簇集素(Clusterin, Clu)在老年造血干细胞(HSCs)中通过调控线粒体功能驱动髓系分化偏向。研究发现，Clu在老年HSCs中上调，其敲除可减少髓系偏向，而过表达则增强这种偏向。机制上，我们展示了年龄依赖性的Clu表达增加导致线粒体过度融合和氧化磷酸化(OXPHOS)的增强，伴随ROS增加，这激活了p38 MAPK信号通路，从而增加了Cebpb的表达。作为一个驱动髓系细胞分化的关键转录因子，Cebpb的上调导致老年HSCs的髓系分化偏向。Clu的缺失可以逆转这种偏向并减轻衰老相关的功能衰退。因此，我们的研究揭示了老年HSCs髓系分化偏向的机制，并提出通过调控Mfn2-OXPHOS-p38-Cebpb轴作为一种有前景的老年造血和免疫系统再生策略。
确定Clu为老年HSCs髓系偏向的调节因子
HSCs在衰老过程中逐渐失去再生潜力并产生髓系偏向输出，导致对感染的免疫反应不佳。与之前的报道一致，我们观察到相对于淋巴细胞(B和T细胞)，髓系细胞频率增加；LT-HSCs频率增加；共同淋巴祖细胞频率减少；CD41+或CD61+老年HSCs(oHSCs)频率增加。为了了解衰老过程如何导致HSCs功能衰退，我们将oHSCs与年轻HSCs(yHSCs)的转录组进行了比较，确定了77个在oHSCs中显著上调的基因。通过与之前鉴定的740个衰老特征基因列表交叉分析，我们进一步缩小到50个基因。根据四个标准对这些基因进行排名：(1)候选基因的表达量(FPKM)，(2)调整后的P值，(3)倍数变化，(4)在衰老特征中的表现一致性，得到进行体内CRISPR失活筛选的23个顶级候选基因。我们还纳入了六个在造血过程中具有已知功能的基因(Foxo3、Sphk2、Selp、Dnmt3a、Hsf1和Sirt2)，以探索它们在调节老年HSCs分化中的潜在作用。
为了识别参与调节老年HSCs造血功能的基因，我们使用了一种基于体内条形码的CRISPR筛选方法。我们在分离自老年Cas9小鼠(24个月)的oHSCs中进行CRISPR基因编辑。针对候选基因构建了包含三种sgRNA/基因且每种sgRNA带有五个不同条形码的慢病毒文库。表达Cas9的oHSCs被感染这些文库(称为起点oHSCs(sp-oHSCs))，然后移植到致死照射的CD45.1受体小鼠体内。五个月后，收集受体小鼠的外周血和骨髓，按造血细胞类型(CD11b+髓系细胞、CD3+ T细胞、B220+ B细胞和LSK CD48− CD150+ HSCs，以下简称终点oHSCs(ep-oHSCs))进行分选，进行sgRNA测序和富集分析。
我们的筛选系统允许进行三对配对比较，揭示这些基因的失活效应如何影响sp-oHSCs向成熟B细胞、T细胞和髓系细胞的谱系承诺(称为分化潜能)。结果分析发现了几个基因在调节HSCs分化到特定造血谱系中的关键作用。例如，Cd38和Clu敲除(KO)强烈促进B细胞和T细胞的分化，而Gstm2和Foxo3 KO则强烈促进髓系分化，这与先前关于Foxo3 KO导致髓系增生综合征的研究一致。重要的是，我们的筛选方法允许直接配对比较髓系和淋巴系谱系，揭示哪些基因的失活导致老年HSCs的分化偏向。结果显示Clu、Cd38、Gstm2和Hsf1是最显著的基因。我们还比较了B、T、髓系细胞与ep-oHSCs，反映了ep-oHSCs向成熟免疫细胞的分化，并揭示Clu、Gstm2、Cd38和Sphk2是最显著的基因。抑制Sphk2可维持长期自我更新并增加再生潜能。与此一致，我们的筛选也表明Sphk2的缺失促进了oHSCs的分化。最后，四对配对比较确认Clu和Cd38是共同基因，其功能丧失导致淋巴系分化增加。
操控Clu水平影响HSCs的分化
