内源性肽GPR15L塑造肠道微生物群以对抗结肠炎
摘要
背景 GPR15L肽由结肠上皮细胞产生，已被发现参与T细胞向大肠募集。然而，其在慢性结肠炎中的作用此前尚不明确。
目的 探讨GPR15L在实验性结肠炎和炎症性肠病(IBD)发病机制中的作用。
设计 我们研究了基因删除或过表达Gpr15l以及直肠应用重组GPR15L如何改变急性葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎和T细胞转移结肠炎的进程。通过共饲养、同窝和粪便微生物群转移研究、16S rRNA测序以及抗微生物和鸟枪法宏基因组学，探究GPR15L对微生物群的影响。通过三个独立的IBD患者队列评估GPR15L的表达，与微生物多样性和缓解期生存率相关。
结果 GPR15L显著减轻实验性结肠炎，但这种作用与T细胞募集和GPR15无关。我们观察到GPR15L的作用由大肠中改变的微生物组介导，一致地，GPR15L在厌氧条件下表现为抗菌肽，将微生物群落塑造成具有稳态表型。直肠补充GPR15L可对抗实验性结肠炎。在IBD患者中，活动性炎症时GPR15L表达降低，与微生物多样性和无发作生存期相关。
结论 GPR15L是一种宿主防御肽，在肠道炎症发病机制中发挥有益作用。进一步评估其作为IBD未来治疗策略的潜力是值得期待的。
关键词：炎症性肠病、微生物组、抗菌肽、实验性结肠炎
已知信息
- GPR15L肽由大肠上皮产生。
- GPR15L通过GPR15受体招募T细胞至大肠。
本研究的新发现
- GPR15L通过与T细胞募集无关的机制对抗实验性结肠炎。
- GPR15L作为抗菌肽发挥作用，将大肠微生物群落塑造成稳态表型。
- 活动性IBD中GPR15L表达降低，GPR15L表达与微生物多样性和无发作生存期相关。
本研究对研究、实践或政策的潜在影响
- GPR15L的局部应用可能成为干扰IBD中失调的宿主-微生物互作的潜在治疗策略。
引言
尽管炎症性肠病(IBD)的多因素发病机制主要涉及环境因素与遗传易感性的相互作用[1]，但临床建立的治疗策略仍局限于缓解下游免疫应答的方法[2]。近年来，针对α4β7整合素、IL12/23p40、IL23p19、Janus激酶和鞘氨醇-1-磷酸受体等靶点的治疗选择大幅增加，适用于溃疡性结肠炎(UC)和/或克罗恩病(CD)[3]。然而，临床试验中持久缓解率上限（最高达30%）尚未被突破[4]。
与IBD风险增加相关的环境因素包括儿童期抗生素使用、分娩方式、母乳喂养、饮食、空气污染和卫生条件等[5]。其中许多因素直接或间接影响肠道微生物群的组成，这是一群估计包含10^13–10^14细菌、病毒和真菌的庞大群落，它们在胃肠道中履行重要的消化功能并促进上皮稳态[6,7]。因此，宿主的免疫系统经过进化，能够耐受共生微生物环境，同时抑制和对抗病原体[8,9]。然而，微生物失调（以整体多样性下降和特定细菌富集为特征）是IBD的标志[10-12]，已有假说认为细菌抗原通过渗漏的屏障进行转位会触发肠道炎症[1]。对抗这种失调的内源性机制之一是上皮细胞分泌的抗菌肽，它们保护粘膜免受病原体侵入[13]。虽然它们在粘膜稳态中的作用已得到充分证实[14]，但其在慢性肠道炎症中的功能意义和转化潜力仍基本不明确。
同时，淋巴细胞向组织募集是IBD中启动和维持肠道炎症的重要且可转化的过程[15]。2013年，孤儿受体GPR15被确定为特异性引导T细胞至大肠的分子，从而调节实验性结肠炎的活性[16,17]。2017年，GPR15被脱孤儿化，GPR15L被确定为迄今为止唯一已知的配体[18,19]，以高特异性与受体结合，促进淋巴细胞归巢至表面整合素上游[20]。在稳态条件下，GPR15L主要由结肠上皮细胞产生[19]。在此，我们着手探索最初的假设，即GPR15L通过引导T细胞募集参与实验性和人类结肠炎的发病机制。
