
背景
液体活检是一种微创方法，可以替代实体癌组织活检，用于检测驱动突变、监测治疗反应和评估预后。外泌体是一类在体液中发现的细胞外囊泡，比无细胞DNA和循环肿瘤细胞更稳定。亲代细胞的遗传信息可以被包装到外泌体中，分析这些信息有助于在疾病症状出现之前确定细胞的遗传变化。在此，我们试图研究从结直肠癌患者血浆中提取的外泌体DNA中的KRAS突变检测。
方法
本研究对42名I-III期结直肠癌患者进行了分析。首先，使用尺寸排阻色谱法（SEC）从患者血浆中纯化外泌体，然后使用苯酚-氯仿-异戊醇（PCI）方法从样品中提取DNA。接下来，使用Intplex定量PCR方法检查三种KRAS变异的存在。
结果
突变等位基因频率的测量灵敏度为0.01%。约85%的测试外泌体DNA样本具有一种或两种KRAS突变。测得的突变等位基因频率中位数为1.18%（范围为0.01–63.33%）。此外，我们还评估了患者外泌体和肿瘤组织DNA样本之间突变检测的一致性。
结论
我们得出结论，在癌症患者早期阶段的血浆中外泌体提取的遗传内容中调查突变可以通过高灵敏度进行，并且可以加速确定患者的最佳治疗过程。
引言
结直肠癌（CRC）是癌症死亡的第二大原因，占全球十分之一的死亡案例。该疾病的发病率被认为是衡量一个国家社会经济发展水平的标准。由于生活方式和饮食模式的变化，CRC的发病率在发展中国家正在增加。然而，癌症是一种多因素疾病，具有已知的遗传和环境风险因素。在CRC中，不同的基因突变和信号通路，如P53、RAS/MAPK和Wnt/β-catenin信号通路，被认为是促进肿瘤的因素。KRAS是一种编码GTP酶的原癌基因，在RAS基因家族中最常发生突变。已有报道称，KRAS点突变发生在致癌过程的早期步骤中，并增加了肿瘤的侵袭性。尽管KRAS突变在CRC生存中的预后价值仍有争议，但它的存在预测了抗表皮生长因子受体（EGFR）靶向治疗的负面反应，这对转移性患者是有益的治疗手段。因此，在开始治疗前必须评估KRAS基因突变。
液体活检是一种非侵入性和新颖的诊断方法，可分析血液或其他体液中的外泌体、循环肿瘤细胞（CTCs）和循环肿瘤DNA（ctDNA）。各种研究表明，该技术在癌症早期诊断中的效率很高。早期诊断对CRC的生存至关重要，并提高了早期癌症患者或术后复发患者的生存率。在不同类型的液体活检中，ctDNA和CTCs在早期预后中具有特殊的临床价值，监测复发并指导精准治疗。低浓度的ctDNA，特别是在癌症早期阶段，低稳定性，缺乏简单的提取方法以及低灵敏度是CTCs和ctDNA临床应用的一些限制。因此，近年来越来越多的研究人员关注外泌体及其在肿瘤起始、发展和转移过程中的作用。
外泌体作为小细胞外囊泡（sEVs），由所有人体细胞分泌并携带细胞质内容物，如RNA、蛋白质、DNA等。外泌体DNA以单链和双链形式存在，包括大基因组DNA（gDNA）、线粒体DNA（mtDNA）和肿瘤特异性致癌突变DNA。虽然其大小范围约为~100 bp至~20 kbp，但这种DNA内容涵盖了整个基因组内容。将大dsDNA包装到EVs中可能以核小体结合或超螺旋形式实现。因此，假设直径小于50 nm的EVs中不会存在大dsDNA。除了EVs内部的封闭DNA外，它还可以附着在外表面。虽然EVs中的dsDNA（evDNA）的存在已被充分记录，但分离方法和分离出的EVs的大小会影响含DNA囊泡的存在与否，可能导致DNA检测减少。
