摘要
目的 本研究旨在利用大型前瞻性队列数据，评估儿童期接触宠物和农场动物与成年后患类风湿性关节炎(RA)风险之间的关联。
方法 我们分析了来自法国国家教育互助会女性流行病学研究(Etude Epidémiologique auprès des femmes de la Mutuelle générale de l'Education Nationale, E3N)队列的78,473名女性，其中识别并验证了698例新发RA病例。儿童期接触家养宠物（猫、狗）和农场动物的情况，以及首次接触年龄，由参与者通过预定义的分类选项（例如，从未接触、<1年、1–2年等）自行报告。使用Cox模型估计风险比(HR)，并通过有向无环图选择混杂因素。
结果 与无暴露相比，1-2岁期间早期接触宠物（猫/狗）与RA风险降低相关（校正风险比(aHR) 0.57，95%置信区间(CI) 0.34至0.95），且与吸烟状况无关。然而，在更早（<1岁）或更晚年龄接触宠物则未观察到关联。相反，儿童期接触农场动物（牛、羊、猪）与RA风险增加呈边缘显著关联（aHR 1.26，95% CI 1.00至1.59），且与接触年龄无关。
结论 儿童接触动物的方式和时间可能影响RA发病风险。我们的结果表明，仅在1-2岁期间接触宠物可能与风险降低相关，而在其他年龄段则无此关联；而接触农场动物则与风险增加相关。这些发现应谨慎解读，并需要进一步研究。
临床试验注册号 NCT03285230。
本领域已知信息
- 类风湿性关节炎(RA)的大多数环境风险因素已在成年期被识别；关于儿童期暴露对RA风险的影响知之甚少。
本研究新增内容
- 在这一大型前瞻性队列中，生命早期接触农场动物（牛、羊、猪）似乎与RA风险增加相关。相反，早期接触宠物，特别是1-2岁期间，与RA风险降低相关，提示宠物环境可能发挥作用。
本研究对研究、实践或政策的潜在影响
- 这些初步发现表明，1-2岁之间的早期年龄可能代表一个时间窗口，此期间的暴露可能影响成年后RA风险。
引言
类风湿性关节炎(RA)是成人中最常见的慢性炎症性风湿病，女性占主导（70%的病例）。它源于基因-环境相互作用，其特征是存在一个通常称为"前RA"的临床前或无症状阶段，在此阶段可检测到血清自身抗体，特别是校正后的抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)。在环境因素中，吸烟——尤其在遗传易感个体中（HLA-DRB1表位携带者）——一直与RA风险增加相关，特别是对血清阳性RA。其他吸入性物质，包括二氧化硅、农药和空气污染，可能通过触发肺黏膜炎症和全身免疫激活而产生类似作用。
暴露时间对未来发展为疾病至关重要，可能通过表观遗传机制实现。早期暴露符合自身免疫疾病的病理生理模式，即环境因素在生命早期触发自身免疫，临床疾病在数年后显现，而自身抗体则在症状出现前几年就已存在。在炎症性关节炎之前，肺在早期RA相关自身免疫中的作用正在显现。具有高微生物水平的农村环境可能影响生命早期的免疫成熟和黏膜免疫。农场动物向室内空间（包括儿童卧室）的微生物转移可导致对细菌和真菌的持续暴露。此类暴露可能塑造免疫反应并促进RA发病机制中的自身免疫。在RA中，仅儿童期烟草暴露已被研究；它与成年期风险增加相关。所有这些因素促使我们利用一大群女性队列，研究儿童期动物暴露和农业生活方式与成年后RA风险之间的联系。
材料与方法
法国国家教育互助会女性流行病学研究队列
法国国家教育互助会女性流行病学研究(Etude Epidémiologique auprès des femmes de la Mutuelle générale de l'Education Nationale, E3N)是一项前瞻性队列研究，招募了98,995名40-65岁的法国女性（1989-1991年），她们均隶属于法国国家教育系统健康保险（"Mutuelle Générale de l'Education Nationale"，MGEN）。