我们发现，GPR15L在小鼠中对抗肠道炎症，并在IBD中明显下调，而高表达与有利的预后相关。然而，出乎意料的是，这些效应不依赖于淋巴细胞募集和GPR15。相反，GPR15L表现为一种抗菌肽，促进小鼠和人类肠道微生物群的稳态表型。在小鼠中进行治疗性应用显著降低疾病活动度，提名GPR15L为IBD未来有希望的治疗策略。
方法
方法详见在线补充文件1。
结果
GPR15L对抗实验性结肠炎
为了解GPR15L对实验性结肠炎的影响，我们首先在特定无病原体条件下同笼饲养的Gpr15l缺陷型和野生型小鼠中诱导急性DSS结肠炎。虽然我们未预期基于GPR15L控制淋巴细胞募集的假设会有主要发现（且T细胞在急性DSS结肠炎中作用不关键），但我们惊讶地观察到Gpr15l缺陷小鼠疾病活动度显著增加，通过微型内窥镜、组织学、活性氧物质的活体成像、体重减轻和临床疾病活动度得到证实（图1A）。在这些实验中，我们不得不将DSS剂量降至1%，因为我们在初始实验中在常规实验室标准1.5%时观察到Gpr15l−/−小鼠的高死亡率。一致地，我们在固有层单核细胞(LPMCs)中测量到关键促炎细胞因子如Il1b、Il13和Tnf的mRNA表达显著升高（图1B），这在LPMCs再刺激后向培养上清液分泌白细胞介素(IL)1β、IL13和肿瘤坏死因子(TNF)中得到体现（图1C）。这进一步得到了结肠中髓过氧化物酶(MPO)+和CD4+细胞丰度增加（图1D）以及上皮细胞凋亡增加的支持（图1E）。
虽然表型与调节性T细胞(Tregs)归巢减少的假设一致（GPR15在小鼠Tregs中主要表达）[16]，但我们的疑虑因Foxp3+细胞在Gpr15l缺陷小鼠中也增加以及Foxp3+/CD4+细胞比例未受影响而加深。
我们接下来通过在T1.5% DSS）诱导急性DSS结肠炎来确认这些观察结果。确实，GPR15L过表达显著降低了内窥镜、组织学和临床疾病活动度以及活性氧物质产生和体重减轻（图1D）。
综合来看，这些数据强烈表明GPR15L在实验性结肠炎中发挥保护作用。
GPR15L对实验性结肠炎的影响不通过淋巴细胞或GPR15介导
我们随后旨在进一步挑战GPR15L在疾病活动度中通过T细胞募集发挥作用的假设。为此，我们将Gpr15l敲除小鼠与缺乏天然淋巴细胞的Rag1缺陷小鼠交配，并用Gpr15l-缺陷型和Gpr15l-野生型Rag1−/−动物诱导急性DSS结肠炎。我们发现，之前描述的表型在缺乏T细胞的情况下也完全重现（图2A）。
此外，我们使用T细胞转移结肠炎模型，将Gpr15-缺陷型或Gpr15-野生型CD45RBhigh T细胞转移至Rag1−/− Gpr15l−/+或Rag1−/− Gpr15l−/−同窝小鼠。通过体重曲线、结肠长度、结肠长度/体重比和组织学确定的疾病活动度在接收Gpr15+/+ T细胞的Gpr15l-野生型小鼠和接收Gpr15−/− T细胞的Gpr15l-野生型小鼠之间无差异。然而，将Gpr15−/− T细胞转移至Rag1−/− Gpr15l−/−小鼠与转移至Rag1−/− Gpr15l+/+小鼠相比，疾病活动度明显增加（图2B）。这些数据表明GPR15L对实验性结肠炎的影响独立于GPR15，因此不太可能由T细胞募集解释。
宿主-微生物群互作介导GPR15L对结肠炎的影响
为筛选潜在机制，我们对来自Gpr15l−/−和野生型小鼠的LPMCs和全结肠组织进行了批量RNA测序[21]。我们发现LPMCs中仅有极少数基因差异表达（图3A），为GPR15L依赖性淋巴细胞归巢对实验性结肠炎非关键的结论提供了额外验证。相反，大量基因在全结肠组织中差异表达（图3B），这些基因与肠道屏障处宿主-环境互作相关，如Cldn4、Tlr5或P2rx1（图3C）。