作为负责NAD+代谢的酶，Cd38在衰老中的作用已被充分记录。因此，我们的研究聚焦于Clu，但会在适当情况下使用Cd38作为对照。Clu被报道为一种以ATP非依赖方式运作的哺乳动物分泌型分子伴侣。除了作为细胞外分子伴侣外，Clu还被提出在细胞质中发挥多种作用，包括调控肿瘤发生、线粒体介导的凋亡，其积累与神经退行、阿尔茨海默病和衰老相关。此外，Clu可能在病理上起到抑制剂或增强剂的作用。尽管Clu在oHSCs中显著上调，但尚不清楚Clu是否能主动调节oHSCs的功能。为了验证我们的筛选结果，将靶向Clu(sgClu)的sgRNAs和编码Clu开放阅读框的cDNAs分别克隆到慢病毒载体中用于敲除(KO)或过表达(OE)。Cd38 KO和OE平行进行以便对比。为了测试Clu对HSCs体外分化的影响，分别感染表达Cas9的培养oHSCs和野生型(WT) yHSCs，以敲除或过表达Clu。感染八天后，基于髓系标记物(FcR+/Mac-1+)或巨核细胞比例对细胞进行分选和定量。Clu KO oHSCs表现出髓系分化减少但不影响巨核细胞分化比例，而Clu OE yHSCs则显示出髓系分化增加和巨核细胞比例上升。类似的结果也在Cd38 KO和OE中获得。有趣的是，Clu OE对髓系分化的影响比Cd38更显著。此外，集落形成单位(CFU)实验确认Clu KO oHSCs减少了单能成熟集落(BFU-E和CFU-GM)，增加了多能未成熟集落(CFU-GEMM)，表明Clu KO oHSCs丧失了髓系分化并增强了静止状态。综上所述，这些结果表明Clu和Cd38在体外均对促进髓系和巨核细胞分化有作用。
我们接下来评估了Clu在体内的作用。将Clu KO或OE HSCs移植到受体小鼠中，并分析外周血和骨髓组成。Clu KO增加了淋巴系、减少了髓系和增加了oHSCs的B细胞输出，表明Clu对髓系偏向分化有正面贡献。与此一致，yHSCs中Clu的OE导致了淋巴系减少、髓系增加和B细胞输出减少。这些结果表明，操控HSCs中的Clu水平会影响相对淋巴系和髓系输出。由于长期重建能力的丧失是老年HSCs的一个特征，我们评估了oHSCs中Clu KO和yHSCs中Clu OE对其重建能力的影响。Clu KO在oHSCs中随着时间推移增加了外周血嵌合率，表明增强了植入能力和长期重建潜能。相反，Clu OE在yHSCs中导致嵌合率下降，表明植入能力不足。对于Cd38的操控获得了相似但较弱的效果。
除了髓系偏向分化外，与年龄相关的胸腺退化也导致免疫衰老，这对免疫功能障碍有贡献。老年小鼠胸腺中双阳性(DP)T细胞(CD4+/CD8+)群体的减少表明严重的胸腺退化。因此，我们分析了移植Clu KO oHSCs或Clu OE yHSCs的受体小鼠胸腺亚群的变化。我们发现Clu KO在oHSCs中导致DP T细胞扩展，而Clu OE在yHSCs中导致DP T细胞减少，表明Clu KO改善了胸腺内T细胞发育相关的T细胞输出和造血功能，而Clu OE则相反。
总体而言，这些结果表明oHSCs中Clu的上调有助于持续的髓系偏向分化，而Clu功能丧失则使分化转向淋巴系谱系。
操控Clu影响祖细胞频率
除了外周血，我们还分析了Clu在HSCs中的操控对多能祖细胞(MPPs)细胞分化的影响。为此，移植后四个月从受体小鼠骨髓中分离出造血干细胞和祖细胞(HSPCs)。利用描述的门控策略，通过流式细胞术分析了长期HSCs(LT-HSCs)、短期HSCs(ST-HSCs)和MPPs。MPP亚群进一步分为CD135−髓系启动祖细胞(MPP3)和CD135+淋巴系启动祖细胞(MPP4)。Clu KO在oHSCs和Clu OE在yHSCs中并未改变LT-HSC、ST-HSC或MPP的相对百分比。然而，Clu KO在oHSCs中减少了髓系启动的MPP3，并增加了淋巴系启动的MPP4百分比，而Clu OE在yHSCs中则增加了MPP3s并减少了MPP4s，表明Clu表达诱发了髓系启动和淋巴系启动MPPs的比例变化。
总体而言，这些结果表明Clu在调节HSC分化中发挥了重要作用，Clu缺乏增加oHSCs分化为淋巴系启动的祖细胞，而Clu OE则增加yHSCs分化为髓系启动的祖细胞。
Clu影响线粒体形态和代谢