参与者完成了一份关于生活方式和病史的基线问卷，并每2-3年收到随访问卷。自2004年起，可获取国家保险（MGEN）索赔数据库中的药物报销数据。每份问卷的平均回复率为83%，3.2%的参与者失访超过20年。所有参与者均提供书面知情同意。该研究获得法国国家数据保护和隐私委员会批准（ClinicalTrials.gov ID：NCT03285230）。
RA病例的识别
E3N中的RA病例通过先前报告的验证程序识别。在2007年至2014年（Q9-Q11）期间，3,230名女性自报患有炎症性风湿病（RA或脊柱关节炎）。2017年，发送了一份验证问卷以确认RA并精确诊断症状开始日期；参与者还被邀请提供其医疗记录。如果参与者报告RA并满足以下至少一项标准，则确认为RA：（1）医生确认的诊断；（2）使用疾病修饰抗风湿药物或RA特异性生物制剂；（3）类风湿因子(RF)或ACPA阳性；或（4）符合1987年美国风湿病学会标准中的至少4项。RA特异性药物包括甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、肿瘤坏死因子α抑制剂、利妥昔单抗、托珠单抗、阿巴西普和阿那白滞素。对验证问卷无回应者，如果他们自报RA并在MGEN索赔数据库中有RA特异性药物报销，则被视为RA病例。在先前发表的验证研究中，该方法的敏感性和特异性分别为70.5%和87.3%。在最初自报RA的2,692名女性中，823名通过问卷验证，141名通过MGEN数据验证，共964名验证RA病例（698例新发，266例现患）。进行了医疗记录审查（n=399）以进一步评估验证算法；敏感性和特异性分别为66.7%和99.3%。诊断日期基于自报（在有医疗记录时经验证）或对无回应者，基于首次RA特异性治疗报销日期。发病率和患病率估计与40-85岁法国女性报告的一致。RA病例的基线特征见在线补充表1。
在基线（Q1，1990年），E3N队列包括98,995名女性。在Q7（2002年），93,389名仍符合条件，81,453名返回了问卷（回复率87%）。
儿童期动物和农业生活方式暴露
2002年问卷（Q7）收集了儿童期接触宠物和农业环境的数据。参与者报告了童年时期是否养猫或狗（是/否）。如果是，他们需指定是猫、狗还是两者都有，以及首次接触年龄（<1年、1-2年、2-5年或5-16年）。他们还表示是否在农场居住至少三个月，发生此情况的年龄，父母是否为农民，以及农场是否有动物（是/否）。如果是，参与者指出这些是否包括作为单一类别的牛/猪/羊和/或其他动物。然后，我们创建了"两者"类别以捕获同时暴露于牛/猪/羊和其他动物的情况。
为进一步探索农村生活，我们使用出生县（在基线Q1，1990年收集）对农村状态进行分类：居民少于1,000人的县被视为农村。我们还应用了Varraso等人开发的牛密度评分，该评分基于农业普查数据对儿童期接触牛进行分类。由于RA病例数量少，我们将评分类别0-1分组为低暴露，2-3分组为高暴露。
风险因素和潜在混杂因素
与RA相关的风险因素
儿童期被动吸烟（Q2，1992年）定义为每天至少暴露数小时。主动吸烟分为从不、前吸烟者或当前吸烟者。体重、身高和吸烟状况在基线收集并随后更新。
身体质量指数(BMI)使用世界卫生组织定义进行分类。教育分为三个水平：<高中、≤2年大专或≥3年。
妊娠次数和首次妊娠年龄（Q1，Q2）被分类为（<22岁、22-27岁、≥27岁或从未怀孕）。饮食习惯（Q3，1993年）用于计算地中海饮食评分（低：0-3，中：4-5，高：6-9）。
所有这些协变量都是基于它们与RA风险的已知或疑似关联而选择的，无论是在我们的队列中还是在文献中。
其他儿童期环境暴露
2002年问卷（Q7）收集了关于子宫内母亲吸烟暴露、母乳喂养状态（由母亲或奶妈）与不母乳喂养以及出生体重（<2.5千克、正常、>4千克）、妊娠年龄（早产/足月）、出生长度（短/正常/长）的信息，基于法国和世界卫生组织定义。
