肠道微生物群对类固醇激素的代谢正逐渐被视为影响人类健康的关键因素，但具体催化这些反应的酶仍然在很大程度上未被识别。本研究鉴定了由常见的人类肠道细菌编码的Δ4-3-酮类固醇5β-还原酶、3β-羟基类固醇脱氢酶/Δ5-4异构酶以及Δ6-3-酮类固醇还原酶家族。通过系统发生重建和诱变实验，我们证明5β-还原酶进化为专门将天然和合成的3-酮类固醇激素转化为其5β-还原衍生物，而Δ6-3-酮类固醇还原酶则适应于生成Δ6-还原产物。我们还发现，一种新型的3β-羟基类固醇脱氢酶/Δ5-4异构酶在多个物种中与5β-还原酶融合，简化了从孕烯醇酮到表孕烯醇酮的转化过程。通过宏基因组分析，我们揭示这些酶在健康人群中普遍存在，并且在女性中比男性更为丰富。这些发现为探讨微生物类固醇代谢如何调节宿主激素生理奠定了基础。
识别_Clostridium innocuum_中的5β-还原酶ci2350
孕酮还原途径包括一个5β-还原酶，它催化孕酮转化为5β-二氢孕酮，另外两个酶分别是3α-HSDH（3α-羟基类固醇脱氢酶）和3β-HSDH（3β-羟基类固醇脱氢酶），分别催化5β-二氢孕酮转化为孕烯醇酮或表孕烯醇酮。为了确定潜在的孕酮5β-还原酶基因，我们使用代谢组学方法检测了潜在孕酮还原菌株和非还原菌株培养物中的孕酮还原情况，并通过比较基因组学识别潜在的还原酶基因。我们确认_Clostridium innocuum_ 6_1_30和_Clostridium paraputrificum_ NCTC11833能够还原孕酮，验证了先前的研究结果。此外，常见的肠道微生物_Ruminococcus gnavus_ (Mediterraneibacter gnavus) C55_001C也能减少孕酮水平，表明这种细菌具有以前未知的功能，与人类健康和疾病有关。相比之下，我们在_Eubacterium ramulus_ ATCC29099、Clostridium symbiosum WAL-14163、Clostridium difficile ATCC9689或_Escherichia coli_ IM93B的培养物中没有观察到孕酮的还原现象。
我们推测，潜在的孕酮5β-还原酶基因应该存在于孕酮还原物种中，而在不还原孕酮的物种中不存在。先前对来自_C. innocuum_ 和_C. paraputrificum_ 的Δ4-3-酮类固醇5β-还原酶的表征表明，这些酶利用NADH/NADPH、FMN，并可能利用FAD作为辅因子，同时含有铁硫(Fe-S)簇。结合5β-还原酶被认为是一种ene-还原反应的事实，我们假设5β-还原酶属于Old Yellow Enzyme家族(COG1902)，该家族通常催化立体特异性还原反应，并参与许多生物学和医学上重要的反应。我们在_C. innocuum_ 基因组中识别出七个潜在的Old Yellow Enzymes，其中两个在_C. paraputrificum_ 和_R. gnavus_ 中有同源基因，但在非孕酮还原物种中不存在。为了确定这些酶是否有5β-还原酶活性，我们将每个_C. innocuum_ Old Yellow Enzyme同源基因转入大肠杆菌进行测试。两个基因_ci2350_ 和_ci0705_ 的存在模式符合预期，但只有_ci2350_ 显示出可检测的5β-还原酶活性，从而确认_ci2350_ 编码5β-还原酶。与在其他Old Yellow Enzymes中观察到的还原反应一致，ci2350对类固醇双键的还原与NADH氧化耦合，孕酮作为末端电子受体——这是肠道厌氧还原条件下的典型反应。
ci2350 还原天然和合成类固醇激素
