内皮细胞Ercc1 DNA修复缺陷引发血脑屏障功能障碍
脑血管的老化在神经血管和神经退行性疾病的发病机制中起着关键作用，从而导致认知能力下降。除了其他因素外，DNA损伤强烈促进细胞老化，然而，基因组不稳定性在脑内皮细胞（EC）中的作用及其对脑稳态的潜在影响仍然不清楚。本研究通过使用缺乏切除修复交叉互补群1（ERCC1）的人类脑内皮细胞（ECs）和特异性敲除内皮细胞Ercc1的小鼠模型（EC-KO），研究了内皮细胞老化对血脑屏障（BBB）功能的影响。体外实验表明，ERCC1缺陷型脑内皮细胞表现出衰老相关分泌表型表达增加、BBB完整性降低和由于Dll4-Notch通路失调引起的更高的新生血管能力。与此一致的是，EC-KO小鼠显示更多的P21+细胞、血管生成标记物表达增强以及脑内皮细胞和周细胞数量的增加。此外，EC-KO小鼠表现出BBB渗漏和细胞黏附分子表达增加，并伴有外周免疫细胞浸润到大脑。这些发现局限于白质区域，提示区域易感性。总的来说，我们的结果强调了内皮细胞老化作为BBB功能受损、内皮细胞新生血管和免疫细胞迁移入脑的驱动因素，进而导致大脑稳态受损，如在老化过程中观察到的那样。
随着年龄的增长，细胞修复机制逐渐恶化，导致DNA损伤累积和细胞老化加剧。DNA损伤反应可以通过多种机制诱导衰老，包括代谢变化、转录应激和细胞衰老。当细胞达到复制能力的终点时，它们会进入不可逆的细胞周期停滞状态，即衰老。衰老细胞在代谢上仍活跃，并获得特定的衰老相关分泌表型（SASP），其特征是细胞因子（例如，白细胞介素IL-6、IL-1β）、趋化因子（例如，CXCL1、CXCL10）、血管活性介质和生长因子（例如，VEGF、TGF-β）的产生。采用删除切除修复交叉互补群1（Ercc1）的小鼠模型已被成功用于研究人类衰老和细胞衰老。Ercc1敲除小鼠（Ercc1 Δ/- KO）密切模拟人类血管衰老，表现为血管僵硬度增加、细胞外基质重塑和舒张功能减弱，从而支持DNA损伤与年龄相关的血管损伤之间的联系。然而，内皮细胞老化对BBB功能的具体影响尚不清楚。
在这项研究中，我们研究了EC老化对体外和体内BBB功能和炎症的影响。我们报告说，人类脑内皮细胞中ERCC1缺陷导致SASP表达、BBB功能降低和通过Dll4-Notch轴失调引起的内皮细胞新生血管能力增强。与此一致的是，EC-KO小鼠在白质（WM）中显示出血管生成标记物表达增加以及内皮细胞和周细胞数量的增加。EC-KO小鼠还表现出BBB渗漏、血管周围胶质细胞反应以及白质区的白细胞浸润。总之，我们认为衰老的脑内皮细胞在老化过程中积累，从而促进BBB功能障碍和过度新生血管，这可能有助于神经退行性疾病的病理发生。
为了研究特异性内皮细胞Ercc1敲除小鼠（EC-KO）脑稳态受老化的影响，我们首先使用多重qPCR检测了EC-KO小鼠与野生型（WT）小鼠全脑匀浆（WBH）中衰老相关基因表达的变化。结果显示，EC-KO小鼠脑中Ercc1 mRNA表达减少（p = 0.0001）。衰老标志物Cdkn1a（编码P21）（p = 0.002）、Tnfa（p = 0.002）和Icam1（p = 0.004）的mRNA表达在EC-KO小鼠脑中增加，而Il-6（p = 0.06）表现出相似趋势，Cdkn2a（编码P16）和Il-1b未见显著差异。免疫组化分析也显示，与WT小鼠相比，EC-KO小鼠中P21水平增强（p = 0.021），并与内皮细胞标记物Lectin共定位（p = 0.021）。
为了评估EC-KO小鼠BBB特性，我们进一步研究了WBH中BBB相关标记物的mRNA表达。我们发现，与WT小鼠相比，EC-KO小鼠中Cldn5和Cdh5的mRNA表达显著增加（p = 0.009和p = 0.0009），而Lama1、Tjp1、Mdr1a（编码P-GP）和Mfsd2a未见显著变化。我们还通过免疫组化检测了WT和EC-KO小鼠不同脑区中P-GP和MFSD2A的水平。结果显示，在EC-KO小鼠的白质（WM）中，P-GP（p = 0.046）和MFSD2A（p = 0.003）免疫反应（荧光平均强度（MI））增加，而在海马（HC）中P-GP表达有增加的趋势（p = 0.102）。与此同时，我们发现在EC-KO小鼠WM中的血管覆盖度（反应面积/Lectin面积）更高（P-GP（p = 0.039）；MFSD2A（p = 0.013））。在皮层（CRTX）或海马（HC）中未见差异。接下来，我们将重点放在WM中，通过免疫组化分析CLDN5水平。比较EC-KO和WT小鼠之间血管中CLDN5+血管数量和CLDN5荧光强度（MI）未见显著差异。综上所述，内皮细胞特异性Ercc1介导的老化在WM中增加了P21+细胞和BBB转运蛋白水平。