在基线问卷（Q1，1990年），参与者还报告了他们在第二次世界大战(WWII)期间经历的食物匮乏程度，分类为无、中度、显著（例如，持续饥饿）或严重（例如，驱逐）。这种早期营养困难与长期健康结果相关。
统计分析
对于本研究，我们排除了未完成相关问卷的女性、被诊断为除RA外的炎症性风湿病（主要是脊柱关节炎和银屑病关节炎）的女性、现患RA病例（基线前诊断）以及诊断日期缺失的RA病例。流程图见图1。
我们描述了整个队列的基线特征和儿童期暴露，并按RA状态分层。连续变量总结为均值（±标准差），分类变量总结为计数和百分比（n，%）。鉴于E3N队列的样本量大，我们在描述性表格中强调了基线特征的大小和分布，而非统计显著性检验。为评估潜在选择偏倚，我们还比较了回答儿童动物暴露问题（Q7）的参与者与未回答者的基线特征。
使用Cox比例风险模型估计RA风险的风险比(HR)和95%置信区间(CI)，以年龄为时间尺度。进入年龄对应于Q1时的年龄，退出年龄对应于RA诊断时的年龄（病例）或最后一次返回问卷时的年龄（至Q11，2014年）（非病例）。主动吸烟和BMI被视为时变变量。考虑到历史背景——约三分之一的参与者出生于二战期间——模型按出生代际分层：≤1930年、1930-1935年、1935-1940年、1940-1945年和1945-1950年。
为评估儿童期动物暴露和/或农业生活方式与RA风险之间的关联，我们拟合了三个Cox模型：
- 模型1：仅以年龄为时间尺度。
- 模型2：额外调整已知RA风险因素：主动吸烟、被动吸烟（儿童期/成年期）、BMI和教育水平。
- 模型3（完全调整）：通过DAGitty创建的有向无环图(DAGs)选择协变量，以估计总效应并最小化混杂（见在线补充图1-3）。
模型3的调整集定义如下：
- 儿童期宠物暴露：首次妊娠年龄、出生参数、母乳喂养、教育、被动/主动吸烟、农村出生、出生年份和农业生活方式。
- 儿童期农业生活方式（在农场居住≥3个月、农民父母和接触农场动物）：儿童期宠物、首次妊娠年龄、出生参数、母乳喂养、地中海饮食、农村出生、教育、被动/主动吸烟、二战食物匮乏和出生年份。
- 农村出生：儿童期宠物、首次妊娠年龄、出生参数、母乳喂养、教育、吸烟（被动和主动）、出生年份和农业生活方式。
为评估未测量混杂的潜在影响，我们使用标准方法计算了校正HR的E值。对于HR≥1，。对于HR<1，我们首先设定，然后。我们还计算了最接近零假设的95%CI边界E值。E值代表未测量混杂因素需要与暴露和结果都具有的最小关联强度，超出测量协变量，以完全解释观察到的关联。作为经验法则，E值<2表明稳健性有限（易受适度未测量混杂影响），2-3之间的值表明中等稳健性，而>3的值表明只有强混杂因素才能解释这些发现。
对有序变量使用线性趋势检验。探索了儿童期暴露与吸烟（主动/被动）之间的交互作用。还进行了按吸烟状态（曾经/从不）分层的探索性分析，但功效有限。进行了敏感性分析以评估Q7时的潜在回忆偏倚。主要分析包括自队列进入（Q1）以来的所有新发RA病例，因为儿童期暴露发生在16岁之前，因此早于Q1和Q7；然后我们重复分析，仅限Q7时无RA的女性和此后诊断的新发RA。
对于协变量，当缺失<5%时，使用中位数（连续）或最频繁类别（分类）进行插补。否则，创建"缺失"类别。主要暴露变量未进行插补；使用"缺失"类别。双侧p值<0.05被认为具有统计学意义。使用SAS V.9.4（SAS Institute，美国北卡罗来纳州凯里）进行分析。
结果
研究人群特征
在E3N队列的98,995名女性中，78,473名纳入本研究，包括698例新发RA病例。RA诊断的平均年龄为63.8岁（标准差±9.0）（见在线补充表1）。总体而言，64%的女性（n=48,373）报告有任何儿童期动物暴露。其中，62%仅暴露于宠物（猫和/或狗），28.9%同时暴露于宠物和农场动物，4.8%仅暴露于农场动物。
儿童期在农场居住至少3个月的女性比例在RA和非RA组之间相似（24.4%对28.0%）。在曾在农场居住的女性中，近一半报告其父母是农民。共同暴露很常见：84%暴露于农场动物的女性也报告宠物暴露，而未暴露于农场动物的女性中这一比例为56%。暴露变量的项目级缺失也在表1中报告。观察到回应者和非回应者之间协变量分布的轻微差异，但各组之间的粗RA发病率相似。