外泌体的遗传内容与其亲代癌细胞相同，并反映了其遗传改变。事实上，关于各种基因的不同研究表明，血浆外泌体DNA的突变分析比血浆ctDNA具有更高的灵敏度。Allenson等人在其对不同阶段胰腺癌患者的血浆ctDNA和外泌体DNA的研究中报告称，在所有阶段，特别是早期阶段，外泌体DNA中KRAS突变的检测率优于ctDNA。Lee等人在对肺腺癌患者的研究中显示，评估EV衍生DNA中的EGFR突变比组织和ctDNA具有更高的灵敏度。在另一项针对30名KRAS突变CRC患者的血液样本研究中，使用ddPCR方法检测突变的比率显著高于ctDNA。此外，根据患者的TNM分期进行评估，结果显示在疾病的第一阶段ctDNA和evDNA之间存在显著差异，强调了即使在致癌过程的早期阶段evDNA的诊断能力。
鉴于早期诊断肿瘤基因组图谱的重要性以及sEVs中存在DNA，本研究旨在评估检测早期阶段CRC患者evDNA中KRAS突变的好处。
材料与方法
患者与研究设计
我们纳入了2021年9月至2022年11月期间在伊朗马什哈德三个临床中心接受手术的42名CRC患者。本研究得到了马什哈德医科大学伦理委员会的批准（代码：IR.MUMS.MEDICAL.REC.1400.666），并从参与者处获得了知情同意。纳入标准是在采集血液时没有转移。此外，接受术前治疗（如化疗、放疗）或溶血血样的患者被排除在研究之外。
血样采集和外泌体分离
在手术过程中，从每位患者身上采集三毫升的血样，放入EDTA管中并在冰上保存。接下来，在两小时内，样本以3000 g离心10分钟，分离出血浆并在-80°C下保存直至使用。血浆样本解冻后，以2000 g离心10分钟去除沉淀蛋白，澄清后的血浆再次以18,000 g离心30分钟。为了分离外泌体，将500 µl澄清后的血浆与等体积的PBS混合，使用0.2 μm注射器过滤器过滤，并加载到10 mL Sephacryl 400柱上。所有样本的外泌体部分通过我们实验室优化的SEC方法分离。每一步骤中，通过向柱中添加1 ml PBS收集外泌体部分，并在-20°C下短期保存两周或在-80°C下长期保存。
外泌体DNA提取
使用优化的PCI方法从500 µl外泌体部分提取DNA，具体步骤如下：
- 裂解：向溶液中加入等体积的SDS裂解缓冲液（1% SDS，1 M Tris-HCl，pH 7，20 mM EDTA + 0.5 mg/ml蛋白酶K），并在55°C孵育约30分钟。
- 苯酚:氯仿:异戊醇（PCI）提取：向每个试管中加入等体积（800 µl）的PCI（25:24:1），充分混合，剧烈摇动，并在4°C下以16,000 g离心5分钟。接下来，将上层水相转移到新试管中。
- 氯仿:异戊醇（CI）提取：向分离的相中加入等体积（800 µl）的CI（24:1），充分混合，剧烈摇动，并在4°C下以16,000 g离心5分钟。将水相（约600 µl）转移到新试管中，并重复此步骤一次以去除剩余的苯酚。
- 沉淀：在最后一步，对于DNA的乙醇沉淀，加入0.1体积（40 µl）的醋酸钠（NaOAC 3 M，pH 5.2），3倍体积（1200 µl）的冰冷绝对乙醇和1 µl的糖原（20 mg/ml）。此溶液充分混合并在-80°C下孵育约2小时。然后，在4°C下以21,000 g离心20分钟。去除上清液，所得沉淀干燥至无色。干燥的沉淀随后重悬于30 µL蒸馏水中。
使用NanoDrop分光光度计（ThermoFisher 2000）测量DNA量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分析提取的DNA质量。此外，进行了原子力显微镜（AFM）以评估外泌体DNA片段的大小模式。
肿瘤组织收集和DNA提取
肿瘤组织活检可用于28名患者，保存在RNAlater中，-20°C保存。使用醋酸铵方案和BehMag基因组DNA提取试剂盒（BEHGENE）按照制造商说明从肿瘤组织中提取基因组DNA。
KRAS突变检测