基于我们在shERCC1细胞中的发现，我们进一步研究了EC-KO和WT小鼠WBH中与血管生成相关的标记物。我们观察到，与WT小鼠相比，EC-KO小鼠中Kdr（p = 0.026）、Pdgfrb（p = 0.030）、Angpt2（p = 0.001）和Cd31（p = 0.075）的mRNA表达增加。Vegfa、Dll4、Notch1和Snai2 mRNA在实验组间未见变化，但我们观察到在EC-KO小鼠WM血管中SNAI2蛋白水平增加。
由于我们在EC-KO小鼠中观察到血管生成标记物增加，我们进一步研究了EC-KO和WT小鼠脑中血管结构的潜在变化。我们使用PDGFRβ、αSMA和LAMININ三重免疫染色区分毛细血管和小动脉。与WT小鼠相比，EC-KO小鼠WM中毛细血管EC（占总细胞的百分比）增加（p = 0.043），而在CRTX或HC中未见差异。相比之下，小动脉EC（占总细胞的百分比）在所有区域的基因型间无显著差异。EC-KO小鼠WM中毛细血管密度（αSMA-、PDGFRβ+血管面积/总面积）有增加趋势（p = 0.088），而整体血管密度和小动脉密度（αSMA+、PDGFRβ+血管面积/总面积）在所有三个脑区的EC-KO和WT小鼠之间无显著变化。最后，我们发现EC-KO小鼠WM中的周细胞（占总细胞的百分比）显著高于WT小鼠（p = 0.027），而在HC中也有显著增加（p = 0.028）。周细胞覆盖度（PDGFRβ+面积/层粘连蛋白面积）不受影响。在平滑肌细胞（SMC）和SMC血管覆盖度方面未见差异，PDGFRβ和αSMA的平均表达水平（MI）在EC-KO和WT小鼠之间也无显著差异。最后，我们评估了血管变化是否导致BBB渗漏。我们发现，与WT小鼠相比，EC-KO动物WM中IgG反应增加（p = 0.040），而在灰质（平均CRTX和HC）中IgG反应未见显著差异。综上所述，这些数据表明，EC-KO小鼠在WM中表现出微血管变化，导致局部BBB渗漏。
基于在EC-KO小鼠WM中观察到的IgG渗漏，我们接下来关注可能存在的局部炎症。在全脑裂解液中，我们发现P2ry12 mRNA（p = 0.027）显著增加，这是一种小胶质细胞的稳态标志物，Gfap（p = 0.06）也有类似趋势，这是星形胶质细胞活化的标志。在WM组织中，我们观察到EC-KO小鼠中IBA1+细胞更多。此外，我们发现EC-KO小鼠WM中P2RY12水平降低（p = 0.012），这可能表明小胶质细胞活化。值得注意的是，GFAP-血管共定位在EC-KO小鼠WM中更高（p = 0.006）。接下来，我们通过血管ICAM1表达分析BBB炎症。EC-KO小鼠WM中ICAM1+血管（p = 0.001）和血管ICAM1水平（p = 0.052）均增加。使用CD45鉴定外周免疫细胞和CD8鉴定细胞毒性CD8+ T细胞（图5h），我们发现EC-KO小鼠WM中外周免疫细胞密度增加（p = 0.018）。几乎一半的细胞位于实质组织中，与WT和EC-KO小鼠脑相似。27%的实质细胞为CD8+ T细胞，而周细胞为9%。在WT小鼠脑中，所有实质Cd45+细胞均为Cd8阳性（总数：2个细胞），而所有周细胞均为Cd8阴性。总之，我们的发现表明，内皮细胞老化伴随着BBB炎症和外周免疫细胞迁移到大脑，突出了内皮细胞在中枢神经系统老化及随后炎症中的关键作用，尤其是在WM中。
综上所述，我们的研究表明，内皮细胞老化在BBB功能障碍、血管生成和局部炎症中起重要作用，是几种中枢神经系统疾病发展和进展的关键因素。因此，针对脑血管老化的策略可能是缓解与年龄相关的血管疾病及其神经学后果的一种有前途的方法。
(全文结束)
