摘要
围产期窒息仍然是新生儿死亡的主要原因，也是导致永久性神经功能缺陷的重要因素。即使是轻度病例也可能导致长期的神经发育、认知、行为和精神障碍。然而，窒息引起的缺氧-缺血性脑损伤的机制仍不清楚，限制了在关键早期可塑期进行有针对性的干预。为了探索可能模拟人类观察到的精神神经障碍重要方面的围产期窒息的行为和分子结果，我们利用了出生后第7天大鼠的转化相关、非侵入性缺氧窒息模型。我们对窒息引起的变化进行了全面评估，整合了神经行为分析（评估认知、情感、社交和神经运动功能）、小胶质细胞形态分析、神经成像、应激激素测量和全转录组测序技术，以阐明急性和长期功能后果。与临床观察一致，广泛的功能评估显示了明显的性别依赖效应，包括焦虑和冲动增加、注意力缺陷和抑制控制受损，这些仅在雄性中观察到，没有明显的感官运动缺陷。这种在成年大鼠中类似于注意力缺陷多动障碍(ADHD)的表型与内侧前额叶皮层抑制性突触密度的持续增加相关。围产期窒息后急性炎症反应的发展以小胶质细胞表型转变、脑灌注和应激激素变化为标志。值得注意的是，在治疗相关的时间窗口内，通过系统性给予白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)阻断促炎性白细胞介素-1信号传导，减轻了小胶质细胞变化。重要的是，早期阻断促炎反应能够预防成年期的认知缺陷并使抑制性突触密度正常化。RNA测序分析显示窒息引起的分子通路失调，靶向GABA能信号传导，可能有助于随后的形态和精神神经改变。IL-1RA治疗似乎涉及不同的表观遗传调控机制，而不仅仅是逆转窒息后的急性期这些破坏。总的来说，这些发现表明围产期窒息导致注意力和抑制控制方面的显著行为缺陷，伴随着抑制性和表观遗传失调的持续存在，这些发生在内侧前额叶皮层小胶质细胞驱动的炎症过程急性诱导之前。系统性IL-1RA给药可能代表一种有前景的治疗机会，可预防围产期窒息引起的长期认知障碍。
引言
迄今为止，围产期窒息(PA)仍然是全球医疗系统的重要负担，也是儿童死亡的首要原因，占全球所有新生儿死亡的约23%(世界卫生组织，2022)。在幸存PA的婴儿中，约25%会发展为永久性神经功能障碍，范围从脑瘫、癫痫和脑视觉损伤到一系列精神神经障碍，同时可能对大脑以外的多器官造成损伤。即使是没有明显感官运动后遗症的轻度至中度PA，也与神经发育障碍相关，包括注意力缺陷多动障碍(ADHD)、自闭症谱系障碍、认知和沟通缺陷，或与压力相关的精神诊断，如焦虑或情感障碍。
尽管PA造成的巨大公共卫生问题和广泛的临床前努力来理解疾病机制，全身低温治疗仍然是中重度出生窒息的主要、最有效的、尽管广泛非特异性治疗方法。然而，研究表明，尽管进行了治疗性降温，估计约30%的幸存新生儿仍可能发展出长期精神神经缺陷。此外，低温治疗在低收入和中等收入国家的有效性仍在讨论中。炎症越来越被认为是PA诱导脑损伤的关键贡献者，影响神经元回路、胶质细胞和脑灌注。与此一致，临床和临床前研究证实炎症在包括神经发育障碍在内的多种精神神经疾病中认知功能障碍发展中的功能性作用。
已知会激活下丘脑-垂体轴(HPA轴)的早期生活压力范式已被证明会触发小胶质细胞功能的持久变化，影响其密度和表型（胞体大小、过程的长度和厚度）以及炎症反应，从而破坏其发育计划。此外，炎症介质和改变的胶质细胞表型已被认为通过与突触元素的相互作用，塑造负责高级认知处理的脑区损伤的轨迹，这些区域特别容易受到新生儿缺氧-缺血性损伤的影响。涉及小胶质细胞胞体大小增加和分支减少的表型转变以及促炎介质如白细胞介素-1(IL-1)的相关产生是氧化应激和神经损伤的公认贡献者。IL-1水平的升高与PA的严重程度密切相关。值得注意的是，小胶质细胞功能障碍和IL-1作用在生理条件和缺血后显著改变脑灌注。然而，这些神经免疫学相互作用导致轻度至中度PA中长期认知功能障碍的因果机制仍有待阐明。