为了理解oHSCs中Clu KO如何逆转髓系偏向分化，我们对外周血移植后四个月的oHSCs进行了RNA测序(RNA-seq)，并鉴定了723个下调和466个上调的基因。对上调基因的基因本体(GO)富集分析鉴定了多个与线粒体功能相关的术语，包括线粒体RNA代谢过程、线粒体转录和自噬正向调控，表明Clu可能在线粒体功能中发挥作用。
Clu的积累以前与衰老和衰老相关疾病有关。然而，Clu在HSCs特别是老年HSCs中的作用未知。鉴于其在线粒体中的潜在作用，我们检查了Clu蛋白在oHSCs中的位置。我们发现Clu主要与线粒体共定位，因为它很大程度上与外线粒体膜转位酶20(Tom20)重叠，Tom20是线粒体网络形态的一个标志物。使用已发表的方法量化了HSCs中的线粒体长度。有趣的是，oHSCs比yHSCs拥有更多的线粒体，平均长度更长并且网络更复杂，表明oHSCs中存在高度融合的线粒体网络。重要的是，Clu缺失在oHSCs中减少了平均线粒体长度。
功能性线粒体分裂机制能够正确分离线粒体网络的功能失调成分，并通过线粒体自噬促进其降解。基于自噬相关的GO术语和Clu增加引起线粒体融合的发现，我们假设oHSCs中高度融合的线粒体网络伴随着线粒体自噬的下降。为了检验这一假设，我们测量了Tom20与溶酶体标志物Lamp2a的共定位，这是线粒体自噬流量的一个指标。Clu KO不仅减少了oHSCs中的线粒体网络(Tom20染色)，还增加了Tom20与Lamp2a的共定位，表明Clu缺失减少了高度融合的线粒体并促进了线粒体自噬以清除受损线粒体。
线粒体在维持代谢稳态方面发挥着重要作用。压力和衰老都会破坏代谢稳态，导致氧化磷酸化(OXPHOS)和代谢活动增加，伴随干细胞功能受损。此外，丙酮酸脱氢酶激酶3(Pdk3)在HSC静止和干细胞维持的代谢检查点中发挥关键作用。丙酮酸脱氢酶激酶可以通过抑制丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物活性来负向调节葡萄糖到OXPHOS的转换，防止丙酮酸进入TCA循环。有趣的是，Clu KO在oHSCs中增加了Pdk3 mRNA水平，但不影响Pdk1或Pdk2，这促使我们分析Clu KO是否导致代谢变化。使用Seahorse mito stress实验，我们发现Clu KO导致oHSCs的基础呼吸和最大呼吸降低，这表明老年HSCs的代谢率切换回更为静止的状态，这是年轻LT-HSCs的特征。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是代谢过程的关键中介，在维持代谢稳态中发挥重要作用。对涉及NAD+生物合成和消耗的酶分析表明，只有Cd38表达在oHSCs中显著增加。与年龄相关的Cd38增加一致，HSCs中的NAD+水平呈现出年龄相关的下降。NAD+水平的下降是由于HSCs中Cd38的年龄相关增加，因为Cd38 KO而不是Clu KO显著提高了NAD+水平。这些结果表明Cd38缺失通过增加NAD+水平有助于线粒体稳态。与它在线粒体稳态中的作用一致，Cd38 KO也降低了oHSCs的最大呼吸，但效果不如Clu KO显著。
oHSCs中Clu和Cd38上调引起的OXPHOS增加促使我们测量ROS，因为它们是衰老和线粒体代谢途径的关键特征。我们发现Clu或Cd38 KO减少了ROS生产，如MitoSox标记减少所示。由于ROS可以诱导DNA损伤，我们通过染色双链断裂标志物γ-H2AX测量DNA损伤，发现Clu或Cd38 KO减少了双链DNA断裂。同样，Clu或Cd38 KO也减少了53BP1信号。总体而言，这些数据表明Clu或Cd38 KO减少了OXPHOS、ROS和DNA损伤。
总之，这些结果表明Clu在HSCs衰老过程中调节线粒体功能方面发挥着至关重要的作用。Clu KO使oHSCs的代谢转向yHSCs，减少了OXPHOS，这改善了线粒体代谢的适应性。
Clu通过与Mfn2相互作用促进线粒体融合
为了理解Clu KO如何影响线粒体功能，我们进行了透射电子显微镜分析，发现Clu KO的oHSCs具有小而圆的线粒体，而Ctrl oHSC具有细长和肿胀的线粒体，这与我们免疫荧光数据显示Clu KO减少平均线粒体长度一致。这表明Clu可能在调节线粒体形态动力学中发挥作用。
