纳米医学创新中心（iCONM，中心主任：片冈一则教授）欣然宣布，由市木实验室副首席研究员上野真吾领导的研究小组所进行的研究已作为学术论文发表在《PNAS Nexus》上（注1），并于2月13日在线发表。
“肽连接酶介导的展示：用于亲和肽可调选择的无细胞平台”
作者：Shingo Ueno、Fumi Toshioka、Takanori Ichiki
DOI：10.1093/pnasnexus/pgag031
许多生物功能是由蛋白质三维结构形成的锁眼（受体）与完美匹配的分子（配体）结合所触发的机制开关来调节的。如果这个锁眼变形（蛋白质突变）或产生了错误的钥匙，生物功能就会受到破坏，从而导致疾病。药物发现研究涉及一个称为筛选的过程，旨在找到能适配这些受体锁钥位点的化合物。本文发表的内容提供了显著优势，极大地提高了这一过程的效率，并能够处理以往难以操作的高毒性蛋白质。其基础技术是在无需细胞的情况下，制造并利用每个携带单一肽（短链蛋白质）的磁珠。传统的使用活细胞生产肽的方法存在缺点，例如肽数量不一致导致数据不稳定。与传统方法相比，这种新方法实现了超过十倍的效率提升。此外，它能够在高温和高盐条件下进行筛选，显著缩短了药物开发中先导化合物发现所需的时间。详情如下。
研究背景
寻找与特定靶标精确结合的蛋白质和肽的技术是开发新药和诊断疾病的关键基础。迄今为止，已经开发了多种称为“展示技术”的方法来搜索与所需靶标结合的蛋白质（注2）。近年来，“无细胞蛋白质合成”——一种在试管中生产蛋白质而不使用大肠杆菌或酵母等活细胞的方法——已被广泛应用。这种方法无需细胞培养，因此可以更灵活、更高效地搜索靶蛋白。iCONM研究团队开发了一种新方法，将无细胞合成产生的蛋白质固定在可被磁铁吸附的小颗粒（磁性微珠，注3）表面。这项技术能够精确测量每个单个磁珠与其靶标的结合强度，从而只选择性能最佳的蛋白质。
研究成果
在这项研究中，我们利用了“肽连接酶”这种能将肽连接在一起的酶的特性。使用这种酶，我们开发了一种新技术，通过一个仅由九个氨基酸组成的短连接片段，将肽（短蛋白质片段）及其模板DNA牢固地锚定在小磁珠表面。我们将这种方法命名为“PL-display”。该技术的关键特点是在不使用任何活细胞的情况下，在单个磁珠上展示一种肽及其对应的DNA。此外，使用称为FACS（注4）的仪器，可以逐个检查磁珠，从而根据数值精确选择仅具有所需特性的磁珠。为了验证该技术是否正常运作，我们进行了以下实验。
首先，我们将两种标记肽（HA标签和His标签）的DNA等量混合，并将每种肽展示在磁珠上。然后我们加入只与每种特定肽结合的荧光标记抗体。与靶标结合的磁珠发出更强的荧光，使得FACS能够只选择最亮的磁珠。然后使用PCR（注5）扩增这些选定磁珠上附着的DNA，以确定它们包含哪些基因。结果证实，只有目标肽的基因被准确提取出来。此外，即使从仅含0.01%（万分之一）的HA标签基因的混合物中，我们仅通过一轮选择就成功完全分离出了HA标签基因。另外，从大约170万个随机序列的肽中，我们仅通过两轮选择就高效地收集到了与抗HA标签抗体结合的肽。
通过根据每个磁珠的荧光强度确定回收标准的严格程度，我们实现了“单次分选步骤中一万倍浓缩”的高效率，这在传统方法中是难以实现的。这表明，即使是从与实际药物发现研究中相似的多样化肽群体中，也可以快速识别出目标肽。
新颖性
该技术采用了称为“无细胞蛋白质合成”的方法。这是一种在试管中生产蛋白质而不使用活细胞的方法。因此，它不受细胞生长所需条件的限制，也不受单个细胞生产蛋白质方式差异的影响。此外，它可以毫无问题地研究对细胞有害的蛋白质或在不同于正常内部环境的特殊条件下的蛋白质。另外，在该技术中，蛋白质及其模板DNA通过牢固的键连接在一起，难以断裂。而且，每个磁珠只展示一种类型的蛋白质。这确保了即使在剧烈洗涤或高盐浓度等苛刻条件下也能保持稳定，从而可以精确评估“每个磁珠与其靶标的结合强度”。使用根据磁珠亮度（荧光强度）进行分选的FACS设备，研究人员可以自由且精细地设定标准，例如“只回收超过某个亮度阈值的磁珠”。
这种机制理论上不仅可以筛选具有非常强结合力的蛋白质，还可以筛选具有“恰到好处的结合力”——既不太强也不太弱——的蛋白质。
未来潜力与社会贡献
使用PL-display进行靶标结合蛋白的超高通量筛选预计将在包括药物发现、诊断和生物材料开发在内的广泛领域得到应用。这些应用包括寻找治疗性和诊断性肽及低分子量抗体，开发用于非生理环境的工业蛋白质，以及通过利用磁珠平台的自动化和机器人技术进行高速筛选。
注1： 《PNAS Nexus》是美国国家科学院于2022年创办的学术期刊，旨在传播打破学科界限（如新兴领域和跨学科研究）的高影响力研究。它定位于历史悠久的《美国国家科学院院刊》（PNAS）的延伸，在国内和国际上引起了广泛关注。
注2： 蛋白质展示技术是一种将蛋白质或肽与其对应的DNA或RNA序列物理连接起来，以确定所选蛋白质的基因序列的方法。代表性例子是噬菌体展示方法，该方法于2018年获得诺贝尔化学奖。
注3： 磁性微珠是含有磁性内核的微小颗粒。通过施加外部磁场，可以快速、选择性地从溶液中分离和回收它们。通过在其表面结合抗体或核酸，它们被用于捕获、纯化和浓缩特定分子。它们无需离心、使用方便，因此广泛应用于分子生物学和诊断学。
注4： FACS（荧光激活细胞分选）是一种利用激光逐个读取荧光标记的细胞或微粒，并根据荧光强度快速分选和回收它们的技术。因为它只能选择具有特定荧光信号的粒子，所以广泛应用于研究和医学领域的精确分析和分馏。
注5： PCR（聚合酶链式反应）是一种结合加热和冷却温度循环与酶反应，以指数方式扩增特定DNA序列的技术。其特点是能够快速复制大量目标序列，并有效扩增即使是微量的DNA。扩增后的DNA广泛用于序列测定、各种分析和特定序列的检测。
期刊： PNAS Nexus
DOI： 10.1093/pnasnexus/pgag031
研究方法： 实验研究
研究对象： 不适用
文章标题： Peptide ligase–mediated display: A cell-free platform for tunable selection of affinity peptides
文章发表日期： 2026年2月13日
利益冲突声明： S.U.和T.I.已就相关研究工作提交专利申请。
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