摘要
脑内出血(ICH)是一种致命性中风亚型，其特征是由病理性细胞内钙离子(Ca2+)信号传导引起的继发性损伤。ATP和凝血酶等生物活性分子会激活多种受体亚型。因此，靶向共同的下游分子机制可能比抑制单个受体更为有效。一个潜在的候选分子是瞬时受体电位经典型3(TRPC3)，这是一种可通过Gq/磷脂酶C信号通路激活的钙离子通透性非选择性阳离子通道。然而，TRPC3在脑内出血中的作用仍不清楚。因此，本研究旨在通过使用TRPC3基因敲除(KO)小鼠和星形胶质细胞特异性敲低方法，研究TRPC3在脑内出血后神经功能障碍中的作用。与野生型小鼠相比，TRPC3-KO小鼠在脑内出血后1天和3天表现出显著更低的神经功能缺损评分，并在转棒实验中表现更好，表明TRPC3在功能损伤中起关键作用。然而，使用腺相关病毒载体对星形胶质细胞特异性敲低TRPC3并未显著改善神经功能障碍。这些结果表明，TRPC3参与脑内出血后的神经功能障碍，但其病理作用不能仅由星形胶质细胞中的TRPC3来解释，表明多种细胞类型参与其中。总之，TRPC3是参与脑内出血后神经功能障碍的关键通道，提示靶向TRPC3可能为减轻脑内出血后的神经功能障碍提供新的治疗策略。
引言
脑内出血(ICH)是致死率最高的脑血管疾病亚型。即使在幸存者中，也常导致严重的神经功能缺损。在脑内出血后细胞损伤的响应中，ATP和凝血酶等生物活性分子会释放到细胞外空间1)。这些分子激活细胞内钙离子(Ca2+)信号传导2)，这涉及细胞活化和炎症反应，从而促进神经功能障碍的进展。然而，将这些生物活性分子与钙离子信号传导联系起来的分子机制仍不清楚。此外，ATP和凝血酶通过多种受体亚型发挥作用。因此，靶向单个受体可能不足以抑制整体信号级联。靶向整合这些不同受体信号的共同下游分子机制可能代表更有效的治疗策略。
瞬时受体电位经典型3(TRPC3)是一种受体调控的、钙离子通透性非选择性阳离子通道3),4)，在包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞在内的各种脑细胞类型中表达5)。ATP和凝血酶通过各自的受体激活Gq/磷脂酶C信号传导，导致通过二酰甘油激活TRPC36),7)。因此，TRPC3可能作为多种受体介导信号通路的中心整合器。TRPC3已被认为参与几种神经系统疾病，包括神经病理性疼痛和蛛网膜下腔出血8),9)，但其在脑内出血中的作用在很大程度上仍不清楚。我们先前报道，TRPC3抑制剂ethyl-1-(4-(2,3,3-trichloroacrylamide)phenyl)-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrazole-4-carboxylate (Pyr3)可减轻脑内出血后的神经功能缺损和星形胶质细胞增生10)。然而，Pyr3也抑制钙释放激活的钙通道蛋白1(Orai1)11)，表明其效果可能并非特异性地针对TRPC3。此外，Orai1在包括小胶质细胞12)、星形胶质细胞13),14)、神经元和内皮细胞在内的各种脑细胞类型中表达。先前的研究通过脑室内或全身给药方式给予Pyr3。因此，对其效果负责的具体细胞类型仍不清楚。
在本研究中，我们使用TRPC3基因敲除(KO)小鼠来研究TRPC3在脑内出血后神经功能障碍中的作用。考虑到TRPC3在多种细胞类型中表达，我们还考察了其细胞类型特异性贡献。
材料与方法
动物
所有动物实验均按照京都大学动物实验委员会和日本药理学会的伦理准则进行。所有动物使用和研究方案均获得京都大学动物实验委员会批准（批准号：20-42，25-82）。C57BL/6J小鼠(RRID: IMSR_JAX:000664)购自日本SLC（静冈，日本）。TRPC3-KO小鼠由美国国家环境卫生科学研究所的Lutz Birnbaumer博士和九州大学的Motohiro Nishida博士提供。如先前所述8)，使用8-12周龄的雄性C57BL/6J野生型(WT)和TRPC3-KO小鼠进行实验。使用的动物数量根据经验确定，并与先前报道相似15)。
