摘要
肠道微生物群通过"脑肠轴"与大脑深度互联，其功能紊乱可能导致神经系统和精神疾病。本研究开发了一种高通量工作流程，通过靶向培养结合宏基因组测序和生物信息学分析，成功分离出147株肠道菌株，其中41株表现出免疫调节特性，12株具有免疫抑制功能且能产生重要脑功能代谢物。该方法建立了严格厌氧菌培养、保藏和表型鉴定的最佳条件，表征了7株极度氧敏感菌株的安全性和益生潜力。
引言
人类肠道微生物群（HGM）通过复杂双向通信（脑肠轴）调节大脑功能。神经系统和精神疾病常伴随肠道菌群失调，导致微生物衍生代谢物（MDMs）组成改变，引发慢性肠道炎症并影响大脑功能。短链脂肪酸（SCFA）如乙酸、丙酸、丁酸可通过维持血脑屏障完整性和调节神经炎症发挥保护作用，而γ-氨基丁酸（GABA）的系统性降低与焦虑相关。本研究旨在开发整合培养组学与宏基因组学的高通量方法，填补菌群培养与机制研究的空白。
结果
肠道菌群代谢潜力预测
通过对7名健康捐赠者粪便样本的鸟枪法宏基因组分析，检测到39条SCFA合成通路中的22条。在严格厌氧环境中，混合酸发酵通路（FERMENTATION-PWY）最为丰富，主要由Faecalibacterium prausnitzii等菌种主导。丁酸合成通路中，乙酰辅酶A发酵（PWY-5676）最为常见，涉及Anaerostipes hadrus等菌种。丙酸合成通路主要为（S）-丙二醇降解（PWY-7013），存在于Eubacterium hallii等菌种中。GABA合成通路则在大肠杆菌和未分类菌种中均有发现。
菌株库建立与功能表征
通过优化培养基和培养策略，从292个菌落中筛选出147个不同菌株，其中43株为极度氧敏感（EOS）菌。16S rRNA基因聚类分析将菌株划分为10个亚群，包括双歧杆菌（27株）、肠杆菌科（20株）、EOS（43株）等。选取41株进行功能分析，其中21株EOS、19株双歧杆菌和1株芽孢杆菌。
在Caco-2细胞模型中，41株菌中有13株可显著抑制TNF-α/IL-1β诱导的IL-8分泌，其中7株EOS菌株效果最显著。进一步代谢物检测显示，10株菌产生乙酸（最高135.2 mM），3株EOS菌产生丁酸（最高17.5 mM），仅1株双歧杆菌产生GABA。安全评估显示，所有菌株对万古霉素、四环素敏感，但EOS菌株普遍存在链霉素耐药。
关键发现
未培养菌株（如uncultured_Blautia producta NGB233）展现出最高乙酸产量，而EOS菌株专一性产生丁酸。粘蛋白结合实验显示Lancefieldella pravula NGB231等菌株具有强粘附能力，可能促进肠道定植。本研究所建立的NextGenBiotics（NGB）菌株库包含15株未分类菌株，可能代表新物种，为脑肠轴研究提供了宝贵资源。
讨论
本研究首次整合宏基因组学指导的靶向培养与功能表征技术，成功建立高通量工作流程。研究发现EOS菌株的严格培养条件（如哥伦比亚血琼脂培养）至关重要，而预培养基中添加半胱氨酸和硫乙醇酸钠可提高分离效率。12株抗炎菌株中，7株EOS菌株通过产生SCFA显著抑制IL-8，这与文献报道的丁酸抑制HDAC8/NF-κB通路机制一致。
研究还发现SCFA浓度与IL-8抑制存在负相关，但同一浓度乙酸的不同菌株效果差异提示存在其他代谢物机制。抗生素敏感性测试显示，EOS菌株普遍存在天然耐药性，需进一步基因组分析确认其安全性。粘附能力差异揭示了益生菌定植能力的多样性，为后续动物实验提供依据。
方法学创新
- 开发了基于宏基因组数据的靶向培养策略，成功分离未培养菌种
- 建立严格厌氧菌培养条件优化方案（包括哥伦比亚血琼脂和预还原培养基）
- 首次系统评估12株抗炎菌的SCFA/GABA生产能力与免疫调节的关联性
- 构建包含147株菌的NGB菌株库，其中21株EOS菌可能代表新物种
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