微生物群衍生蛋白影响健康人和结直肠癌患者的T细胞反应
摘要
背景/目的：具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)和阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)是人体微生物群的关键组成部分，影响健康和疾病状态。具核梭杆菌通过其促炎和促肿瘤活性与结直肠癌(CRC)和不良预后相关，而阿克曼氏菌则与代谢益处和抗炎效应相关联。本研究旨在评估这些细菌的蛋白提取物对健康个体和结直肠癌患者外周T细胞反应的免疫调节影响。方法：将外周血单个核细胞(PBMCs)暴露于单独或联合的细菌提取物中，并通过多色流式细胞术分析T细胞亚群。结果：在健康供体中，具核梭杆菌增加了Th0、Th2和Tc9细胞频率，同时减少了Th1、Th1/Th17和Treg细胞。相反，阿克曼氏菌促进了一种与促炎相关的T细胞表型，其特征是Th0、Th2、Th17和Tc17细胞水平升高。联合暴露增强了Th0、Th17和Tc17细胞，同时降低了Th9细胞。在结直肠癌患者中，细菌提取物对T细胞亚群未引起显著变化。结论：这些发现表明，具核梭杆菌使免疫反应偏向体液和黏膜防御，而阿克曼氏菌在健康受试者中增强了通常与促炎免疫反应相关的T细胞极化。需要进一步研究以阐明它们在结直肠癌肿瘤微环境中的全身免疫学作用和相互作用。
关键词：具核梭杆菌；阿克曼氏菌；T细胞；结直肠癌；免疫调节；Tregs
1. 引言
微生物组通过辅助营养生物转化、保护免受病原体侵害、产生信号分子以及特别是调节免疫反应，在人类健康中发挥着至关重要的作用。在生理条件下，免疫系统与微生物群之间的相互作用确保了先天性和适应性免疫反应的正确协调，使机体能够做出最适当的反应[1]。然而，微生物群组成的失衡(即菌群失调)可能导致免疫失调或增加对包括癌症在内的各种疾病的易感性[2]。
在大肠中，微生物组在维持黏膜和全身免疫稳态方面发挥着重要作用[3]。它与局部免疫细胞密切相互作用，以调节免疫反应并发挥免疫调节功能[1,4]。微生物组塑造了先天免疫系统的髓系和淋巴系分支[5]，特别是通过其在B和T淋巴细胞库发育中的作用。初始CD4+辅助性T(Th)细胞在不同刺激下分化为不同的亚型——滤泡辅助T(Tfh)、Th1、Th2、Th17、Th9、Th22和调节性T细胞(Tregs)，在免疫调节中起关键作用[6]。维持T细胞亚群之间的适当平衡对免疫稳态至关重要，Th1、Th17或Tregs功能的紊乱与自身免疫疾病和癌症等疾病有关[7,8,9]。
在结直肠癌(CRC)中，肿瘤微环境通常以T细胞亚群(如Th1、Th17和Tregs)的失衡为特征，这可能影响疾病进展[7]。例如，Tregs可能抑制抗肿瘤免疫，而通常具有抗肿瘤作用的Th1细胞在肿瘤微环境中往往被下调[7,10,11]。此外，Th17细胞在癌症中可能发挥双重作用，既通过促进慢性炎症和肿瘤生长，又通过将免疫细胞募集到肿瘤部位[12,13,14,15,16]。
最近的研究进一步强调了癌症和代谢疾病中微生物群-免疫相互作用的复杂性，强调了特定细菌种类及其成分高度依赖于环境的免疫调节作用[17,18]。