内侧前额叶皮层(mPFC)是自上而下控制决策和行为调节的基本区域，在注意力和情绪功能方面起着重要作用。mPFC功能障碍已被认为与各种神经发育障碍相关，并与早期生活逆境的影响相关。因此，本研究聚焦于PA引起的mPFC功能、组织学和分子改变。
本研究的主要目标是调查PA可能通过哪些假定的神经炎症机制导致成年后观察到的行为和组织学改变，同时关注急性脑灌注和基因表达。为此，我们利用了一种转化相关的轻度至中度PA非侵入性啮齿动物模型，使我们能够通过急性药理学干预来破译小胶质细胞激活在影响疾病进展中的作用。这种方法旨在为PA诱导的精神神经障碍的病理生理学提供重要见解，并确定潜在的治疗靶点，以减轻PA的长期后果。
材料与方法
动物
实验遵循欧洲共同体理事会指令(2010/63/EU)、匈牙利国家卫生机构动物护理委员会(PEI/001/828-4/2015)指南，并获得匈牙利科学院实验医学研究所(HUN-REN IEM，布达佩斯，匈牙利)动物福利委员会的批准。使用来自HUN-REN IEM繁育群的雄性和雌性Wistar大鼠(查尔斯河实验室，德国)。有关饲养、繁育和幼崽处理的详细信息见补充材料和方法。
围产期窒息损伤(PA)
PA损伤的方法基于Pospelov等人在啮齿动物出生窒息模型中的开创性工作，该工作为该模型建立了关键的方法学和生理学基础，通过诱导PA期间酸碱平衡的病理生理改变，这些改变与在人类新生儿中观察到的非常相似。该模型进一步修改以适应我们的研究目的。在P7时，雄性和雌性幼崽被放置在等温治疗室中，并接受15分钟的窒息诱导气体混合物(4% O2和20% CO2在N2中)。有关PA诱导的详细信息见补充材料和方法。
行为测试
使用几个动物群进行行为评估，以避免过度测试并最大限度地减少潜在的测试间影响。行为测试的总体结构以及分配给每个群的特定测试在补充表4中提供。动物在P8进行急性严重程度评分，并在幼年和成年年龄进行长期效果评估。行为测试的详细描述见补充材料和方法。
免疫组织化学研究
为了检查表型修饰的组织学基础，对P8和成年雄性动物的亚组进行麻醉和经心脏灌注，并对mPFC切片进行免疫组织化学染色。固定、组织处理、荧光免疫染色、突触斑点和小胶质细胞形态分析的详细描述见补充材料和方法。
急性激素测量
为了估计PA引起的急性激素变化，从P7的雄性幼崽中收集躯干血液，用于基线条件(与母鼠分离后不到5分钟)和PA后(0小时、1小时、4小时和24小时)。通过放射免疫测定法(RIA)测定ACTH、皮质酮和醛固酮浓度，所有样本在同一测定中测量。血液采样、激素测量和分析的详细信息见补充材料和方法。
SPECT和MRI成像
通过1特斯拉MRI体积测量确定的葡聚糖包被氧化铁纳米颗粒在PA后24小时评估PA对脑血容量的影响。使用99mTc-HMPAO(六甲基丙烯胺肟；Medi-Radiopharma有限公司，布达佩斯，匈牙利)进行单光子发射CT(SPECT)成像测量脑灌注。方法学细节见补充材料和方法。
药理学治疗
为了评估和影响炎症相关机制在PA引起效果传递中的作用，雄性动物接受了皮下白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA，Kineret，瑞典孤儿生物vitrum AB)，剂量为100 mg/kg。将10 μl/g IL-1RA溶解在无菌0.1%牛血清白蛋白(BSA)中，稀释在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并在PA损伤后1小时和20小时给药，以影响PA诱导能量衰竭的主要和次要阶段。
RNA测序与分析
为了破译PA引起的急性基因表达变化，从P8和成年(6个月大)雄性动物的大脑中收获，在深度麻醉下显微解剖双侧内侧前额叶皮层(N = 8-10/治疗组)。RNA分离、文库制备和分析的详细信息见补充材料和方法。
统计分析
