摘要
与年龄相关的棕色脂肪组织（BAT）功能和质量下降会导致能量和代谢稳态紊乱。酒精脱氢酶5（ADH5）是一种主要的去亚硝基化酶，可防止细胞硝基硫醇氧化还原失衡，这是衰老的一个基本特征。然而，BAT中ADH5在衰老背景下的功能意义在很大程度上仍不明确。本研究旨在探究BAT ADH5在保护机体免受年龄相关代谢功能障碍方面的作用。我们发现，衰老促进了小鼠BAT蛋白质S-亚硝基化异常修饰并下调了ADH5表达。此外，BAT特异性ADH5缺失加速了BAT衰老以及与年龄相关的代谢稳态和认知能力下降。在机制上，我们发现衰老通过抑制热休克因子1（HSF1，一种公认的蛋白质稳态调节因子）使BAT中的Adh5失活。此外，通过药物增强HSF1活性改善了老年小鼠的BAT衰老、代谢衰退和认知功能障碍。综上所述，这些发现表明BAT HSF1-ADH5信号级联在保护机体免受年龄相关系统功能衰退方面起着关键作用。最终，阐明产热脂肪组织硝化信号的作用将为理解BAT一氧化氮生物活性与衰老背景下代谢之间的相互作用提供新的见解。
亮点
- 衰老提高了BAT中总体蛋白质S-亚硝基化水平，同时下调了ADH5表达。
- 产热脂肪组织中ADH5缺失加速BAT衰老，并加剧与年龄相关的代谢和认知功能障碍。
- BAT中HSF1激活的Adh5破坏导致与年龄相关的代谢和认知损伤。
- 针对BAT HSF1的药物靶向治疗缓解了与年龄相关的BAT衰老和系统性衰退。
1. 引言
棕色脂肪组织（BAT）通过利用细胞内和系统性脂质及葡萄糖燃料对经典非颤抖性产热至关重要。越来越多的证据表明，寿命较长的小鼠具有高度活跃的BAT，表现为质量增加和产热-代谢功能增强。在人类中，BAT库对抵抗衰老和年龄相关疾病的不利后果（如心血管疾病）的有益作用已得到证实。值得注意的是，在啮齿动物和人类中，改善BAT活性可缓解衰老介导的高血糖和高脂血症。然而，BAT质量和功能随年龄增长而下降，导致BAT代谢能力受损、年龄相关疾病发作，最终缩短寿命。因此，迫切需要了解促进年龄相关病理的多方面细胞和系统因素，以设计促进健康衰老的新疗法。
衰老的机制多种多样且复杂，涉及细胞自主以及系统和环境因素。这些包括活性氧和氮物质（ROS和RNS）产生增加与抗氧化能力下降配对、线粒体缺陷、细胞衰老和代谢功能障碍。此外，衰老和衰老细胞积累了受损蛋白质，导致蛋白质稳态破坏。尽管线粒体功能障碍、异常氧化还原网络重塑和蛋白质稳态是衰老的关键特征，也是BAT功能障碍中涉及的有害因素，但这些信号级联在BAT衰老中联系的分子机制和调节因子在很大程度上尚不清楚。
在细胞内，ROS和RNS是调节包括调节蛋白质功能在内的各种细胞过程的氧化还原介质。例如，蛋白质半胱氨酸残基的氧化还原修饰在生理学和病理学（包括衰老）中起着关键作用。在BAT中，已经证明急性产热诱导产生生理水平的线粒体ROS，通过亚磺酰化激活解偶联蛋白1（UCP1）。此外，BAT中的半胱氨酸氧化网络在幼鼠中被选择性修饰并在老年动物中丢失。过量的一氧化氮（NO）产生和由此产生的异常NO介导的蛋白质半胱氨酸亚硝基化（S-亚硝基化，SNO）引起亚硝化应激，破坏细胞功能的基本方面，包括细胞器稳态、炎症反应和代谢，所有这些在衰老过程中都会下降。然而，RNS在年龄相关BAT功能障碍中的功能意义尚未表征。酒精脱氢酶5（ADH5；也称为S-亚硝基谷胱甘肽还原酶，GSNOR）是主要的细胞去亚硝基化酶，通过催化SNOs的分解和平衡细胞内硫醇氧化还原状态来调节细胞中NO的可用性。最近，我们证明BAT ADH5可防止肥胖相关的代谢功能障碍。在这里，我们揭示了蛋白质稳态主要调节因子热休克因子1（HSF1）对BAT ADH5在衰老背景下的功能影响。我们的研究为BAT NO生物活性与衰老中蛋白质稳态和代谢功能障碍之间的联系提供了新的见解。
2. 材料与方法
2.1 纳米粘土介导的药物递送
纳米粘土（NC，Laponite XLG）购自BYK添加剂公司（TX，美国）。大鼠尾I型胶原蛋白（RatCol）和中和溶液购自Advanced Biomatrix（Carlsbad，CA，5153）。HSF1A购自Millipore（Burlington，MA，1196723-93-9）。对于胶原蛋白-NC凝胶，将850 µL冷胶原蛋白储备溶液（4.1 mg/ml）加入50 µL纳米粘土储备溶液（10 mg/ml）中。对于胶原蛋白-NC-HSF1A，将50 µL纳米粘土储备溶液（10 mg/ml）与3.33 µL HSF1A混合，然后与850 µL冷胶原蛋白储备溶液（4.1 mg/ml）混合。所有凝胶均补充90 µL中和缓冲液，并在皮下注射前保持在冰上。