各种胃肠道微生物种类，如幽门螺杆菌(Helicobacter spp.)、阿克曼氏菌、拟杆菌属(Bacteroides thetaiotaomicron)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，可以通过产生短链脂肪酸(SCFA)等方式影响T细胞的分化，有助于适应性免疫系统的效应和抑制臂之间的平衡[19,20]。在影响免疫反应的微生物种类中，具核梭杆菌(F. nucleatum)和阿克曼氏菌(A. muciniphila)尤为突出。具核梭杆菌是口腔微生物群的一种共生厌氧革兰氏阴性菌。具核梭杆菌扩散到远端部位可能导致口腔外感染、全身炎症和癌症[21,22,23]。基因组分析显示，具核梭杆菌在人类结直肠癌组织中富集，并与患者不良预后相关[24,25]。研究表明，它能抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫，导致更具免疫抑制性的肿瘤环境[25,26,27,28,29]。相反，阿克曼氏菌是另一种具有公认益生菌特性的肠道黏膜厌氧革兰氏阴性菌[30]。它已知能增强肠道屏障的完整性[31]，并对代谢健康显示出有益影响[32,33,34]。阿克曼氏菌通过影响T细胞活化和分化来调节免疫反应，在稳态条件下促进抗炎环境[6]。虽然它在结直肠癌中的作用尚不明确，但一些研究表明结直肠癌患者中阿克曼氏菌的丰度更高，而其他研究则报告在疾病晚期阶段水平较低[35,36,37,38]。
本研究的主要目的是调查具核梭杆菌和阿克曼氏菌的蛋白提取物对健康个体外周血T细胞的免疫调节作用。我们试图确定这些细菌提取物是否有能力改变T细胞亚群频率，从而揭示其潜在的益生菌或促炎特性。在随后的分析中，我们在结直肠癌患者的外周血T细胞上测试了相同的提取物，以评估它们的免疫调节作用在病理情况下是否相似或改变。
尽管实验方法基于对细菌蛋白提取物的长期体外暴露，但记录的T细胞亚群分布变化反映了这些提取物在塑造T细胞极化方面的免疫调节潜力。
2. 材料和方法
2.1 细菌菌株和生长条件
本研究中使用的细菌参考菌株为具核梭杆菌ATCC 25586和阿克曼氏菌BAA-835。从ATCC购买的菌株储存在-80°C的甘油储备中。两种细菌均在室温下解冻，接种在含5%无菌脱纤维马血(Lab M，Heywood，UK)的苛养厌氧琼脂(FAA)(Oxoid Limited，Hampshire，UK)上，并在厌氧环境下于37°C培养72小时(Whitley A25厌氧工作站，Don Whitley Scientific Limited，West Yorkshire，UK)。培养后，将具核梭杆菌的琼脂菌落收集并接种在苛养厌氧肉汤(FAB)(Lab M，Heywood，UK)中，在37°C下以125 rpm振荡培养17小时[39,40]，而阿克曼氏菌菌落收集后接种在脑心浸液肉汤(BHIB；Oxoid Limited，Hampshire，UK)中，含0.3 mg/mL L-半胱氨酸，在37°C下以125 rpm振荡培养48小时。每次培养后，将具核梭杆菌和阿克曼氏菌肉汤培养物在4°C下以3200×g离心20分钟，用无菌0.01 M磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，再次离心以获得分别对应3.7×10^10 CFU和6.41×10^9 CFU的可见沉淀。
2.2 细菌提取物
将细菌沉淀重悬于20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.3)中，转移至15 mL锥形管，置于冰浴中，通过超声处理破碎。超声仪(Sonoplus，Bandelin，Berlin，Germany)设置为50%振幅，脉冲序列为开启10秒，关闭120秒。细菌悬浮液超声处理总共10个循环，确保样品在整个过程中保持在冰上以维持低温。通过定期检查悬浮液的浑浊度来监测细胞裂解的进程。超声处理后，将裂解物在4°C下以11,200×g离心15分钟，以分离细胞碎片。小心收集含有可溶性细菌蛋白的上清液，转移到新管中。使用Bradford蛋白测定法根据制造商方案[41]量化细菌提取物的蛋白浓度。最终蛋白浓度为阿克曼氏菌1.35 mg/mL，具核梭杆菌0.8 mg/mL。在所有功能测定中，细菌提取物基于总蛋白浓度(µg/mL)进行标准化并使用，允许在独立于细菌生长或CFU计数差异的情况下直接比较具核梭杆菌和阿克曼氏菌。细菌蛋白提取物的等分试样储存在-80°C，并且仅在使用前解冻一次，以避免蛋白降解和批次变异性。