所有测量和分析均以盲法方式进行，遵循STAIR和ARRIVE指南。有关盲法、样本量计算和异常值排除的详细信息，请参阅补充材料和方法以及补充表7和8。行为数据以平均值±标准误表示。分别分析雄性和雌性治疗组的行为结果。使用GraphPad Prism 8.0.1、Python 3.10和R 4.2(小胶质细胞分析)进行统计分析。使用Shapiro-Wilk和Brown-Forsythe测试评估正态性和方差假设(补充表5)。当假设满足时，使用双尾非配对t-检验(t(df); p)。否则，应用Mann-Whitney U检验(U; p)。对于四组比较，使用双因素方差分析(ANOVA)与Tukey或Duncan事后检验。对多日行为测试使用重复测量方差分析。对涉及重复测量的行为测试评估球形假设。检测到违规时，使用Greenhouse-Geiser(GG)和Huynh-Feld(HF)估计进行校正(补充表6)。报告自由度和确切的p值；α设定为0.05。
结果
PA导致雄性长期情感和认知功能障碍
为了研究PA的长期功能后果，大鼠在幼年期或成年期接受了全面的行为评估，首先关注情感、社交和认知领域。成年PA动物表现出更高的焦虑，表现为高架十字迷宫(EPM)中开放臂探索减少。PA也影响了社交情感功能，如社交互动测试中社交嗅探时间减少所示。在游戏战斗测试、社交测试中的社交指数和居民-入侵者测试中的领地攻击方面未观察到差异。
功能测试在自动操作系统中揭示了PA动物在幼年和成年期间行为的实质性且特定的偏差。在延迟折扣任务中，一种用于量化啮齿动物冲动行为的敏感测试中，尽管两组在训练期间达到相似的大奖励偏好，PA动物表现出强烈的运动冲动增强趋势。此外，PA导致成年期5-CSRTT中显著的注意力缺陷。PA动物表现出学习和注意力障碍，进展更慢地通过需要更高注意力表现的阶段。这些缺陷在要求任务理解的阶段(阶段1)或需要更短刺激持续时间和更少遗漏的阶段(阶段6)尤为明显。
这些注意力缺陷与冲动增加的行为发现暗示PA动物可能向ADHD样表型转变，可能涉及mPFC。为了进一步验证这一假设，我们在成年期进行了Go/no-Go任务(为啮齿动物测试修改)，临床上诊断为ADHD的患者通常在此任务中表现不佳。两组在需要操作学习技能的Go任务中表现相似。然而，PA大鼠在no-Go阶段表现出正确的no-Go反应显著减少，表明抑制先前学习的操作反应的能力受损。这表明无法抑制优势反应，这是ADHD样行为的核心特征。这些发现表明PA可能与mPFC损伤相关，特别针对行为反应抑制。
通过幼年和成年开放场(OF)测试和EPM中的相似运动以及加速转棒测试中的跌落潜伏期，证实了迟发性粗大运动功能和协调缺陷的缺失。这些数据支持我们模型适用于研究窒息相关的精神后果，因为运动缺陷可能会掩盖精细的情感和认知干扰。
我们在幼年Y迷宫测试中未发现工作记忆的显著差异。PA动物表现出空间学习和记忆减少，如孔板测试中较低的正确反应百分比所示。成年PA动物在Morris水迷宫中表现出受损的空间学习，在试验中找到隐藏平台所需时间显著延长。
为了研究观察到的行为改变的性别依赖性，雌性动物接受了有针对性的评估。由于早期生活逆境已被证明会影响雌性的情感调节，我们还在条件性恐惧学习范式中研究了联想性情感学习。雌性PA动物在开放场中未表现出运动改变。在焦虑样行为、恐惧学习和习得以及社交性方面，对照组和PA雌性之间未发现差异。与雌性对照组相比，雌性PA动物在集合转移5-CSRTT中未显示学习、记忆或冲动的差异。尽管雌性也可能表现出分子改变，但我们专注于雄性进行下游分析，因为它们在PA后表现出最稳健的行为表型，为研究潜在的分子机制提供了更坚实的基础。
PA后雄性内侧前额叶皮层抑制性突触标记物的长期改变