基于HSF1A的结构，通过UV-Vis光谱法确定浓度。首先，通过测量不同浓度HSF1A在PBS中的UV-Vis光谱（1.25、2.5、5、10、20 µM）获得标准曲线。由此，在207 nm和284 nm处生成两条标准曲线。接下来，制备两种含有或不含纳米粘土的胶原蛋白凝胶以研究释放曲线。简而言之，将50 µL DI水（用于Col-HSF1A）或纳米粘土储备溶液（用于Col-NC-HSF1A）与3.33 µL HSF1A混合，并将混合物加入850 µL冷胶原蛋白溶液并用移液器充分混合。然后加入90 µL中和缓冲液并用移液器混合。最后，将混合溶液分成3份，置于37°C下30分钟。凝胶化后，每个试管中加入1 mL新鲜PBS缓冲液以释放HSF1A。在每个时间点（1、5、9、14、21天），收集每个试管中的PBS缓冲液进行UV-Vis光谱分析。
2.2 小鼠模型
动物护理和实验程序均获得爱荷华大学机构动物护理和使用委员会的批准。动物接受符合《实验动物护理和使用指南》（国家科学院出版社，2011年）和国家医学研究协会制定的实验动物护理原则的人道护理。C57BL/6J小鼠（Jackson实验室，000664）、UCP1-cre（Jackson实验室，B6.FVB- Tg(UCP1-cre)1Evdr/J，024670）和Adh5fl小鼠在12小时光/暗循环中饲养。在9-11个月大时，以1 mM/小鼠或0.2 mg/kg的剂量在肩胛间区给予NC-胶原蛋白或NC-HSF1A。对于间接热量测定分析，将12个月大的小鼠单独饲养在环境舱中，处于12小时光照循环中（Metabowl；Jencons Scientific）。小鼠在笼中可自由获取标准2920X Teklad全球饮食和水。所有组织均收获、在液氮中冷冻，并保存在-80°C直至处理。
2.3 BAT外植体处理
对于HSF1抑制，将来自WT小鼠的BAT外植体暴露于2 µM KRIBB11（Sigma，385770）24小时。对于HSF1激活，外植体用HSF1A（20 µM）处理24小时。所有组织均收获、在液氮中冷冻，并保存在-80°C直至处理。
2.4 定量实时RT-PCR
使用TRIzol试剂（Invitrogen，15-596-018）分离总RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，1708890）将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green（Invitrogen，KCQS00）进行定量实时RT-PCR分析。引物序列见表S1。
2.5 染色质免疫沉淀（ChIP）分析
使用SimpleChIP酶染色质IP试剂盒（Cell Signaling Technology，9003）进行染色质免疫沉淀分析，并进行一些修改。简而言之，用1%甲醛（Sigma-Aldrich，F8775）交联BAT，然后通过用含0.125 M甘氨酸（americanBio，AB00730-10,000）和蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，P8849）的冰冻PBS（Gibco，14,190,144）洗涤停止反应。然后分离细胞核，并用与抗-IgG（Cell Signaling Technology，2729）和抗-HSF1（Cell Signaling，D3L8I，12972）偶联的蛋白A/G磁珠（Thermo Fisher Scientific，88,802）在4°C下过夜免疫沉淀染色质。从珠子中洗脱DNA并进行PCR分析。ChIP分析中使用的引物为小鼠Adh5正向：-1735至-1716；TGCTCCTACTCTCTCTCCCC；小鼠Adh5反向：-1645至-1624；AGCCCTTTTGTTCCTTTTCACA。
2.6 蛋白质印迹分析