虽然Clu被报道为一种细胞外伴侣蛋白，但后续研究表明它在细胞质中有多种角色。翻译后，Clu被运输到内质网(ER)腔中，在那里去除22-mer ER信号肽。在运输到高尔基体后，Clu被切割成通过二硫键连接的α和β亚基。这种异源二聚体形式(分泌型Clu (sClu))随后被分泌出细胞。然而，在压力条件下，未切割的全长Clu直接从ER释放到细胞质(胞质Clu (cClu))以执行其细胞内功能。有趣的是，Clu可以紧密附着在线粒体上，通过与激活的Bax相互作用来抑制癌细胞中的凋亡。Clu还破坏COS-7细胞中的线粒体分布模式。此外，据报道，不带外显子2翻译的Clu会定位于细胞核(nClu)以调节细胞凋亡。
PCR使用HSCs的cDNAs并经电泳分析显示存在外显子2，表明HSCs中不存在nClu形式。由于Clu OE增加了yHSCs的髓系输出，我们询问细胞外sClu是否具有相同的效果，通过将重组小鼠Clu(rClu)加入WT yHSCs的培养基中，然后分析培养8天后的髓系输出。与PBS对照相比，rClu的存在并未改变Mac-1+/FcR+髓系输出，而IL-1β（一种已知的髓系分化诱导剂）处理显著增加了髓系输出。巨核细胞中也获得了类似的结果。这些结果表明，细胞内的Clu而非细胞外的Clu负责Clu OE在yHSCs中观察到的髓系输出增加。
鉴于Clu在ER应激下滞留于细胞质中，我们推测年龄相关的应激可能会导致Clu在细胞质中的滞留。Western blot分析表明，与yHSCs相比，oHSCs中未切割的全长cClu增加，而切割的sClu减少，表明随年龄增长从sClu向cClu的转变。cClu和线粒体高度融合的同时增加促使我们询问cClu是否定位于线粒体。为此，我们感染了HSCs，使其表达带有v5标签的全长cClu，该标签去除了ER信号肽以防止分泌。免疫染色证实cClu-v5与HSCs中的线粒体共定位，与老年HSCs中内源性Clu的线粒体定位一致。
为了理解Clu KO如何影响线粒体功能，我们进行了透射电子显微镜分析，发现Clu KO的oHSCs具有小而圆的线粒体，而Ctrl oHSC具有细长和肿胀的线粒体，这与我们免疫荧光数据显示Clu KO减少平均线粒体长度一致。这表明Clu可能在调节线粒体形态动力学中发挥作用。
尽管Clu被报道为一种细胞外伴侣蛋白，但后续研究证明其在细胞质中有多种作用。翻译后，Clu被运输到内质网(ER)腔中，在那里去除22-mer ER信号肽。在运输到高尔基体后，Clu被切割成通过二硫键连接的α和β亚基。这种异源二聚体形式(分泌型Clu (sClu))随后被分泌出细胞。然而，在压力条件下，未切割的全长Clu直接从ER释放到细胞质(胞质Clu (cClu))以执行其细胞内功能。有趣的是，Clu可以紧密附着在线粒体上，通过与激活的Bax相互作用来抑制癌细胞中的凋亡。Clu还破坏COS-7细胞中的线粒体分布模式。此外，据报道，不带外显子2翻译的Clu会定位于细胞核(nClu)以调节细胞凋亡。
PCR使用HSCs的cDNAs并经电泳分析显示存在外显子2，表明HSCs中不存在nClu形式。由于Clu OE增加了yHSCs的髓系输出，我们询问细胞外sClu是否具有相同的效果，通过将重组小鼠Clu(rClu)加入WT yHSCs的培养基中，然后分析培养8天后的髓系输出。与PBS对照相比，rClu的存在并未改变Mac-1+/FcR+髓系输出，而IL-1β（一种已知的髓系分化诱导剂）处理显著增加了髓系输出。巨核细胞中也获得了类似的结果。这些结果表明，细胞内的Clu而非细胞外的Clu负责Clu OE在yHSCs中观察到的髓系输出增加。