2.3 研究人群和样本收集
外周血单个核细胞(PBMCs)来自健康对照(HC)志愿者和性别及年龄匹配的结直肠癌患者，这些患者已纳入先前经当地伦理委员会批准的研究中。结直肠癌患者的血液样本在其住院当天(即计划进行癌症切除手术前一天)采集。值得注意的是，所有结直肠癌患者在血液采集前均未接受化疗，确保样本反映了未经化疗的状态。对每位受试者采集15 mL血液至K2 EDTA采集管中。使用LymphoprepTM(Serumwerk，Bernburg，Germany)密度梯度离心法分离PBMCs，并立即用于培养实验。
2.4 细菌提取物条件培养的T细胞培养
为评估细菌提取物驱动的T细胞极化调节，将每位受试者的PBMCs在具核梭杆菌和阿克曼氏菌蛋白提取物存在下培养。将每位受试者的5×10^5 PBMCs在24孔板中培养于2 mL含有2 mM L-谷氨酰胺、2×10^-5 M 2-巯基乙醇(2-ME)和7.5%人血清(完全培养基)的RPMI 1640培养基中。在第0天，用不同浓度(10、15、20和50 µg/mL)的细菌提取物一次性刺激PBMCs。在最初5天内不更换培养基，允许持续暴露于细菌蛋白提取物。作为细胞反应性的阳性对照，还用0.1%浓度的植物血凝素(PHA)刺激细胞。在培养的第五天，添加重组IL-2(rIL-2)至30 U/mL，以支持T细胞扩增，并将培养物维持额外7天。在培养期结束时(第12天)，收获细胞并通过多色流式细胞术分析T细胞亚群频率。该实验方案旨在评估细菌蛋白提取物对T细胞极化的长期免疫调节作用，而非短期激活反应。
2.5 T淋巴细胞表面和细胞内标志物的细胞计量分析
在基线(T0)和与细菌提取物或PHA培养12天后，用荧光染料偶联抗体对培养的细胞进行染色。具体来说，使用了以下来自Miltenyi Biotech的人源抗体：CD45-PercP Vio700、CD3-VioBlue、CD8-APC Vio770、CD4-VioGreen、CCR10-PE、CD183-VioBright FITC、CD194-PE Vio770和CD196-APC。为了定义各种T亚群，基于CD45、CD3、CD4和CD8染色的表型与CD183(CXCR3)用于Th1和Tc1、CD194(CCR4)用于Th2和Tc2、CD196(CCR6)用于Th17和Tc17或Th9和Tc9、CCR10用于Th22[42]相结合。门控策略如图1所示。此外，使用Tregs检测试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)对培养的细胞进行Tregs淋巴细胞检测，包括外部染色使用抗人CD45-VioBlue、CD4-VioGreen、CD25-VioBright、CD127-PE抗体，细胞固定和通透化，然后进行抗人FoxP3-Vio667细胞内染色(图1B)。使用MacsQuant Analyzer流式细胞仪(Miltenyi Biotec)进行分析，获取100,000个事件。使用FlowLogic V7软件(Miltenyi Biotec，Germany)处理数据。
2.6 统计分析