我们调查了_C. innocuum_ 5β-还原酶对各种类固醇的作用。虽然孕酮可能是这种酶的天然底物，但几种具有类似结构特征和键合模式的代谢物也可能作为5β-还原酶的潜在底物。使用携带_C. innocuum_ 基因_ci2350_ 的大肠杆菌，我们测试了孕酮和其他十一种具有相同C4至C5碳-碳双键的代谢物的还原效果，包括三种天然存在的激素和八种合成孕激素。所有类固醇生物转化实验均使用标准化的底物浓度（1 mg/100 mL）和固定的孵育时间（48小时），以便在不同底物和菌株之间进行一致且可重复的酶活性比较。在天然类固醇中，我们观察到孕酮、皮质酮和氢化可的松的还原，而未观察到胆固醇-4-烯-3-酮的还原。胆固醇-4-烯-3-酮具有更长的烃链和不同的D环立体化学，可能阻止该酶对其进行还原。这证实了之前的研究，即_C. innocuum_ 的酶提取物能够还原孕酮和睾酮，但不能还原胆固醇-4-烯-3-酮。相关研究还表明，这些酶对类固醇激素具有广泛的活性，包括皮质酮、泼尼松龙和睾酮。
天然融合酶将孕烯醇酮转化为表孕烯醇酮
以_C. innocuum_ 5β-还原酶ci2350蛋白序列为查询，我们识别出一个包含318个基因的潜在5β-还原酶分支，主要来自Bacillota_A和Bacillota门。这个分支包括一些常见于健康人肠道的微生物分类群，如梭菌科和瘤胃球菌科成员。这表明此功能在人体肠道中可能较为常见。5β-还原酶同源基因通常与转录调节因子相邻，这些调节因子在AraC、AcrR和MerR家族中有所不同。这些同源基因经常位于其他酶编码基因附近，包括BaiH同源基因和含有Rossmann折叠（SSF51735）的基因。有趣的是，在257个同源基因中有61个基因直接在C端与5β-还原酶基因融合。这三个基因的Rossmann折叠结构域与PF01073、3β-羟基类固醇脱氢酶/Δ5-4异构酶（3β-HSDH/I）存在远缘同源性，后者参与真核生物中类固醇激素的生物合成。在人类中，孕烯醇酮（类固醇激素的前体代谢物）向孕酮的转化是由3β-羟基类固醇脱氢酶/Δ5-4异构酶催化的。因此，我们怀疑这些细菌3β-HSDH/I结构域涉及孕烯醇酮及其潜在代谢物5β-二氢孕酮的代谢。鉴于融合基因通常与路径整合有关，我们假设3β-HSDH/I结构域可能赋予这些酶将孕烯醇酮转化为孕酮、5β-二氢孕酮转化为表孕烯醇酮的能力，或者两者兼而有之，除了由5β-还原酶结构域催化的孕酮转化为5β-二氢孕酮之外。
Δ6-3-酮类固醇还原酶将类固醇转化为Δ6-还原形式
在_C. innocuum_ 基因组中，5β-还原酶基因(ci2350)与baiH同源基因ci2349相邻，后者是已知涉及细菌胆汁酸代谢的Δ6-3-酮类固醇还原酶。当我们对类似于ci2349的基因进行更广泛的搜索时，我们识别出94个候选基因。在这94个基因中，92个与5β-还原酶基因共存于基因组中，其中78个直接相邻。这94个Δ6-3-酮类固醇还原酶（Δ6-RD）基因可分为两个分支。第一个分支Δ6-RD(c1)包含51个基因，与baiH基因分支密切相关。这些基因不仅与先前识别的胆汁酸还原酶分支共同定位在类固醇还原酶家族内，而且大多与传统定义的bai操纵子相关。第二个分支Δ6-RD(c2)可能与类固醇激素还原酶相关，表明其具有可能平行于类固醇激素5β-还原酶的特殊功能。
类固醇还原酶在人类肠道微生物群中普遍存在
鉴于代谢宿主激素的酶在调节宿主激素平衡方面可能发挥的重要作用，我们试图调查它们在人类群体中的普遍性和相对丰度。考虑到男性和女性之间类固醇激素生产的已知差异以及这些激素的不同健康影响，我们旨在确定这些基因在人体肠道中是否普遍存在，以及它们的存在是否因性别而异。我们收集了来自13项研究的1549个宏基因组样本，并进行了全面分析，以评估这些酶在不同人群中的存在和相对丰度。
Δ4-3-酮类固醇5β-还原酶的检出率很高，在女性样本中为94.61%，在男性样本中为90.59%，这提供了类固醇代谢是人类肠道微生物群常见功能的证据。3β-HSDH/I和Δ6-RD(c2)的检出率较低，但仍很常见，分别在82.36%和57.42%的女性样本以及74.51%和52.50%的男性样本中发现。尽管Δ4-3-酮类固醇5β-还原酶和3β-HSDH/I的流行率和相对丰度在性别间存在显著差异，但这些差异相对较小。总体而言，这些酶在人类肠道宏基因组中的广泛检出突显了微生物类固醇代谢是人类肠道微生物群的核心功能。
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