鉴于Clu在ER应激下滞留于细胞质中，我们推测年龄相关的应激可能会导致Clu在细胞质中的滞留。Western blot分析表明，与yHSCs相比，oHSCs中未切割的全长cClu增加，而切割的sClu减少，表明随年龄增长从sClu向cClu的转变。cClu和线粒体高度融合的同时增加促使我们询问cClu是否定位于线粒体。为此，我们感染了HSCs，使其表达带有v5标签的全长cClu，该标签去除了ER信号肽以防止分泌。免疫染色证实cClu-v5与HSCs中的线粒体共定位，与老年HSCs中内源性Clu的线粒体定位一致。
由于Clu调节线粒体形态动力学，我们询问了Clu是否与线粒体融合或裂变的调节因子相互作用。为此，我们在HSPC细胞系HPC7中共表达了带有v5标签的cClu与带有myc标签的线粒体融合因子Mfn1或Mfn2，或裂变因子Drp1。共免疫沉淀后进行Western blot分析显示，Clu-v5与Mfn2-myc强烈相互作用，并与Mfn1-myc轻微相互作用，但不与Drp1-myc相互作用。我们接下来询问内源性Clu是否与骨髓谱系阴性HSPCs中的Mfn2或Mfn1相互作用。使用Clu抗体进行免疫沉淀不仅沉淀了Clu，还强烈沉淀了Mfn2和轻微沉淀了Mfn1，表明Clu可能通过与Mfn2和Mfn1相互作用促进线粒体融合。
接下来，我们询问Clu刺激的线粒体融合是否需要Mfn1和Mfn2的存在。我们在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞中测试了这一点，因为MEFs允许以Mfn1和Mfn2依赖的方式监测线粒体形态。我们评估了在Clu OE存在或不存在的情况下线粒体形态(超融合、细长或碎片化)，使用Mfn1 KO或Mfn2 KO MEF细胞系。Clu OE导致线粒体超融合并增加长度，与WT对照相比。在Mfn1或Mfn2 KO MEFs中观察到增加的碎片化。在Mfn1 KO MEFs中，Clu OE显著增加了细长线粒体的百分比，但在Mfn2 KO MEFs中，Clu OE未能实现此效果，表明Clu刺激的线粒体融合需要Mfn2。
我们接下来询问在HSCs中是否如此。我们构建了同时过表达Clu并沉默Mfn1或Mfn2的慢病毒。然后分析了Clu的定位和线粒体形态。与对照yHSCs相比，Clu OE显示出短线粒体(<0.75 μm)的伴随减少以及0.75至1.5 μm和>1.5 μm线粒体的增加。重要的是，shRNA介导的Mfn2敲低减少了Clu与线粒体的共定位并损害了Clu促进线粒体融合的能力。然而，Mfn1敲低并未引起Clu定位或线粒体长度的变化，表明Mfn2是Clu诱导HSCs线粒体超融合所必需的。
为了进一步验证Clu-Mfn2相互作用在线粒体超融合中的作用，我们使用AlphaFold 3预测了Mfn2和Clu之间的相互作用。我们在Clu上鉴定了两个相互作用表面(surface 1和surface 2)，并生成了这两个表面突变的Clu突变体。共免疫沉淀分析显示，surface 1错义突变(Clu-mut1)减少了Clu与Mfn2的相互作用，而surface 2缺失突变(Clu-mut2)完全消除了Clu-Mfn2相互作用。重要的是，无法与Mfn2相互作用的surface 2 Clu突变体也失去了与线粒体共定位的能力，并且在线粒体长度上的增加能力相比于WT Clu，证实Clu-Mfn2相互作用对于Clu刺激线粒体超融合的作用至关重要。
总的来说，这些结果表明Clu通过与融合因子Mfn2相互作用在HSCs衰老过程中调节线粒体形态变化方面发挥了关键作用。
老年HSCs中Clu功能丧失下调p38 MAPK信号传导
线粒体融合通过增强OXPHOS和防止线粒体自噬来对抗代谢冲击。与此一致，我们发现Clu KO在oHSCs中不仅增加了线粒体自噬，还减少了OXPHOS和ROS。除了导致DNA损伤外，ROS还在不同细胞类型中调节细胞信号传导。为了进一步理解Clu表达如何调节HSC分化，我们进行了RNA-seq分析，比较移植后oHSCs与yHSCs，鉴定了1,043个上调基因。有趣的是，除了髓系分化和对氧化应激响应的富集外，GO分析还显示p38 MAPK通路的富集，表明该通路可能在衰老过程中被激活。