使用Intplex，一种改进的等位基因特异性定量PCR（AS qPCR）分析外泌体DNA和组织DNA中的KRAS突变。寡核苷酸根据先前的研究合成（补充表1）。
对于外泌体DNA，为了增强突变扩增子的扩增，使用外部引物进行初始PCR，使用10 µl Taq PCR Master mix（Parstous，伊朗）和各引物的0.6 µM最终浓度，100 ng提取的DNA和BSA（0.8 µg/µl），总体积为20 µl。热循环包括95°C下初始变性5分钟，然后进行35个循环的95°C 30秒，60°C 30秒和72°C 30秒，最后在72°C下延伸5分钟。qPCR扩增在Roche LightCycler® 96实时系统上以12 µl反应体积进行重复反应。每个突变扩增子或野生型扩增子的扩增都在单独的反应中进行。每个qPCR混合物包含6 µl SYBR green Master mix（Ampliqon，丹麦），1.5 µl各引物（0.1 µM），1.5 µl PCR产物（稀释1:100）和1.5 µl无核酸酶水。对于突变扩增子的扩增，使用等位基因特异性阻断剂代替水。突变/野生型扩增的热循环包括95°C下初始变性15分钟，作为热启动聚合酶激活步骤，然后进行40/30个循环的95°C 30秒，60/55°C 30秒和72°C 30秒。通过每秒增加0.2°C的温度从65°C到97°C绘制熔解曲线。每次运行的突变或野生型扩增子包括阳性对照和无模板阴性对照。为了分析目标突变的特异性检测，从带有KRAS突变的结肠癌细胞系中提取阳性对照DNA，如下所示：HCT-116细胞用于G13D KRAS突变，SW480用于G12V KRAS突变，LS180用于G12D KRAS突变。此外，带有野生型KRAS基因的HT29结肠细胞系用作野生型参考扩增子扩增的阳性对照。
对于组织DNA样本，仅进行突变扩增qPCR反应。
扩增方法的特异性和灵敏度分析
首先，基于基因组DNA分析intplex的灵敏度水平。由于~33 ng基因组DNA相当于~10,000个等位基因拷贝，将具有KRAS G12V纯合突变的SW480细胞系基因组DNA连续稀释五次，直到突变拷贝与100,000个野生型基因组DNA拷贝的比例达到1:10,000。所有实验点均获得两次重复。
接下来，为了分析突变引物的特异性，为所有突变引物和上述三种突变细胞系分别进行独特的扩增反应。
突变分析
在这项研究中，我们采用了Thierry等人提出的Intplex qPCR分析方法来检测第二外显子中最常见的三种KRAS点突变（G12V、G12D和G13D）。简而言之，他们在转移性CRC患者的提取循环无细胞DNA上进行了这种方法，以检测KRAS和BRAF突变。与金标准方法的肿瘤组织分析相比，他们分别展示了KRAS和BRAF突变100%和98%的灵敏度，以及92%和100%的特异性。为了实现最佳的特异性和灵敏度，他们提出了Intplex的特定引物系统设计，包括阻断剂和分析熔解温度的临界点。通过与阳性对照（±0.4°C）的熔解曲线一致性确认突变序列的特异性扩增。在一致性确认后，通过基于已知突变基因组DNA浓度的mA%标准曲线和突变与野生型扩增子扩增周期差，获得测试样本的突变等位基因频率（mA%）。
通过Sanger测序验证突变
通过3130xl遗传分析仪（ABI，美国）根据制造商协议，对三个突变样本的PCR产物进行直接测序，以评估intplex qPCR突变检测的准确性。
统计分析
使用SPSS软件（版本27）进行统计分析。使用GraphPad Prism软件（版本9）绘制图表。使用学生t检验和Mann-Whitney/Kruskal-Wallis检验分别比较参数和非参数变量的均值。概率小于0.05被认为具有统计学意义；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