鉴于文献中mPFC在注意力、记忆和行为抑制方面的既定作用，本研究中PA雄性观察到的行为缺陷可能反映了mPFC依赖性功能的损伤。因此，我们调查了该区域基本信号装置中可能持久受PA影响的潜在分子改变。共聚焦成像分析显示神经元数量无变化，由NeuN(+)细胞的密度表明。然而，IL中MBP(+)髓鞘碱性蛋白密度有明显增加。Iba1(+)小胶质细胞和GFAP(+)星形胶质细胞未观察到定量差异。
为了进一步评估可能持久受PA影响的兴奋性和抑制性神经传递的基本分子机制，我们量化了mPFC中的抑制性(VGAT阳性)和兴奋性(VGLUT1和VGLUT2阳性)突触。共聚焦图像分析显示PA动物中IL和PRL亚区域中VGAT(+)终末密度显著增加。相比之下，VGLUT1(+)和VGLUT2(+)兴奋性突触密度未观察到变化。围绕KV2.1(+)锥体细胞的周围体VGAT(+)突触显示出PRL和IL中密度增加。共定位分析显示围绕锥体细胞的VGAT突触与PV和CB1阳性斑点相关增加，表明PRL锥体细胞周围两种中间神经元类型的增加。相比之下，IL区域仅显示围绕KV2.1(+)锥体细胞的CB1(+)周围体抑制性突触增加。值得注意的是，PRL和IL中围绕PV(+)中间神经元的抑制性突触密度增加也被观察到。
为了进一步阐明PA后的长期分子变化，我们对成年PA和对照雄性在基线条件下的mPFC样本进行了RNA测序。虽然基因水平的差异未达到统计学显著性，但基因集富集显示与表观遗传调控和免疫反应相关的通路上调，以及运输和信号通路的下调。改变通路的分层聚类突出了涉及组蛋白甲基化、免疫功能、细胞信号传导和膜/突触传递的关键领域。
PA诱导急性应激激素激增和mPFC小胶质细胞表型改变，无神经功能缺陷
为了探索可能有助于观察到的长期行为和组织学改变的潜在急性功能改变，我们对PA后24小时内的雄性进行了全面表征，重点关注行为、应激激素水平、组织学和脑灌注改变。神经发育反射测试未显示右转反射测试、负向趋地性测试或超声波发声中的组间差异，表明无早期严重神经功能缺陷。
PA后应激激素破坏在急性期明显。在损伤后立即观察到血液ACTH水平显著升高，随后皮质酮和醛固酮水平在PA后1小时升高。有趣的是，两组都表现出低皮质酮水平，反映了新生儿应激低反应期(SHRP)的特点，在此期间醛固酮被认为在激素应激反应中起关键作用。
由于急性出现的局部和全身炎症反应在各种缺氧-缺血性脑损伤中认知功能障碍的发展中起着关键作用，对IL中的常驻小胶质细胞进行了PA后24小时的形态学分析。PA导致急性小胶质细胞形态转变，表现为分支计数和分支密度(分支指数)显著减少，以及胞体大小的趋向性增加。治疗组表现出相似的小胶质细胞密度。
SPECT和MR成像揭示PA引起的细微急性灌注变化
为了定量评估PA后24小时的中枢神经系统(CNS)灌注变化，通过使用99mTC-HMPAO的SPECT成像和T1加权MRI分别测量雄性区域脑血流量(rCBF)和全脑血容量。未识别出总体脑血容量的差异。然而，SPECT成像显示PA动物中PFC(图3M)和丘脑(图S4E)的相对灌注有强烈趋向性增加，小脑(图S4F)显著增加。这些发现表明PA后存在相对损伤后区域灌注增加和细微循环障碍。
IL-1RA改善PA雄性的长期缺陷并影响小胶质细胞形态改变
为了阻断IL-1信号传导，一种内源性竞争性抑制剂IL-1RA在治疗相关的时间窗口内给药，即PA后1小时和20小时。为了评估IL-1RA对情感和认知领域长期影响，我们专注于评估高架十字迷宫和5-CSRTT测试中的焦虑和注意力缺陷，这些代表了我们模型中最受影响的行为结果。IL-1RA能够预防成年PA雄性在5-CSRTT中观察到的注意力缺陷。具体而言，IL-1RA治疗使动物的获得阶段高于对照水平，提出了IL-1RA对PA诱导的长期注意力和学习困难的保护作用。IL-1RA给药不影响高架十字迷宫测试中通过开放臂花费的时间百分比测量的焦虑水平。