脑内出血模型
如先前所述10),15)，通过将胶原酶VII(0.025 U; Cat# C2399; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)溶于0.5 μL磷酸盐缓冲液(PBS)中注射到右侧纹状体来诱导实验性脑内出血。简言之，小鼠用三种麻醉剂混合物（美替咪啶0.3 mg/kg，日本Zenya制药；咪达唑仑4.0 mg/kg，富士制药；布托啡诺5.0 mg/kg，明治制果制药）麻醉，并置于立体定位框架中。使用微注射泵以0.20 μL/min的恒定速率，通过30号针头将0.5 μL PBS中的胶原酶VII注射到右侧纹状体（前后+0.2 mm，内外+2.3 mm，背腹+3.5 mm，从前囟计算）。同样，将0.5 μL PBS输注到左侧（对侧）纹状体。
行为测试
如先前所述10),15)，在手术后1天和3天，由对治疗不知情的实验者使用神经功能缺损评分(NDS)系统和转棒测试评估神经和感觉运动功能。
质粒载体构建和腺相关病毒(AAV)生产
基于先前描述的方法16)，构建了在巨细胞病毒(CMV)或GfaABC1D启动子控制下表达靶向Trpc3的microRNA(miRNA)的AAV载体，并在Lenti-X 293T细胞中生产。所有AAV的滴度如表1所示。
表1. RNA干扰实验中使用的AAV滴度
| 名称 | 滴度（基因组拷贝数/mL） |
|---|---|
| AAVDJ-CMV-EmGFP-miRNA-NC | 4.04 × 1012 |
| AAVDJ-CMV-EmGFP-miRNA-Trpc3 | 4.75 × 1012 |
| AAVDJ-GfaABC1D-EmGFP-miRNA-NC | 22.5 × 1012 |
| AAVDJ-GfaABC1D-EmGFP-miRNA-Trpc3 | 21.7 × 1012 |
AAV：腺相关病毒；CMV：巨细胞病毒；EmGFP：翠绿色荧光蛋白；miRNA：microRNA；NC：阴性对照；TRPC3：瞬时受体电位经典型3。
敲低验证
如先前报道17)，从0-2日龄新生小鼠的大脑皮层制备富含星形胶质细胞的原代培养物。通过定量RT-PCR在感染AAV载体的原代星形胶质细胞中评估敲低效率。实验中使用的寡核苷酸引物序列列于表2。
表2. 定量RT-PCR中使用的寡核苷酸引物序列
| 目标 | Fw (5′–3′) | Rv (5′–3′) |
|---|---|---|
| Trpc3 | GGGTGAAGACCACCCAGTTC | ACAGCTCCTTGCACTCAGAC |
| 18s rRNA | GCAATTATTCCCCATGAACG | GCCCTCACTAAACCATCCAA |
Fw：前向；Rv：反向；rRNA：核糖体RNA。
AAV注射
如脑内出血模型部分所述并经先前描述略有修改10),15)，进行纹状体内AAV注射。在AAV注射后2周进行行为测试。
统计分析
使用Prism 8 (GraphPad Software, Boston, MA, U.S.A.)进行统计分析。使用Welch's t检验比较单一实验组和对照组。使用重复测量双向方差分析(ANOVA)后接Bonferroni's post hoc检验比较多个实验组。每个数据点代表一个样本。每个实验组中使用的样本数列于表3。评估者对治疗条件不知情。
表3. 各实验组中使用的样本数及ANOVA结果
| 组 | n | 统计 | ANOVA表 | F (DFn, DFd) | p-值 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1B | WT TRPC3-KO | 8 | 重复测量双向ANOVA | 时间 × 组 | F (2, 38) = 12.68 | <0.0001 |