结果
患者数据
本研究共纳入42名非转移性CRC患者。患者的人口统计和病理特征总结在表1中。所有血样均在手术过程中采集，并在任何治疗（如化疗或放疗）之前采集。
血浆样本中分离外泌体的特征分析和外泌体DNA的分析
尽管在不同的人类血浆外泌体分离技术中，差速超速离心是金标准方法，但它在临床诊断中的高通量应用存在一些局限性。在这里，我们展示了基于SEC方法优化的sephacryl 400柱在外泌体提取中的可重复性和特异性。提取分数中颗粒的大小和形态分析证实了动态光散射（DLS）和透射/扫描电子显微镜（TEM/SEM）分别获得的60-150 nm大小和球形形态的外泌体的存在（图1A和B）。
对于DNA提取，使用优化的PCI方法作为简单程序。从42个血浆样本中提取的外泌体DNA浓度范围为14.0至38.6 ng/µl。DNA提取也通过使用AFM成像DNA（图1C）和琼脂糖凝胶电泳分析进行了验证（图1D）。通过ImageJ软件测量成像DNA片段的长度估计了外泌体DNA的长度变化（图1E），并通过琼脂糖凝胶上的>10 kb条带证明了提取DNA的完整性。需要注意的是，提取的DNA纯度对于后续的PCR分析非常重要，应避免在提取协议中污染有机化合物如苯酚。此外，使用BSA似乎有助于一些低DNA产量样本的PCR扩增。
Intplex qPCR，一种敏感且特异的方法
Thierry等人先前已经证明，当扩增短于100 bp的区域时，qPCR对ctDNA的定量更为精确。他们建立了一种Intplex qPCR方法，使用等位基因特异性引物检测ctDNA突变。因此，外泌体DNA和ctDNA在长度上的相似性使我们进行了这种整合引物设计用于外泌体DNA定量。使用这种方法和突变体与野生型DNA的不同系列稀释，我们展示了在1/10,000比例下检测等位基因的能力（补充图1A）。因此，这种方法具有单拷贝检测突变等位基因的潜力，灵敏度≥0.01%突变与野生型比例（mA%）。通过在3'端添加磷酸基团合成的阻断寡核苷酸，Intplex qPCR的特异性增加，以干扰野生型序列的非特异性延伸。通过熔解峰分析确定突变序列的特异性扩增。因此，在从突变细胞系提取的外泌体DNA上使用特异性引物进行扩增具有不同的Tm（补充图1B）。此外，每个突变扩增子都有其独有的Tm，只有那些Tm在与内阳性对照（突变细胞系）相比±0.4°C范围内的样本才被定义为该突变阳性。
通过对三个突变样本进行Sanger测序来评估intplex qPCR突变检测的准确性。色谱图显示了两种检测方法（Sanger和intplex PCR）在两个样本中的相同结果，而对于一个样本，qPCR结果显示KRAS G12D和G13D突变，而测序仅显示G12D突变的存在（图2）。
定量外泌体突变DNA
为了估计患者样本中提取的外泌体DNA中突变与总（突变+野生型）等位基因的比例和突变等位基因百分比（mA%），我们解释了从SW480细胞系gDNA制备的系列稀释液中突变和野生型等位基因扩增获得的qPCR结果（图3A）。根据每个稀释液中突变和野生型等位基因获得的平均Cq值，绘制了图3A中的图形。显示突变和野生型扩增子量化周期差异的ΔCq值和图3B中的方程可用于预测外泌体DNA中的突变负荷。具体来说，我们的研究中mA%值是使用以下方程从对数图中确定的：10ΔCq−6.586/−3.478。因此，这种方法能够准确估计突变等位基因百分比（mA%）。CRC患者样本的突变状态分析显示每个KRAS变异的不同突变频率范围，估计G12V为0.4-63.33%，G12D为0.01–0.12%，G13D为1.1–2.64%（图4和补充表2）。