然而，在用GPR15L处理或不处理的小鼠大肠类器官2D培养中，我们未观察到GPR15L对屏障功能和上皮增殖相关基因表达的影响（图3E），表明批量RNA测序中上皮细胞特征由另一种原发机制塑造。考虑到先前报告表明GPR15L在体外具有抗菌特性[22]，我们假设肠道微生物可能参与我们的观察。因此，我们使用来自在Gpr15l-转基因和同窝小鼠中进行的控制良好的急性DSS结肠炎实验的结肠切片，对粘膜中的细菌进行染色。我们观察到Gpr15l-转基因小鼠粘膜层中细菌数量显著减少，且这些细菌未像同窝对照组那样深入渗透（图3D）。类似地，Gpr15l−/−小鼠的肠道细菌粘膜渗透高于野生型对照（图3E）。
由于这支持宿主-微生物群互作驱动结肠炎活动度差异的观念，我们接下来旨在了解GPR15L对敲除小鼠中微生物群落的影响。首先，我们将Gpr15l−/−和野生型小鼠在断奶后直接共饲养5周，然后分离6周以防止通过食粪症进一步微生物或GPR15L交换[23-25]。在共饲养前后及分离期后获取粪便，并进行16S rRNA基因测序。断奶后，敲除和野生型小鼠具有明显不同的β多样性。正如预期，共饲养期后这种差异消失。然而，β多样性在重新分离期后再次出现，与GPR15L驱动的微生物群落轨迹一致。非常有趣的是，DSS结肠炎表型与β多样性中的这些观察相关。当DSS在持续共饲养期间给予共饲养动物时，结肠炎活动度无差异。当共饲养动物在共饲养后重新分离并在分离后立即给予DSS时，Gpr15l−/−小鼠疾病活动度增加的趋势。然而，当共饲养小鼠重新分离6周后应用DSS时，Gpr15l−/−小鼠中结肠炎活动度的增加完全恢复。
虽然强烈提示GPR15L塑造微生物群落，但需要在同窝设置中进一步确认。因此，我们杂交了Gpr15l+/−小鼠，并在进一步实验中比较了Gpr15l−/−和Gpr15l+/+小鼠。断奶后，这些小鼠要么共饲养，要么单独饲养，然后接受DSS。确实，共饲养小鼠疾病活动度非常相似，而单独饲养的Gpr15l−/−小鼠遭受明显更严重的疾病。
综上，这些数据表明宿主的遗传改变本身不足以驱动实验性结肠炎中的差异表型，宿主-微生物群互作对于解释GPR15L对实验性结肠炎的有益作用是必需的。
GPR15L作为抗菌肽塑造微生物群落
为深入了解GPR15L对微生物群落的影响，我们对断奶后单独饲养的Gpr15l-转基因小鼠的粪便样本、以及共饲养或单独饲养的Gpr15l−/−和Gpr15l+/+同窝小鼠进行了16S rRNA基因测序[21]。虽然这些小鼠中β多样性的主成分分析在断奶后(T1)显示一些重叠（图4A；图4A），但在分离后(T2)出现明显分歧（图4A；图4B），而在共饲养小鼠中甚至发生趋同（图4C）。
α多样性措施总体无显著差异，但趋势显示敲除小鼠丰富度更高（图4B）。然而，分类学分析进一步表明GPR15L与明显不同的群落相关。共生菌如Prevotellaceae和Alistipes（先前与抗炎潜能相关[26-29]）的丰度在Gpr15l−/−小鼠中降低，而与CD相关的Lachnoclostridium[30]在Gpr15l−/−小鼠中富集（图4C；图4D）。
有趣的是，通过PICRUSt2进行的体外功能预测（图4D）显示Gpr15l野生型小鼠与增加的多种代谢途径相关，这些途径在慢性结肠炎背景下被认为是有益的，如增加的混合酸发酵，可导致更多保护性短链脂肪酸[31]。同样，例如，这适用于5-羟色胺和多巴胺降解以及黄素生物合成，这些对群落内代谢互换和细菌共养是必需的，保护免受肠道炎症并与IBD临床缓解相关[32,33]。