进一步分析Clu KO在oHSCs中下调的基因显示p38 MAPK通路的富集，表明oHSCs中Clu上调可能是p38激活的原因。这些观察结合先前的发现，即p38 MAPK通路被ROS、DNA损伤和细胞因子释放激活，以及增加的ROS可以废除HSCs的重建能力，表明Clu可能通过激活p38来调节HSC分化。为了调查p38是否被oHSCs中增加的Clu激活，我们检测了活性形式的p38(磷酸化p38 (p-p38))水平，发现oHSCs中的p-p38水平高于yHSCs。重要的是，Clu KO下调了oHSCs中的p-p38水平。增加ROS通过抗霉素A处理进一步升高了p-p38水平，表明p-p38可以感知ROS的变化。重要的是，抗霉素A诱导的ROS增加补偿了Clu KO引起的p-p38下降，表明ROS位于Clu下游。相反，通过抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理抑制ROS阻断了Clu OE在yHSCs中诱导的p-p38增加。
Clu通过Cebpb调节髓系偏向造血
与oHSCs的髓系偏向分化一致，分析oHSCs中上调的基因揭示了髓系相关术语的富集。然而，Clu KO减少了oHSCs中与髓系细胞分化相关的基因。为了确定oHSCs中Clu上调如何促成髓系分化，我们聚焦于转录因子(TFs)，它们在调节HSCs谱系承诺中起关键作用。我们应用Metascape预测调控oHSCs中上调基因的候选TFs，揭示Cebpb为主要候选TF。与此一致，Cebpb缺陷小鼠表现出减少的髓细胞，表明Cebpb可能在衰老过程中髓系细胞分化中发挥重要作用。RNA-seq还揭示了oHSCs中Cebpb相较于yHSCs上调。重要的是，Clu KO降低了Cebpb mRNA水平。实时定量PCR(RT-qPCR)进一步确认了Clu KO后oHSCs中Cebpb mRNA的下调。综上所述，这些数据表明Clu可能通过上调Cebpb来调节髓系偏向。
因为p38激活促进转录因子的表达或激活，我们接下来询问Cebpb是否被Clu OE上调，如果是，是否由p38激活介导。我们发现Cebpb被Clu OE上调，而这种效果被p38抑制剂(SB203580)阻断，表明Clu介导的p38激活负责Cebpb上调。
接下来，我们询问通过减少Cebpb表达是否可以在体内缓解老年HSCs的髓系偏向。为此，我们感染了表达Cas9的oHSCs，使用靶向Cebpb的sgRNA慢病毒，然后将Cebpb KO oHSCs移植到受体小鼠中。外周血分析显示，oHSCs中的Cebpb KO足以减少髓系分化并增加B细胞分化。为了进一步证明Cebpb是Clu效应的下游因子，我们询问Clu KO在oHSCs中减少的髓系分化是否可以通过过表达Cebpb恢复。HSC移植后外周血分析显示，Clu KO引起的髓系减少或淋系增加被异位表达Cebpb完全逆转，凸显了Cebpb在Clu上调引发的髓系偏向分化中的作用。
综上所述，这些结果提供了强有力的证据，表明Clu在oHSCs中通过激活p38来调节分化，进而上调Cebpb导致髓系偏向分化。
Clu功能丧失使老年造血系统再生
揭示了Clu在髓系偏向分化中的机制后，我们接下来询问是否可以通过耗尽Clu来纠正髓系偏向，从而实现再生。为此，我们从老年小鼠中分离出表达Cas9的HSCs，然后感染携带靶向Clu的sgRNA的慢病毒，再移植到15个月大的受体小鼠中。4到7个月后，分析受体小鼠的外周血、免疫细胞和身体功能，评估Clu KO的效果。由于Cd38 KO对oHSCs分化有类似效果，我们也进行了Cd38 KO的平行实验。我们发现Clu或Cd38 KO导致髓系减少和B细胞输出增加，同时也增加了MPP4和IgM产生B细胞。重要的是，Clu和Cd38 KO都增加了淋巴细胞的绝对数量，而没有改变总白细胞计数。改善的造血和免疫系统还带来了更好的身体(握力测试、杆测试、旋转棒测试)和脑部(新物体识别测试)功能，表明oHSCs中Clu或Cd38的功能丧失具有再生效果，而Cd38 KO的效果比Clu KO弱。
(全文结束)