儿童期宠物暴露与RA风险
儿童期任何时间接触猫和/或狗与新发RA风险无关。然而，宠物首次接触年龄似乎与RA风险呈反向关联。与从未接触宠物的女性相比，首次在1-2岁期间接触宠物的女性（n=16）在成年后RA风险显著降低（模型3中的校正HR (aHR) 0.57，95% CI 0.34至0.95），点估计的E值为2.90，CI边界的E值为1.29。当合并<1岁和1-2岁时，关联为零（HR 0.98，95% CI 0.79至1.22）；相应的CI E值（1.00）表明合并对比的稳健性有限。
儿童期农场环境与RA风险
儿童期在农场居住至少3个月、父母是农民或在农村地区出生与RA风险无关。
然而，儿童期接触农场动物，特别是牛、猪和/或羊，与模型1和模型2中RA风险增加相关（aHR 1.26，95% CI 1.00至1.59），尽管在完全调整的基于DAG的模型（模型3）中，这种关联不再具有统计学意义（aHR 1.26，95% CI 0.99至1.60）。接触其他类型的农场动物显示出类似的效果大小，但未达到统计学意义（模型3中的aHR 1.30，95% CI 0.86至1.96）。
与宠物暴露相反，农场动物首次接触年龄与RA风险无关。
为进一步评估早期农场暴露的影响，我们评估了牛密度评分。与低暴露（评分0-1）的参与者相比，高暴露（评分2-3）的参与者显示出类似但无统计学意义的RA风险增加（模型3中的aHR 1.23，95% CI 0.92至1.64），与直接农场动物暴露的发现一致。
分层分析
按吸烟状态（曾经/从不）分层的探索性分析见表3和在线补充图4。由于亚组中RA病例数量有限，应谨慎解释这些结果。
敏感性分析仅限于Q7时无RA的女性（附加2年和5年滞后）得出与主要分析一致的结果（见在线补充表4）。
讨论
本研究旨在评估儿童期暴露于动物和/或农业生活方式对成年后患RA风险的影响，基于一大群法国女性的大型前瞻性队列。我们的数据表明，非常早期的宠物暴露（1-2岁）存在反向关联，对未测量混杂因素具有中等稳健性；估计不精确（n=16）。儿童期接触农场动物可能与RA风险增加相关。总体而言，宠物暴露信号仅限于1-2岁年龄段，可能反映偶然发现，鉴于其他年龄段无关联，或者如果得到证实，可能表明免疫发育存在关键窗口期。下面，我们结合现有证据和潜在机制讨论这些发现。
据我们所知，这是第一项在前瞻性环境中同时考察宠物和农场动物暴露的研究，考虑了众多潜在混杂因素以及暴露年龄。宠物与RA的关系仅在两项病例对照研究中探讨过，两者均报告先前接触宠物的患者RA几率更高。Gottlieb等人发现，RA风险与RA发作前5年内接触狗、猫或鸟类相关（平均诊断年龄：40岁）。Bond等人报告，青春期前接触猫与RA风险之间存在特别强烈的关联（OR=4.92（2.71–8.97）），特别是在密切接触情况下（例如，玩耍、拥抱、清洁、舔舐或共睡）。有趣的是，未发现与其他宠物（如狗或豚鼠）有此类关联。结果表明，宠物暴露在不同年龄和与动物互动方式下对人们的影响不同。差异也可能反映研究设计（病例对照vs队列）、回忆偏倚和混杂因素控制以及人口统计学差异，因为我们的研究仅包括女性。重要的是，我们的前瞻性设计限制了回忆偏倚风险，并允许调整许多潜在混杂因素。
我们的发现可结合健康和疾病的发育起源假说来考虑，该假说认为生命早期关键发育时期（特别是产前时期和幼儿期）的环境条件可能对健康和日后慢性疾病风险产生持久影响。过敏和免疫学研究支持这一概念，表明生命早期接触环境过敏原和微生物群可能影响免疫系统成熟和疾病易感性。例如，花生脱敏研究表明，在1-2岁期间引入花生消费比在较大年龄时能产生更高的缓解率，对过敏儿童而言，以及儿童早期农场暴露与哮喘和过敏风险降低相关。这些发现支持早期微生物暴露可能促进长期免疫韧性的假设。