为更深入追踪GPR15L诱导的轨迹，我们对断奶后和8周分离后的Gpr15l−/−和Gpr15l+/+同窝小鼠粪便进行了鸟枪法宏基因组测序[21]。确实，群落演变的明显差异变得明显（图4E）。更具体地说，与16S数据一致，我们观察到Gpr15l-野生型小鼠中与IBD保护相关的细菌属如Lachnospiraceae和Alistipes增加（图4F）。相反，这些细菌以及与IBD保护相关的Roseburia和Rikenella[34-36]在Gpr15l-缺陷小鼠中减少。同时，Bacteroides（在IBD背景下被视为机会性病原体[37-40]）在Gpr15l+/+中减少，但在Gpr15l−/−小鼠中增加。
总体而言，这些数据始终将GPR15L与体内微生物群落的更稳态组成相关联。
为探究这是否是一种直接机制，我们在厌氧条件下（大肠中普遍存在的条件）进行了径向扩散测定，将一组致病性和共生菌与GPR15L共同孵育。虽然我们观察到GPR15L对致病菌种如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和粪肠球菌的生长有明显抑制作用，但之前与抗炎潜能相关的细菌如Parabacteroides faecis、distasonis和goldsteinii[34,41]未受影响（图4G；图4H）。
在下一步中，我们旨在进一步表征GPR15L的抗菌特性。为此，我们在厌氧条件下用各种浓度的GPR15L（以多粘菌素B为参考）培养鼠伤寒沙门氏菌。我们观察到GPR15L对鼠伤寒沙门氏菌的剂量依赖性抗菌活性，最小抑菌浓度(MIC)为14.7 μM，50%生长抑制的抑菌浓度(IC50)为11.3 μM（图5A,B）。
由于GPR15L是一种高度阳离子肽，我们旨在探究它是否通过与细菌细胞壁相互作用发挥抗菌活性[22]。因此，用32 μM GPR15L和不同浓度的NaCl处理细菌以破坏离子相互作用[42,43]。确实，NaCl剂量依赖性地抵消了GPR15L的抗菌活性，MIC为26 mM（图5C）。相反，用100 mM NaCl处理的细菌在测试的全浓度范围内对GPR15L无反应（图5D）。
与GPR15L在肠腔中抗菌活性的概念一致，我们在健康人类供体的粪便样本中检测到相当数量的肽（图5E）。
最后，为提供GPR15L对塑造肠道微生物群落以调节对实验性结肠炎易感性的相关性的进一步证据，我们用广谱抗生素鸡尾酒处理野生型小鼠以减少天然菌群，然后在诱导DSS结肠炎前从Gpr15l-缺陷型或Gpr15l-野生型小鼠进行粪便微生物转移(FMT)。有趣的是，供体小鼠的表型在FMT受体中重现，FMT受体中疾病活动度增加（图5F），以及促炎免疫细胞浸润和上皮细胞死亡增加。
总之，这些数据强烈表明GPR15L作为选择性抗菌肽，促进稳态并对抗肠道中的结肠炎。
GPR15L治疗减轻实验性结肠炎并有益地塑造肠道微生物群
基于这些观察，我们想知道是否能在实验性结肠炎中治疗性利用GPR15L的抗菌特性。为此，我们在Gpr15l−/−小鼠中诱导急性DSS结肠炎，并在第3天至第9天直肠补充重组GPR15L，浓度接近上述确定的MIC。与安慰剂相比，这种治疗明显降低了临床、内窥镜和组织学疾病活动度（图6A）。同样，结肠中MPO+、CD11b+和CD4+细胞的丰度和上皮细胞死亡减少。
此外，GPR15L治疗诱导了这些小鼠肠道微生物组的明显变化，因为从实验开始前和结束时获取的粪便样本进行的16S rRNA测序表明，最初相似的α和β多样性在治疗后变得不同（图6B,C）。