急性小胶质细胞形态分析显示PRL和IL区域的mPFC中PA和IL-1RA治疗的显著影响(方法学由Clarke及其同事建立并检查62个参数)。在PRL中，IL-1RA对PA雄性小胶质细胞胞体大小有降低作用。然而，无论是否给予IL-1RA治疗，PA动物的小胶质细胞分支都减少。在IL中，PA导致小胶质细胞胞体大小显著增加。此外，IL-1RA治疗对PA动物的分支分支有显著影响。
形态特征与治疗组的相关性分析证实PA小胶质细胞表现出更大的胞体。相反，描述分支的特性以及回归系数(分支数对数与半径对数之间的线性回归斜率)在对照组中较高。使用随机森林分类器(RF)，我们确定胞体大小、最大分支数和最大交叉点半径是区分治疗组的最重要参数。比较PA载体和PA IL-1RA组，平均分支长度、交叉点数量和回归系数与治疗的相关性最强。此外，RF揭示空隙率(细胞掩模中不均匀性的度量)是组间最具区分性的因素，以及与分支和分支相关的各种特性。
对成年雄性中VGAT斑点的组织学分析证实了PA引起的抑制性突触终端增加。这在IL中通过早期IL-1RA治疗得到改善，但在PRL中没有。
这些结果表明，IL-1RA的急性给药可以快速调节小胶质细胞反应并影响长期抑制平衡和行为，提出了一种特定且可访问的PA诱导改变的治疗方法。
转录组分析揭示PA急性改变的分子通路
为了阐明PA后的急性分子和通路改变，我们对PA后24小时分离的mPFC样本进行了RNA测序。差异基因表达分析显示Dbp(白蛋白启动子结合蛋白D位点)和Igsf9(免疫球蛋白超家族成员9)基因显著上调，后者对抑制性突触发育至关重要。我们观察到Col24a1的下调，这是一种参与细胞外基质发育的胶原家族成员。我们还注意到Camk4的下调，它编码钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV型，是钙信号传导的关键介质，对神经元和免疫细胞功能至关重要。
功能基因集富集分析揭示PA强烈抑制与有氧电子传输和代谢过程相关的通路，同时激活涉及改变的表观遗传修饰的通路。观察到配体门控阴离子通道和GABA受体活性的显著改变。显著改变通路之间的成对相似性分层聚类确定了与有氧能量传输、神经发育、细胞周期调控和膜/突触传递相关的主要聚类。最后，PA动物中的IL-1RA治疗导致转录后和翻译后修饰的实质性改变，以及解毒通路的激活。这些变化伴随着代谢通路改变，可能有助于行为和组织学分析中观察到的挽救表型。
讨论
本研究探讨了急性神经炎症机制对PA长期精神神经后果的贡献，对早期有针对性的治疗干预具有启示意义。我们使用了基于Ala-Kurikka等人基础工作的啮齿动物PA模型，部分修改以符合我们的目标，探索长期行为后果。该模型对近足月人类患者具有转化相关性，考虑了新皮质发育和PA期间酸碱平衡的病理生理变化。我们的PA模型不涉及颈动脉结扎，因此不会引起局灶性损伤或手术相关炎症，这会将PA的神经免疫学特征转向不利于转化解释的方向。
我们使用自上而下的方法研究PA的后果。对两性的广泛行为评估后，对雄性动物进行组织学分析、全面基因表达分析和药理学干预。雄性动物的行为数据揭示了特定的精神神经缺陷，突出了认知障碍、注意力和学习表现下降以及情感障碍、焦虑和冲动增加。这些功能障碍的集合可以解释为向ADHD样表型的转变，一种在人类患者中经常与焦虑障碍共病的神经发育障碍。这种表型已被反复认为是PA的潜在后果。因此，我们的模型可能更好地捕捉PA幸存者中观察到的临床结果的异质性，反映了一系列障碍——从细微的行为缺陷到更明显的功能障碍——而不是标准临床前模型中通常诱导的均匀严重改变。