在RA背景下，我们可以假设生命早期接触宠物（及其微生物群）可能促进免疫耐受。事实上，研究表明，狗和猫改变了家庭灰尘微生物组的组成，引入了可能影响免疫发育的各种细菌、真菌和病毒物种。免疫印记可能因细胞谱系而异，一些成分（如B细胞）在数月内成熟，而其他成分（如T细胞）则需要更长时间发育，这可能解释了1-2岁期间暴露影响更大的原因。然而，我们的分析侧重于首次暴露年龄，而非持续时间或强度，1-2岁的窗口期可能对应于免疫成熟的临界期。合并<2年分析产生了零结果，与真实效应的稀释（如果只有1-2岁窗口期重要）或小分层中的偶然发现一致。鉴于本研究的探索性质，需要在具有更精细暴露时间和客观指标的更大队列中进行复制。
相比之下，儿童期接触农场动物（牛、猪、羊）或高牛密度区域与RA风险适度增加相关，HRs始终在1.3左右，尽管统计学显著性并非总是达到。Bond等人也报告了与儿童期接触牛和羊相关的RA几率非显著增加（ORs分别为1.35和1.24），但他们的研究功效有限（114例RA病例）。在其他自身免疫疾病（如肉芽肿性多血管炎）中，已报告与农业环境的类似关联。这可能与农场灰尘的免疫学影响有关，农场灰尘富含微生物和真菌成分，通过Toll样受体激活先天免疫信号。与宠物相关的微生物暴露可能在强度和组成上不同，可能导致不同的免疫编程轨迹。
鉴于越来越认识到黏膜部位（特别是肺和肠道）在RA发病机制中的作用，这些途径是相关的。农业环境中高微生物负荷的反复暴露可能刺激慢性黏膜免疫激活并破坏耐受机制。无论保护性还是有害，这些发现表明早期微生物暴露可能以不同方式影响免疫轨迹，取决于暴露的背景和强度。
我们的研究有几个优势，包括大样本量、长期随访以及对大多数病例的前瞻性设计。儿童期暴露在Q7（2002年）收集，即在队列中大多数RA诊断之前（698例中有432例在Q7之后），允许详细评估生命早期因素。我们调整了多个已确立的RA风险因素；然而，残余混杂不能完全排除。与病例对照研究不同，我们的设计降低了差异回忆偏倚的风险。尽管儿童期暴露由40-60岁的女性回顾性报告，但情感上显著的事件（如宠物拥有）通常记忆良好，并经常通过对话或家庭照片重温。对于Q7前已诊断的子集（698例中有266例），可能存在一些回忆偏倚；然而，仅限于Q7时无RA的女性的敏感性分析得出基本不变的估计，支持我们发现的稳健性。
应承认几个局限性。尽管队列总体规模大，但某些暴露亚组中的RA病例数量仍然较少，特别是在分层分析中。根据设计，队列仅包括招募时40-65岁的女性，将我们的研究限制在相对较晚发病的RA（诊断平均年龄：63.7岁），这可能限制我们发现对早发或男性RA的普遍适用性。血清学数据，包括ACPA状态，仅对非常有限的参与者子集可用。在验证研究中399名有可用医疗记录的女性中，75名（18.8%）自报RF和/或ACPA阳性。血清学信息的这种有限可用性排除了按血清状态进行稳健分层分析。为解决这一局限性，我们在所有模型中调整了吸烟（ACPA阳性的强风险因素和替代指标），并进行了按吸烟状态分层的额外分析。然而，由于功效有限和CI宽，这些分层分析应谨慎解释。最后，尽管RA诊断是自报的，但应用了多源验证过程——包括验证RA药物使用和专科医生诊断——以确保高诊断准确性。
我们的发现表明，非常早期的宠物暴露可能对RA具有保护作用，而儿童期接触农场动物可能增加风险。这些结果支持生命早期微生物暴露在塑造免疫功能和慢性疾病易感性方面的重要性。需要在其他大型前瞻性队列中进一步研究，包括男性，并纳入客观暴露和血清学数据，以更好地理解所涉及的免疫学机制。
结论
我们的研究表明，儿童期动物暴露的类型和时间都可能调节RA风险，1-2岁之间可能存在关键窗口期。生命早期宠物暴露似乎与风险降低相关，而农场动物暴露可能增加风险，可能反映了微生物环境的差异。宠物暴露观察到的年龄特异性信号在其他暴露窗口期未见，这进一步突显了其探索性质。鉴于吸烟可能的修饰作用，需要进一步分析以更好地了解其影响和可能的交互作用。需要在不同人群中进行更大的流行病学研究，结合关于动物衍生微生物组的实验研究，以阐明机制并为RA的潜在预防策略提供信息。
【全文结束】