为建模这种治疗对患者的影响，我们获得了人类粪便样本的悬浮液，在厌氧条件下用GPR15L或安慰剂对照处理，然后进行鸟枪法宏基因组测序（图6D）[21]。正如预期，这导致了明显不同的α和β多样性（图6E）。
在属水平上，这对应于明显的微生物谱型，最引人注目的是大肠杆菌在对照处理下富集，而双歧杆菌在GPR15L处理下富集（图6F）。在种水平上，与径向扩散测定数据一致，致病细菌如大肠杆菌在GPR15L处理下明显减少。同样，与小鼠数据一致，与IBD相关的Lachnoclostridia和细菌如Ruminococcus torques或Blautia wexlerae[44,45]明显下调（图6G）。
相反，与保护免受IBD相关的共生菌如双歧杆菌长双歧杆菌或几种普雷沃氏菌[46,47]在GPR15L处理后增加。代谢功能推断与HUMAnN4显示脂肪酸β氧化和果聚糖生物合成途径上调（图6H），这些之前与粘膜稳态和共养能力相关[48,49]。
总之，这些数据表明直肠补充GPR15L减轻实验性结肠炎，并与来自人类大肠的微生物群落向潜在保护性组成转变相关。
GPR15L在活动性IBD中下调，与微生物丰富度和无发作生存期相关
为进一步评估GPR15L对IBD的转化相关性，我们研究了溃疡性结肠炎(UC)、CD和非IBD对照患者的表达。最初，我们对大学医院Erlangen生物库中的活检进行了mRNA定量PCR。正如预期，结肠中的表达高于回肠（图7A）。此外，关注结肠活检，我们观察到UC患者中GPR15L表达明显降低，而CD患者中未见（图7B；图7C）。
为在蛋白质水平证实这些发现，我们对IBD患者和非IBD对照的结肠切片染色GPR15L和上皮细胞粘附分子(EpCAM)。为校正与严重炎症相关的上皮损伤，我们将GPR15L归一化至EpCAM强度。然而，我们观察到UC和CD患者中GPR15L表达显著降低（图7D；图7E）。
我们进一步研究了UC患者的结肠活检中GPR15L的mRNA表达，这些患者来自瑞士的一个亚组[12]。在内镜下有活动性疾病的全结肠炎患者中，GPR15L明显降低（图7F；图7G）。此外，与GPR15L治疗数据一致（图6C,E），GPR15L表达与来自同一供体组织样本中观察到的微生物α多样性负相关（图7H）。
此外，我们研究了IBDome数据库中UC患者的GPR15L表达，该数据库汇集了德国多中心队列的转录组学和临床数据[50]。再次，GPR15L表达与临床和内镜疾病活动度负相关（图7I；图7J），补充了跨三个独立队列的证据。
最后，我们前瞻性地监测UC患者在内镜缓解期的进一步病程，并确定结肠活检中GPR15L mRNA表达。在未针对潜在混杂因素调整的分析中，我们观察到高GPR15L表达（高于队列中位数）与低GPR15L表达相比，与明显更好的无发作生存期相关（图7K；图7L）。
总之，这些数据表明GPR15L在活动性UC中下调，并支持其调节肠道微生物组以对抗IBD的观点。
讨论
尽管GPR15先前已被牵涉控制淋巴细胞向大肠归巢[16,20,51]，但其内源性配体GPR15L在慢性肠道炎症背景下的确切作用迄今尚不明确。在此，我们首次报道GPR15L确实在实验性结肠炎和IBD中起作用，但出乎意料地，其机制是作为抗菌肽而非驱动T细胞向发炎肠道募集。
GPR15L已被描述具有多种功能。在确定为其迄今为止唯一已知的配体GPR15之前[18,19]，抗菌特性和通过受体SUSD2抑制结直肠癌细胞增殖[52]已在体外被描述。然而，对T细胞归巢的影响主导了IBD领域的讨论[53]，且这些不同功能的相对贡献尚未被探索。
使用两种互补的结肠炎模型，我们的数据清楚地表明T细胞或GPR15对于GPR15L的有益作用是不需要的。此外，我们提供了确凿证据，证明GPR15L作为选择性抗菌肽发挥作用，塑造稳态微生物群落，并证明这与结肠炎表型密切相关。