通过将培养后T细胞亚群频率与基线(T0)值进行比较来执行统计分析，以评估相对于每个受试者初始免疫谱的细菌提取物驱动的T细胞极化调节。使用GraphPad Prism 8.0执行数据分析。连续变量以中位值和四分位距(IQR)表示，并使用Kruskal-Wallis检验(Dunnett事后检验)进行比较。p值小于0.05被认为具有统计学意义。
3. 结果
3.1 研究人群
健康志愿者(n=15；7名男性，8名女性)的中位年龄为67岁(49-79)，结直肠癌患者(n=6；3名女性，3名男性)为75岁(66-80)，两组性别分布均为50%女性。结直肠癌患者的临床/人口统计学特征见表1。
3.2 细菌提取物对健康对照T淋巴细胞的影响
为评估相对于基线免疫条件的细菌提取物驱动的T细胞极化调节，比较了T0和第12天培养的T细胞亚群频率。我们首先测试了增加浓度的细菌提取物(10、15、20和50 µg/mL)。根据初步结果，我们选择15 µg/mL作为进一步实验的最佳浓度，因为它能观察到显著效果的适当量，而更低/更高的浓度未产生显著变化。
与基线相比，具核梭杆菌的存在导致各种T细胞亚群的显著变化，包括Th0细胞频率增加(p=0.005)、Th2细胞频率增加(p=0.002)和Tc9细胞频率增加(p=0.034)，以及Th1细胞频率降低(p=0.002)、Th1/Th17细胞频率降低(p=0.015)、Tc1/Tc17细胞频率降低(p=0.048)和Tregs细胞频率降低(p=0.005)(图2)。所有T细胞亚群的中位值和四分位距见表2。
相反，与基线相比，阿克曼氏菌的存在导致Th0细胞(p=0.005)、Th17细胞(p=0.005)、Th2细胞(p=0.017)和Tc17细胞(p=0.038)显著富集(图2)。
总体而言，这些发现表明，在健康个体中，具核梭杆菌和阿克曼氏菌的蛋白提取物明显诱导了不同的、物种特异性的T细胞亚群调节模式，在关键辅助性和细胞毒性相关群体上具有部分相反的作用。
最后，用具核梭杆菌和阿克曼氏菌提取物的组合处理导致T细胞频率发生显著变化，包括Th0细胞(p=0.021)、Th17细胞(p=0.018)和Tc17细胞(p=0.043)增加，以及Th9细胞频率降低(p=0.047)(图2)。
3.3 细菌提取物对结直肠癌患者T细胞亚群分布的影响
单独或联合使用具核梭杆菌和阿克曼氏菌提取物处理，与基线相比，未导致从结直肠癌患者获得的T淋巴细胞频率发生显著变化。所有T细胞群体的中位值和四分位距见表2。
4. 讨论
如前所述，我们研究的主要目的是评估相对于健康受试者基线免疫谱的具核梭杆菌和阿克曼氏菌衍生细菌提取物驱动的系统性T细胞极化调节。我们使用PBMCs评估这些细菌提取物如何在非疾病环境中调节循环T细胞亚群。随后，将相同的提取物测试于结直肠癌患者的PBMCs上，以记录在癌症等病理情况下观察到的健康条件下的免疫调节作用是否保留。将PBMCs与细菌蛋白提取物一起培养，以允许持续抗原暴露和随后的IL-2支持扩增，免疫学结果被解释为相对于基线(T0)的T细胞亚群分布变化，这代表了每位捐赠者的生理免疫状态[43]。多色流式细胞术的使用使我们能够评估特定T细胞亚群的分布。在本研究中，T细胞亚群基于表面标志物表达进行表型定义。虽然这些标志物广泛用于将T细胞谱系与特定效应程序相关联，但未直接评估功能性细胞因子产生，因此无法直接推断功能性活性。CD4+ Th和CD8+ Tc细胞在适当刺激下分化为具有特定转录因子和细胞因子谱的不同亚型，例如辅助性或细胞毒性Th1/Tc1、Th2/Tc2、Th17/Tc17、Th9/Tc9、Th22/Tc22和调节性T细胞(Tregs)[6]。然而，这种分化不是静态的：T细胞可以根据生理/病理条件重塑为其他亚型。例如，在高IL-12水平下，Th17细胞可以转变为Th17/Th1谱型，而IL-1和IL-6可以促使Tregs转化为Th17细胞[44,45,46]。