| 13 | 时间 | F (2, 38) = 33.56 | <0.0001 | |||
| 组 | F (1, 19) = 15.11 | 0.0010 | ||||
| 受试者 | F (19, 38) = 3.351 | 0.0007 | ||||
| 1C | WT TRPC3-KO | 8 | 重复测量双向ANOVA | 时间 × 组 | F (2, 38) = 13.13 | <0.0001 |
| 13 | 时间 | F (2, 38) = 24.62 | <0.0001 | |||
| 组 | F (1, 19) = 12.76 | 0.0020 | ||||
| 受试者 | F (19, 38) = 2.817 | 0.0032 | ||||
| 2A | NC Trpc3-KD | 3 | Welch's t检验 | 0.0135 | ||
| 3 | ||||||
| 2C | NC Trpc3-KD | 9 | 重复测量双向ANOVA | 时间 × 组 | F (2, 34) = 0.9382 | 0.4012 |
| 10 | 时间 | F (2, 34) = 44.49 | <0.0001 | |||
| 组 | F (1, 17) = 0.7190 | 0.4083 | ||||
| 受试者 | F (17, 34) = 3.441 | 0.0011 | ||||
| 2D | NC Trpc3-KD | 9 | 重复测量双向ANOVA | 时间 × 组 | F (2, 34) = 1.869 | 0.1698 |
| 10 | 时间 | F (2, 34) = 13.03 | <0.0001 | |||
| 组 | F (1, 17) = 0.1375 | 0.7154 | ||||
| 受试者 | F (17, 34) = 2.880 | 0.0042 |
WT：野生型；KO：基因敲除；RM：重复测量；KD：敲低；DFn：分子自由度；DFd：分母自由度。
结果
TRPC3基因敲除对脑内出血后神经功能障碍的影响
为研究TRPC3在脑内出血后神经功能障碍中的作用，我们在脑内出血诱导后1天和3天评估了WT和TRPC3-KO小鼠的神经功能缺损和转棒测试表现(图1A)。在WT小鼠中，胶原酶注射后1-3天NDS显著增加。相比之下，脑内出血后TRPC3-KO小鼠的NDS显著降低(图1B)。在转棒测试中，WT小鼠在脑内出血后坠落潜伏期缩短；然而，这种缩短在TRPC3-KO小鼠中显著改善(图1C)。
图1. WT和TRPC3-KO小鼠的脑内出血影响
(A) 脑内出血和行为测试的时间进程。(B-C) WT和TRPC3-KO小鼠的神经功能缺损总结数据，通过NDS(B)和转棒测试(C)评估。n = 8-13。重复测量双向方差分析与Bonferroni's post hoc检验。条形表示均值±标准误。ICH：脑内出血；WT：野生型；TRPC3：瞬时受体电位经典型3；KO：基因敲除；NDS：神经功能缺损评分；RM：重复测量；S.E.M.：标准误。
星形胶质细胞特异性TRPC3敲低对脑内出血后神经功能障碍的影响
星形胶质细胞参与脑内出血后的神经功能障碍10)。因此，我们研究了星形胶质细胞TRPC3在这一功能障碍中的作用。我们生成了表达靶向Trpc3的miRNA的AAV载体。该载体受基于AAV-CMV-翠绿色荧光蛋白(EmGFP)-miRNA-Trpc3的星形胶质细胞特异性GfaABC1D启动子控制，称为AAV-GfaABC1D-EmGFP-miRNA-Trpc3。在体外实验中，AAV-CMV-EmGFP-miRNA-Trpc3将原代培养星形胶质细胞中的TRPC3表达降低了约50%(图2A)。在体内实验中，将AAV-GfaABC1D-EmGFP-miRNA-Trpc3或对照病毒(AAV-GfaABC1D-EmGFP-miRNA-阴性对照[NC])注射到纹状体中，并在2周后诱导脑内出血(图2B)。在这些条件下，星形胶质细胞特异性TRPC3敲低显示出抑制的趋势，但在脑内出血诱导后，NDS或转棒测试表现均未观察到显著差异(图2C和图2D)。