如前所述，从BAT中提取蛋白质并进行SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳。将膜与抗-CoxI（Santa Cruz，H-1，sc-166573）、抗-CoxII（Santa Cruz，H-3，sc-376861）、抗-CoxIII（Santa Cruz，N-20，sc-23986）、抗-CoxIV（Santa Cruz，C-20，sc-23982）或抗-Cox5a（Santa Cruz，(A-5)，sc-376907）抗体在1:1000稀释度下孵育，然后与适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗（1:5000，Santa Cruz，sc-2005或1:5000，Cell Signaling Technology，7074S）孵育。使用ChemiDoc Touch成像系统（Bio-Rad）检测信号，并使用Image Lab软件（Bio-Rad）对蛋白质印迹图像进行密度测定分析。
2.7 S-亚硝基化检测
原位S-亚硝基化蛋白质检测：按照描述进行检测，稍作修改。简而言之，用3.5%甲醛固定冷冻BAT切片，然后用含1 mM EDTA和0.1mM新铜试剂的0.1% Triton X-100在PBS中通透。首先用含20 mM MMTS的HENS缓冲液在室温下阻断游离硫醇30分钟进行生物素-转换检测。然后在含0.4 mM生物素-HPDP和10 mM抗坏血酸的HENS缓冲液中将S-亚硝基化蛋白质标记1小时。使用与Alexa 488偶联的链霉亲和素（ThermoFisher Scientific，A32731）标记生物素化蛋白质。使用Zeiss 700共聚焦或Leica荧光显微镜观察图像，并使用ImarisColoc（Bitplane）进行量化。
S-亚硝基化蛋白质检测：使用S-亚硝基化蛋白质检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific）检测BAT中的总S-亚硝基化蛋白质。简而言之，用HEN缓冲液裂解BAT，每个样品使用500 µg蛋白质。首先在50°C下用MMTS阻断游离半胱氨酸20分钟。随后，使用4倍体积的冷丙酮在-20°C下沉淀60分钟，在室温下在20 mM抗坏血酸存在下用碘TMT试剂选择性地标记S-亚硝基化半胱氨酸2小时。然后通过SDS-PAGE分离样品，并将膜印迹用于通过抗-TMT抗体检测SNO蛋白质。
2.8 免疫组织化学、免疫荧光和ELISA
对于免疫组织化学，将iBAT或iWAT库用4% PFA固定并切成5 μm厚，然后进行脱蜡和再水化过程。使用H&E染色组织切片。在Nikon显微镜（10x）下观察图像。对于免疫荧光（IF），切片封闭后在4°C下与适当抗体（包括F4/80（Cell Signaling，D4C8V，30325）、p16 INK4A（Cell Signaling，E6N8P，18769）和HSF1（Cell Signaling，D3L8I，12972）在1:100下孵育过夜，然后在室温下与抗兔（Cell Signaling，7074）孵育一小时（1:2000）。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（1:2500，DAPI）染色细胞核。使用LSM 880共聚焦显微镜（Carl Zeiss）拍摄图像，并使用NIH ImageJ进行分析。
对于IL 1β测量，通过Bio-Rad Laboratories Bio-plex Pro Mouse Cytokine 23-Plex进行多重细胞因子分析，按照制造商的说明进行血浆细胞因子分析。在爱荷华大学流式细胞术核心设施中，使用Bio-Rad Laboratories Bio-Plex（Luminex 200）分析仪分析样品。
2.9 透射电子显微镜（TEM）
取出棕色脂肪组织并切成约1 mm³的立方体。所有电子显微镜（EM）相关试剂均来自电子显微镜科学。样品在2.5%戊二醛和4%甲醛二甲胂酸盐缓冲液中固定过夜（16小时）在4°C。组织用新鲜1% OsO4后固定1小时，用梯度酒精系列脱水，然后用环氧丙烷，如前所述嵌入Epon树脂中。用玻璃刀修整树脂块，用金刚石刀切成超薄（50-70 nm）切片，并安装在甲酸盐包被的铜网上。用2%醋酸铀和柠檬酸铅双重对比染色网格。通过Hitachi HT7800透射电子显微镜捕获图像。使用ImageJ确定细胞面积。
2.10 Barnes迷宫和转棒研究