围产期是中枢神经系统易感性增加的关键阶段，对健康的突触发生、GABA能信号传导、胶质发生和髓鞘形成至关重要。先前关于PA的研究主要集中在前额叶皮层区域、海马体和杏仁核等高级处理区域，所有这些都与神经发育障碍密切相关。mPFC是自上而下控制各种高级认知过程的关键区域，如决策、情绪调节和注意力。我们的模型导致雄性动物中mPFC抑制性突触的持久增加，同时保持神经元和兴奋性突触数量。mPFC抑制性突触的干扰与注意力缺陷、冲动控制和焦虑样行为相关。这些改变可能导致可塑性关键时期广泛的神经病理学，可能促成PA的精神神经后果。我们的观察与文献一致，表明抑制性中间神经元特别容易受到围产期损伤和缺氧的影响，这是由于其高代谢需求和对氧化磷酸化的依赖。这支持将神经发育障碍描述为"中间神经元病"，强调GABA能发育和回路改变作为关键组织病理学特征。此外，发育期间的小胶质细胞反应性对于神经元回路的精炼至关重要，特别是涉及GABA能信号传导的回路，这在病理条件下变得至关重要。
炎症在围产期神经发育障碍的编程中起着关键作用。与转录组和蛋白质组变化密切相关的小胶质细胞形态是炎症的敏感标志物。我们检查了PA诱导的雄性小胶质细胞急性形态学改变，观察到的炎症转变支持我们模型适用于研究轻度PA的机制。受损的炎症生态位可能会干扰神经发育计划。已被证明受早期生活压力影响的小胶质细胞会失去其长期突触小体吞噬功能，导致突触终端增加。此外，GABA受体小胶质细胞已被证明仅在出生后期间选择性地与抑制性突触相互作用。可以假设PA导致这种复杂和特定功能的丧失，更显著地影响抑制性突触发育。
目前尚不清楚小胶质细胞IL-1RA(已涉及炎症反应的分子机制)是否在PA相关炎症改变中起作用，或者IL-1RA在此实验模型中是否靶向其他细胞类型。尽管如此，IL-1诱导的神经炎症是氧化应激和神经元损伤的公认贡献者。我们的发现支持这一观点，表明IL-1R的药理学阻断导致mPFC中小胶质细胞形态的改变以及组织学和行为后遗症的部分改善，特别是雄性中的学习和注意力。IL-1RA可能影响认知，而不会在此模型中显著影响焦虑等情感行为。这种领域特异性可能归因于小胶质细胞功能特征的区域差异、IL-1对其他细胞的作用，或IL-1信号传导对回路特异性过程的不同影响，符合脑区域对IL-1RA治疗敏感性的差异。此外，调节这些行为领域的不同回路参与其中。注意力和执行控制严重依赖于mPFC-丘脑-纹状体回路，其中IL-1受体表达在成年啮齿动物中遵循高度组织化的模式，并且白细胞介素已被建议通过影响突触可塑性、神经炎症和神经元兴奋性来调节工作记忆和执行功能。相比之下，焦虑样行为更多地由杏仁核-海马-下丘脑网络控制，其中IL-1信号传导可能发挥不同作用，可能涉及神经调节系统。我们模型中这些回路的发育阶段增加了复杂性，因为神经免疫相互作用可能随着成熟而演变。此外，这些区域中小胶质细胞的密度和激活谱以及局部回路对IL-1RA的敏感性可能显著不同。这些差异可能构成我们观察到的行为选择性的基础。需要进一步研究来阐明IL-1如何调节功能不同的回路并确定脑区域对IL-1RA治疗的敏感性。
由于IL-1R的抑制已用于炎症性疾病的管理，抑制小胶质细胞IL-1信号传导似乎可行，并且对减轻PA背景下神经炎症具有转化相关性。先前在早期生活疾病的不同模型上的临床前研究表明，IL-1RA可以有效减少炎症和组织损伤，没有报告的副作用。然而，IL-1RA的免疫调节特性需要仔细考虑，特别是在新生儿免疫脆弱性的背景下。在成人患者人群中，尽管IL-1RA通常耐受良好，但已报告皮肤刺激和感染并发症，特别是长期使用或在免疫受损个体中。重要的是，最近的临床试验已经开始评估IL-1RA在极早产新生儿中给药的安全性、可行性和药代动力学，这将有助于指导围产期背景下未来的应用。
此外，来自女性受试者的数据突出了经常观察到的PA诱导的精神神经缺陷的性别依赖性易感性。这种变异性可能部分归因于围产期炎症反应和小胶质细胞功能的性别二态性。