Th1和Th17细胞在免疫反应中充当效应细胞，而Tregs调节和抑制免疫活性。有利于慢性Th17介导的炎症和降低Tregs功能的失衡与自身免疫疾病相关[47]。此外，Th1细胞对细胞内病原体的细胞介导免疫至关重要，而Th2细胞支持对细胞外寄生虫的体液免疫。维持适当的Th1/Th2反应平衡对免疫稳态至关重要，而破坏可能导致过敏、哮喘和自身免疫障碍等状况[48,49]。值得注意的是，我们使用具核梭杆菌和阿克曼氏菌的蛋白组分提取物特别评估了它们的免疫调节作用。
细菌细胞的蛋白组分是强效抗原，可以直接激活T细胞，使其成为评估靶向免疫反应的理想选择。通过关注蛋白组分，我们旨在减少与完整细菌或非蛋白组分(如脂多糖或细胞外聚合物质)相关的复杂性，并更好地表征细菌提取物驱动的T细胞反应调节。虽然细菌代谢物和其他生物活性分子已知会影响免疫反应[50,51]，可能将免疫力偏向炎症或调节谱型[52,53]，但使用蛋白组分是为了控制这些变量，并特别关注抗原驱动的T细胞活化。
在健康个体中，暴露于具核梭杆菌蛋白提取物与T细胞亚群分布的变化相关，其特征是Th0、Th2、Tc1和Tc9细胞频率升高，以及Th1、Th1/Th17和Tregs细胞频率降低。这表明具核梭杆菌通过Th2和Tc9亚群的升高促进体液免疫和黏膜防御，同时通过增加Tc1细胞增强细胞毒性反应[6]。然而，Th1和Tregs的减少可能会降低调节性和促炎控制，可能创造一种平衡，如果不加调节，可能会促进免疫抑制条件。这种改变的免疫谱型可能会通过促进慢性炎症同时削弱抗肿瘤反应来促进癌症进展[54,55]。Th2和Tc9相关表型的富集在CRC相关的免疫失调中更为重要，因为Th2偏斜反应与受损的抗肿瘤免疫和免疫耐受相关，而Tc9细胞与细胞毒性效率有限和功能可塑性特征的免疫环境相关[56,57]。
本研究的一个关键发现是在健康受试者中，具核梭杆菌和阿克曼氏菌驱动的T细胞极化具有对比性和物种特异性，突显了个体微生物群成员的异质性免疫调节潜力。
暴露于阿克曼氏菌与T细胞极化相关，该极化与通常与促炎性免疫反应相关的亚群相关，其特征是Th0、Th2、Th17和Tc17细胞频率增加。Th17和Tc17细胞以其产生IL-17而闻名，IL-17参与介导炎症和募集中性粒细胞[58]。虽然在病原体防御中是有益的，但该亚群在慢性炎症中的参与可能会促进某些疾病，如CRC，其中慢性炎症反应可促进肿瘤发生[59]。暴露于阿克曼氏菌蛋白提取物后体外观察到的与促炎相关的T细胞表型与体内报道的阿克曼氏菌的抗炎作用之间的明显差异，可能反映了实验条件的差异。在体内，阿克曼氏菌的免疫调节特性受微生物定位、宿主-微生物群相互作用以及在体外PBMC系统中缺失的代谢物产生的影响。此外，组织特异性免疫环境和上皮-免疫串扰可能关键地塑造明确的免疫学结果。因此，体外观察到的细菌提取物驱动的调节应被解释为上下文依赖的免疫极化，而不是直接与阿克曼氏菌在体内报道的抗炎作用相矛盾。
具核梭杆菌和阿克曼氏菌提取物的组合导致Th0、Th17和Tc17细胞增加，以及Th9细胞减少，表明向通常与促炎性免疫极化和黏膜免疫反应相关的T细胞亚群分布转变。然而，与促炎反应相关的T细胞亚群的富集如果不适当调节，可能会促进慢性炎症条件。一个有趣的发现是，阿克曼氏菌本身不会增加Tc1细胞，但当与具核梭杆菌结合时，它减轻了具核梭杆菌诱导的Tc1细胞增加。这一发现表明阿克曼氏菌可能具有抵消具核梭杆菌驱动的促炎性Tc1反应的潜在调节作用。联合暴露实验的生物学相关性应在动态肠道微生物群生态系统中评估，在该生态系统中，宿主免疫细胞同时暴露于多种微生物组分而非单一细菌种类。虽然体外同时暴露不能充分反映体内微生物相互作用的空间和时间异质性，但这种方法提供了一个简化和受控的模型，以探索不同微生物组分如何交互地塑造T细胞极化。因此，联合提取物实验提供了关于可能从肠道环境中多微生物暴露中产生的潜在加性或调节效应的见解。