评估患者外泌体和肿瘤组织DNA样本之间突变检测的一致性
接下来，我们评估了患者外泌体DNA和肿瘤组织DNA样本之间突变检测的一致性。如图5所示，在28名有配对液体和组织活检样本的患者中，64%被qPCR结果显示为突变，正如其肿瘤组织所识别的那样。50%的肿瘤样本中的KRAS变异与其外泌体DNA报告的intplex结果一致。肿瘤组织样本中最普遍的突变是G13D，其次是G12D和G12V。此外，两个组织样本表现出KRAS双重突变。
由于无法获取患者FFPE组织样本中的突变变异数据，确切的KRAS突变变异尚不清楚。因此，组织和外泌体样本之间的一致性是根据突变的阳性结果而不是突变类型计算的（表2）。
讨论
外泌体DNA和ctDNA是早期检测和治疗癌症的有希望的生物标志物，可能改善患者的预后。ctDNA作为液体活检的前沿，包括可通过不同方法识别的体细胞突变、甲基化改变和片段组学特征。以前的研究表明，与正常细胞相比，肿瘤细胞释放更多的sEVs。因此，作为sEV内容的一部分，外泌体DNA在过去十年中在多种癌症的突变检测中受到了越来越多的关注。据我们所知，这是第一个评估从I至III期CRC患者中提取的外泌体中KRAS突变状态的盲法研究。然而，有限数量的I期患者（n = 8）可能会限制关于早期检测灵敏度的确切结论。未来的研究应包括更大规模的队列，并平衡I期患者的代表性，以验证外泌体DNA作为早期结直肠癌的可靠生物标志物。虽然ctDNA片段通过凋亡、坏死和其他细胞过程释放到血液中，但所有存活的细胞都会将外泌体分泌到体液中。因此，外泌体的丰度超过了ctDNA的浓度。值得注意的是，并非所有外泌体都含有DNA，它可以是外部附着在外泌体膜上或封装在囊泡内部。因此，一部分外泌体DNA与血浆ctDNA重叠。值得注意的是，Takeda等人证明，结合两种液体活检方法的分析增加了突变检测率。作为一个新的发现，他们报告称液体活检有可能反映肿瘤异质性并检测未在CRC患者原发肿瘤组织中发现的突变。虽然基于ctDNA和EV DNA的检测之间的相关性已被证明，但据报道，EV DNA在鉴定方面更为敏感。最近的报告主要基于组织分析，表明CRC患者中KRAS突变的流行率约为40%，其中大多数发生在外显子2中。当使用血浆分析（ctDNA）检测转移性CRC患者的外显子2 KRAS突变时，另一项研究报告的突变频率约为74%；然而，通过焦磷酸测序进行的组织分析确定的频率约为50%。实际上，外泌体DNA的起源可以解释本研究中观察到的早期患者较高的检测率。在这项工作中，我们在85%的患者血浆样本中提取的外泌体DNA中检测到了KRAS突变。
Intplex qPCR被开发为一种高度选择性和灵敏的方法，用于检测突变状态，特别是ctDNA。它可以特异性地检测频率为0.004–0.014%（%突变与野生型比例）的突变等位基因，这与先进技术如BEAMing和ddPCR的检测限相当。然而，开发其他敏感方法和技术对于在液体活检分析中检测低等位基因频率是必要的。液体活检中，尤其是外泌体DNA中低突变DNA分数的原因可以归因于几个因素：(1) 外泌体外膜上的大多数DNA是野生型DNA，很可能是从非肿瘤细胞中释放的；(2) 从血清或血浆中提取外泌体的方法可能由于血小板活化和血清在凝血过程中释放EVs而影响突变等位基因的频率。值得注意的是，液体活检分析中的低等位基因比可能并不完全与估计的肿瘤突变等位基因频率（MAF）相关。与此相关的是，Grasselli等人使用BEAMing分析了转移性CRC患者ctDNA和肿瘤DNA中的KRAS MAF。他们报告的ctDNA中位值为2%（范围0.01-43%），肿瘤DNA中位值为25%（范围3-99%）。因此，他们的结果证明了在液体活检分析中采用高度敏感方法的重要性。ddPCR是另一种测量MAF的敏感方法，之前由Bernard等人在一项关于胰腺癌患者的研究中应用。他们确定了ctDNA和外泌体DNA中KRAS突变的频率，中位值分别为0.076%（范围0-60.969%）和1.463%（范围0-59.091%）。在我们的研究中，突变负荷的中位数为1.18%，在85%的突变样本中从0.01%到63.33%不等。KRAS突变负荷的高变异可以通过外泌体DNA片段大小、原发肿瘤的位置、其直径和其他因素的差异来解释。