PA雄性mPFC中差异表达基因的分析支持了明显的急性突触失调。值得注意的是，Igsf9的上调已知在神经祖细胞中由缺氧诱导。相反，PA导致Col24a1的下调，Col24a1是一种细胞外基质(ECM)成分，可能被PA破坏。两者都是轴突生长、突触分化和抑制性突触维持的既定调节因子。此外，Camk4下调与啮齿动物中突触可塑性受损、学习缺陷和焦虑相关。此外，IL-1β已被证明导致昼夜节律相关转录激活基因Dbp的失调。Acss2的上调可能在缺氧条件下对缺氧诱导因子2乙酰化起关键作用。我们全面的基因集富集分析表明PA诱导线粒体能量传输和ATP代谢的调整以及细胞周期调控的改变，与先前文献一致。值得注意的是，分析突显了GABA相关信号传导的变化，支持我们关于抑制性突触对PA增加敏感性的发现。
最近的文献表明，PA引起的长期转录组变化的程度和性质似乎取决于损伤严重程度和随时间的补偿机制。我们在成年雄性中的通路分析显示表观遗传调控的细微改变，以及免疫和信号通路的变化。这些发现支持PA的长期效应主要由表观遗传机制介导的观点，这些机制可以影响基因调控，而不一定产生稳定mRNA水平的大而持续的变化。表观遗传修饰已被认为参与大脑发育关键时期活动依赖性基因调控，其失调可能导致神经元功能和行为结果的持久改变。此外，早期生活压力可能增加对成年后后续挑战的易感性，暗示基因表达差异可能在继发性应激源后出现，突显了在今后研究中调查此类效应的重要性。
急性IL-1RA治疗导致转录后和翻译后过程的显著改变，包括组蛋白修饰、mRNA剪接和蛋白质甲基化。PA可能触发缺氧的关键细胞反应调节剂，如缺氧诱导因子1α(HIF-1α)，它与组蛋白乙酰转移酶和脱乙酰酶相互作用以调节染色质可及性。此外，由IL-1β诱导的NF-κB介导的炎症反应与染色质重塑密切相关，已证明在PA后增加。IL-1β还调节RNA结合蛋白和剪接因子，在缺氧应激下破坏正常的mRNA加工。这些通路可能被药理学IL-1抑制部分抑制。IL-1RA治疗调节这些过程的事实支持神经炎症信号可以影响表观遗传修饰的假设，并表明IL-1RA参与不同的调控机制，而不是直接抵消PA破坏的通路。
从PA损伤后24小时血流变化的神经成像推导出的病理性高灌注变化已知会触发自由基和一氧化氮驱动的损伤和炎症。有趣的是，在对认知和情感功能至关重要的脑区域中观察到过度的相对灌注，这些区域在发育期间具有高代谢活性，使它们特别容易受到缺氧的影响。与此一致，正常小胶质细胞功能对于适应脑低灌注至关重要，这可能被炎症转变所干扰。因此，急性灌注神经成像可能是在轻度至中度PA情况下有价值的预后工具。
PA导致应激相关激素的急性爆发，证明其作为激活HPA轴的早期生活压力范式的能力。有趣的是，在P7我们观察到皮质酮水平降低，同时醛固酮和ACTH增加，突显了新生儿应激低反应期的特征特点，在此期间醛固酮被认为在激素应激反应中起关键作用。
本研究在代表围产期适应机制和免疫环境方面存在局限性，这些机制和环境无疑会影响人类新生儿中PA的进程。此外，将雄性和雌性动物结合在一个队列中的未来研究应正式测试性别之间的相互作用，以提供行为改变差异的正式证据。此外，雌性在行为测试期间未评估发情周期阶段；在不破坏复杂多日行为研究完整性的情况下这样做将具有挑战性。将此类评估纳入未来研究对于获得对发情周期阶段如何影响行为的透彻理解至关重要。我们的重点主要放在mPFC上，由PA的行为后果驱动。其他涉及高级处理的关键脑区和回路以及细胞类型特异性基因表达变化值得进一步调查。
总之，我们使用了一种转化相关的轻度至中度PA啮齿动物模型，该模型提供了一种手段来研究后来出现的细微神经炎症机制，这些机制在雄性动物中表现得特别明显，并且与人类患者中观察到的非常相似。我们的发现强调了急性给药的针对性抗炎治疗(IL-1RA)对PA雄性组织学和行为后果的短期和长期治疗效果。这些结果表明，IL-1RA可能作为早期预防免疫介导的认知缺陷的有前景的治疗选择，有助于优化临床环境中PA的治疗策略。
数据可用性
本研究期间生成和分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获取。RNA测序数据已存入NCBI基因表达综合库，可通过GEO系列登录号GSE295589访问。
【全文结束】