我们的发现与上文所述相反，最近有报告称GPR15l促进肠道炎症[54]：O'Connor及其同事比较了Gpr15−/− Gpr15l−/−与Gpr15−/−小鼠在急性DSS结肠炎模型中，观察到Gpr15l-野生型小鼠疾病活动度增加。然而，重要的是，与Gpr15l缺陷型小鼠在急性DSS结肠炎模型中相比，野生型小鼠的差异仅中等，且在急性三硝基苯磺酸结肠炎模型中，Gpr15l敲除小鼠疾病活动度有增加趋势。此外，这些实验未使用同窝对照，小鼠在整个实验中共同饲养，这与食粪症介导的微生物群交换相关[23,24]，导致我们实验中的β多样性相似。因此，与我们的数据一致，该报告强调GPR15L独立于GPR15的功能在慢性结肠炎背景中很重要。然而，虽然突显了对GPR15L与GPR15互作的进一步研究需求，但这些实验并非旨在解决GPR15L的抗菌潜力，因此不能被视为与我们发现相矛盾。
鉴于GPR15L的总体功能谱，GPR15L应被视为宿主防御肽，类似于防御素或如白氨酸-白氨酸-37(LL-37)的阳离子抗菌肽[56]，对这些肽也报道了类似的MIC和IC50[57-59]。功能上，这些肽同样具有抗菌特性和调控免疫反应的重要作用，包括免疫细胞募集[60]。GPR15L与这些肽共享高度阳离子结构，因此可能具有类似的抗菌机制，基于与细菌带负电荷的细胞壁相互作用，最终导致孔形成和膜解体（Shai-Matsuzaki-Huang模型）[9,57]。这也可以解释GPR15L的选择性活性，因为共生肠道微生物已发展出减少此类相互作用潜能的策略[61]。虽然GPR15L的确切抗菌机制不在我们研究范围内，但我们的数据显示GPR15L的抗菌活性对盐敏感，支持了这一推测[42,43]。此外，在我们的功能预测分析中，硬脂酸生物合成途径上调，可能表明GPR15L具有抗菌膜攻击效应，导致膜应激和磷脂生物合成的后续调节，正如对其他膜活性抗生素研究的那样[62]。因此，未来研究需要进一步研究GPR15L的作用机制。
除了这些机制考虑外，GPR15L与跨不同数据集和抗菌测定中微生物共有的稳态特征相关。具体来说，我们始终观察到与粘膜稳态保护功能相关的共生菌如Prevotellaceae或Alistipes[28,29,47]在GPR15L存在下富集，而致病菌如大肠杆菌或粪肠球菌[63,64]减少。另一方面，GPR15L缺失时，Bacteroides和与IBD相关的细菌如Lachnoclostridium[30,37,39]富集，而关键共生菌如Roseburia或Rikenella[34-36]丰度减少。尽管宿主微生物群落与粘膜稳态或慢性肠道炎症之间明确的因果关系仍需建立，但现有证据总体支持GPR15L依赖性微生物组成轨迹促进宿主-微生物群互作稳态的解释。
我们的观察表明GPR15L对人类粪便中微生物群落的影响，以及其在IBD患者中的表达，包括活动性UC中GPR15L表达下调、与微生物α多样性共调节和与无发作生存期相关，强烈表明在小鼠中观察到的GPR15L的抗菌特性和对结肠炎的有益作用在人类患者中得到保守。因此，基于在实验性结肠炎中显示的治疗潜力，这表明GPR15L可能作为IBD的未来治疗策略。特别是，局部递送至大肠可能对抗疾病驱动的失调，重建稳态宿主-环境互作[65]。最终，这甚至可能在预防性设置中具有前景。
综上，我们的数据不仅揭示了GPR15L在调节肠道炎症中的先前未知作用，还为补充免疫系统激活下游通路中已建立靶点的初始宿主-微生物群互作病理机制提供了新策略。
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