图2. WT和星形胶质细胞Trpc3-cKD小鼠的脑内出血影响
(A) 原代培养星形胶质细胞中的Trpc3 mRNA表达。n = 3。Welch's t检验。(B) AAV注射、脑内出血和行为测试的时间进程。(C, D) WT小鼠和Trpc3-KD小鼠的神经功能缺损总结数据，通过NDS(C)和转棒测试(D)评估。n = 9-10。重复测量双向方差分析与Bonferroni's post hoc检验。条形表示均值±标准误。AAV：腺相关病毒；cKD：条件性敲低；KD：敲低；miRNA：microRNA；NC：阴性对照；EmGFP：翠绿色荧光蛋白。
讨论
在本研究中，我们证明TRPC3参与脑内出血后的神经功能障碍。然而，星形胶质细胞特异性TRPC3敲低并未导致显著的功能改善，这表明仅在星形胶质细胞中的TRPC3活性不足以完全解释观察到的病理。
使用TRPC3-KO小鼠，我们揭示了TRPC3在脑内出血后神经功能缺损中的关键作用。值得注意的是，TRPC3-KO小鼠在反映整体神经严重程度的NDS和测量高级运动功能的转棒测试表现方面均表现出显著改善。这些结果表明，TRPC3不仅涉及组织损伤，还涉及脑内出血后的更复杂的运动功能障碍。在我们先前的研究中，我们发现TRPC3抑制剂Pyr3可减轻神经功能缺损10)；然而，由于Pyr3也抑制Orai111)，其靶特异性仍不清楚。目前的结果提供了遗传证据，表明TRPC3本身而非Orai1导致脑内出血诱导的神经功能障碍。
尽管我们的数据支持TRPC3在脑内出血病理中的作用，但星形胶质细胞特异性敲低并未产生显著效果。这一发现表明，TRPC3功能不仅限于单一细胞类型，而是涉及多种细胞群体的协调作用。尽管如此，先前的研究表明，凝血酶诱导星形胶质细胞TRPC3，这有助于星形胶质细胞活化18)。此外，据报道Pyr3可抑制星形胶质细胞增生10)，支持星形胶质细胞TRPC3在疾病进展中的潜在作用。
本研究存在应考虑的技术局限性。体外miRNA构建体的敲低效率约为50%，体内效率可能进一步受到AAV转导和表达水平变异的影响。此外，先前的报告表明GfaABC1D启动子不具有完全的星形胶质细胞特异性，也可能在部分神经元中驱动转基因表达19)。因此，目前的AAV系统可能未在体内实现足够的星形胶质细胞特异性TRPC3抑制。实际上，由于缺乏针对TRPC3的特异性抗体，我们无法在本研究中验证体内星形胶质细胞中的TRPC3敲低效率。因此，TRPC3在体内可能抑制不足，这可能导致低估其对脑内出血后神经功能障碍的贡献。未来研究需要使用改进的星形胶质细胞靶向方法，如具有更高星形胶质细胞特异性的替代启动子和星形胶质细胞特异性条件性KO小鼠，以阐明星形胶质细胞TRPC3在脑内出血病理中的精确作用。总之，我们的发现确定TRPC3是脑内出血后神经功能障碍的重要贡献者。然而，其在特定细胞类型中的作用及潜在的细胞间相互作用参与仍有待阐明。
总之，TRPC3是参与脑内出血后神经功能障碍的关键通道，表明抑制TRPC3功能可能是改善脑内出血后神经功能障碍的新治疗策略。然而，其效果不能仅由星形胶质细胞TRPC3完全解释。因此，可能涉及跨越多种细胞类型的机制。
致谢
我们感谢Kaneko Shuji博士的宝贵建议。本工作得到了日本文部科学省/日本学术振兴会科学研究费补助金（H.S.，JP23K27330、JP24K22166和JP26K02326）、武田科学振兴财团（H.S.）和上原纪念生命科学财团（H.S.）的支持。
声明
利益冲突
作者声明无利益冲突。
【全文结束】