这种调节背后的机制可能涉及细胞因子环境或抗原信号传导中的复杂相互作用。当然，需要进一步研究来了解为什么阿克曼氏菌在这种情况下特别影响Tc1细胞，而其他亚群(如Th1)保持不变。值得注意的是，细菌提取物的组合似乎影响特定亚群，指出这些微生物群成员在调节宿主免疫方面的复杂相互作用。
在结直肠癌患者的血液中，用细菌提取物刺激与基线相比，循环T细胞亚群频率未获得显著变化；然而，鉴于样本量有限和队列异质性，该研究可能不足以检测细微的免疫调节效应。外周T细胞亚群中缺乏可检测的调节与结直肠癌中系统性免疫功能障碍的概念一致，这可能会限制循环T细胞对额外免疫调节刺激的反应性。在结直肠癌患者中，循环T细胞亚群中缺乏统计学显著调节可能反映了多种非互斥的机制。除了抗原反应性T细胞可能在肿瘤微环境或黏膜组织中被隔离外，外周T细胞可能表现出功能损害、耗竭或无能状态，这在结直肠癌中经常被记录[60]。以Tregs和髓源性抑制细胞为特征的免疫抑制性CRC微环境可能进一步掩盖外周血中免疫变化的检测[61]。未来的研究应重点关注肿瘤活检，以直接评估局部免疫动态。
本研究有一些局限性。T细胞亚群的分析受到限制，我们未进行功能测定，限制了我们对更广泛免疫影响的理解。此外，应考虑与CRC队列相关的潜在混杂因素。尽管所有患者均未接受化疗，但疾病阶段异质性和癌症相关的系统性免疫改变(包括免疫耗竭或无能)可能影响了外周T细胞反应。此外，结直肠癌患者数量有限和相关变异性代表了本研究的另一个局限性，可能降低了检测显著差异的统计能力。未来的研究应涉及慢性治疗模型、更广泛的免疫分析和功能测定，以提供更深入的理解。研究这些细菌提取物对肿瘤浸润淋巴细胞的免疫调节作用也将是相关的，因为局部免疫反应可能与在外周血中观察到的显著不同。
最后，研究来自同一批患者的肿瘤活检和粪便样本中的微生物群将有助于建立潜在的临床相关性，加深我们对系统性和局部微生物群与免疫反应之间相互作用的理解。
5. 结论
总之，我们的发现强调了与促炎或调节性免疫谱型相关的具核梭杆菌和阿克曼氏菌驱动的T细胞亚群调节。
我们记录了源自不同肠道微生物群成员的蛋白提取物在健康受试者中不同地影响循环免疫细胞，而在相同实验条件下，结直肠癌患者中未检测到统计学上显著的调节。了解微生物群-免疫相互作用对于开发旨在调节免疫反应的益生菌或基于微生物的策略至关重要，对感染、自身免疫疾病和癌症具有潜在影响。我们的发现强调了在研究系统性免疫调节时考虑微生物特异性和宿主免疫背景的相关性。
总之，本研究强调了四个关键信息：
(i)源自不同肠道微生物群成员的细菌蛋白提取物在健康受试者中不同地调节循环T细胞亚群分布；
(ii)具核梭杆菌和阿克曼氏菌对系统性T细胞极化发挥不同且物种特异性的免疫调节作用；
(iii)在结直肠癌患者中，在当前实验条件下不易检测到系统性T细胞调节，可能反映了疾病相关的免疫失调和/或有限的统计能力；
(iv)这些发现强调了在研究微生物群-免疫相互作用时考虑微生物特异性和宿主免疫背景的相关性。
需要进一步的研究，包括功能测定和更大、更有统计能力的患者队列，以更好地定义微生物群衍生组分在塑造系统性和CRC相关免疫反应中的作用。
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