本工作的另一个有趣方面是外泌体DNA检测多个突变的潜力，在31%的突变样本中发现了这一点。使用Intplex qPCR分析两个不同队列的血浆中KRAS基因突变的检测显示，30%和50%的患者分别携带第二种并发突变，而这些突变在组织分析中均未检测到。此前，Ucar等人证明了10%的CRC患者在组织分析后存在多个KRAS突变。他们发现KRAS中的多个突变与这些患者的生存增强有关。
许多研究通过计算正百分比一致性（PPA）来比较液体活检和组织活检的表现。例如，Liu等人在利用熔解曲线和野生型DNA阻断（IAMB）技术分析407名CRC患者的KRAS突变状态时，确定了在407名患者中的335个样本中组织和血浆检测之间的一致性（82.3%的整体百分比一致性，OPA）。表示检测到KRAS突变病例的PPA约为76.3%（201名患者中的148名）。在206名基于其组织样本被确定为野生型的患者中，187名也通过其血浆检测为野生型（90.8%的NPA）。另一项研究在转移性结直肠癌患者中进行，以验证血浆作为组织分析替代品的潜力。使用OncoBEAM测定对比血浆样本的突变状态与使用FFPE样本的标准突变分析显示OPA约为86.0%，PPA约为86.2%，NPA约为85.7%。在我们的研究中，大约66%的患者可以获得存储在RNAlater中的肿瘤组织样本，尽管仅在三个样本中通过Sanger测序初步验证Intplex qPCR测定仍然是一个限制。虽然这种初步验证确认了该方法的可行性，但未来的研究应纳入更大的基于测序的验证集，以提高特异性和可重复性。因此，我们测量了约67.8%的一致性。使用组织样本验证的突变血浆案例数量的PPA为69.5%，野生型样本的NPA为60%。尽管存在这些限制，我们的研究结果表明Intplex qPCR在突变检测中对外泌体DNA具有显著的实用性。通过扩展测序验证进一步完善该测定将进一步提高其诊断可靠性。为了进一步提高可重复性和透明度，原始qPCR数据（包括Cq值）已作为补充材料提供供参考。
我们研究的几个限制需要承认。首先，只研究了三个KRAS热点变体，这可能限制了我们发现的普遍性。其次，Sanger测序验证仅在有限的样本子集中进行，从而限制了对测定特异性和可重复性的全面评估。第三，缺乏有关突变状态、疾病进展和患者生存的详细临床数据，妨碍了分子发现与临床结果之间的有力关联。尽管如此，我们认为突变等位基因频率和突变负荷的准确量化在未来的研究中可以提供重要的额外临床见解。
结论
总之，目前的研究展示了使用SEC方法从血浆中分离的外泌体提取的DNA在早期CRC阶段检测KRAS基因突变的能力。为此，我们采用了一种经济高效、简单且易于获取的DNA提取方法，以及一种灵敏、高效且相对经济的KRAS突变检测方法。在癌症早期阶段的患者中识别这些突变可以更快地进行抗EGFR药物的预后和治疗过程，防止肿瘤生长和转移。可以设想外泌体DNA在产生患者较早临床阶段的循环DNA方面发挥了重要作用，甚至在细胞死亡和肿瘤坏死发生之前。这可以解释本研究中观察到的使用外泌体DNA早期患者检测率略高的现象，也可能解释晚期患者检测率的一致性。在此基础上，后续临床试验阶段对该测定条件的进一步优化可以显著改善结果。
(全文结束)