Barnes迷宫测试在直径为91cm的圆形表面上进行，边缘等距分布5cm直径的孔（Noldus）。逃生室随机放置在一个孔下，并在整个训练过程中保持原位。迷宫周围用带有四个视觉标记的白布包围，迷宫上方放置一盏灯。每只小鼠训练四天，每天四次试验。对于在3分钟内未找到逃生室的小鼠，将其引导至有逃生室的孔。使用Ethovision XT 11.5视频跟踪软件（Noldus）测量基于空间线索的短期和长期记忆，并通过手动跟踪确认。在Rotamex-5转棒（Columbus Instruments）上进行转棒测试后。转棒以5 rpm旋转，测量在完全跌落前在棒上的时间，间隔规律，最大60秒。
2.11 代谢表型分析
全身能量消耗、身体成分和葡萄糖耐量：使用综合实验室动物监测系统（CLAMS，Columbus Instruments）在兄弟会鹰代谢表型核心监测全身能量消耗（VO2，VCO2）、食物摄入量和运动活动。使用Bruker Minispecs（LF50）测量身体成分。对于葡萄糖耐量测试，动物在GTT前禁食16小时。通过腹腔注射（IP）葡萄糖注射（0.8-1.25 g/kg体重，50%葡萄糖，Hospra Inc，0409-6648-02）后在不同时间点测量葡萄糖浓度来测试葡萄糖耐量。
2.12 超声心动图
在爱荷华大学心脏病学动物表型核心实验室中，使用VisualSonics成像系统和30 Mhz换能器对清醒小鼠进行经胸超声心动图检查。超声心动图检查者对动物的治疗和遗传背景不知情。获取与二尖瓣平面平行的短轴图像，以获得包括乳头肌在内的左心室最大横截面图像。垂直于二尖瓣平面获取长轴视图，当舒张期心尖到基底长度最长且包括主动脉瓣和升主动脉时，视为最佳。
2.13 代谢组学分析
组织样品：将整个BAT组织在冰冻提取缓冲液中均质化，缓冲液含2部分甲醇、2部分乙腈、1部分水和内标（Cambridge Isotope Laboratories）。样品在-20°C下旋转一小时，然后离心（10分钟，21,000 x g）。将150 µl澄清提取物转移到自动进样瓶中并在真空浓缩器（Thermo SpeedVac）中真空干燥。然后将样品在30 µl甲氧胺（MOX，11.4 mg/ml）中在无水吡啶中重新溶解，涡旋5分钟，并在60°C下加热一小时。向每个样品中加入20 µl N，O-双（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（TMS），然后涡旋一分钟，并在60°C下加热30分钟。
GC-MS方法：分析衍生化样品。将1 μl衍生化样品注入装有TraceGold TG-5SilMS柱（Thermo）的Trace 1300 GC（Thermo）中，操作条件如下：分流比= 20:1，分流流量= 24 μl/min，吹扫流量= 5 ml/min，载气模式=恒定流量，载气流量= 1.2 ml/min。GC炉温梯度如下：80°C保持3分钟，以20°C/min的速率升高至280°C，并在280°C保持8分钟。通过ISQ 7000质谱仪（Thermo）在EI模式（-70eV）下进行离子检测，使用选择离子监测（SIM）。
数据分析：使用TraceFinder 5.1（Thermo）分析原始数据。代谢物鉴定和注释需要至少两个离子（目标+确认）和与参考标准先前在内部确定的离子和保留时间相对应的唯一保留时间。在衍生化前生成的汇集样品在分析运行开始时、期间以设定间隔以及结束时进行分析，以使用NOREVA工具校正峰值强度。然后将NOREVA校正数据归一化为每个样品的总信号，以控制提取、衍生化和/或加载效果。
2.14 定量和统计分析
结果表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）；n表示个体小鼠的数量（生物重复）或个体实验（技术重复），如图例中所示。我们在样本量相对较大（n>5）的实验中执行了Shapiro-Wilk正态性测试，发现这些数据通过了正态性测试（alpha=0.05）。使用双尾Student's和Welch's t-检验对两组比较或ANOVA进行多组比较的进一步分析。对于单向ANOVA和双向ANOVA，应用Tukey的事后多组比较，如Prism所推荐。在所有情况下，使用GraphPad Prism（GraphPad Software Prism 8）进行计算。
3. 结果
3.1 衰老提高产热脂肪蛋白质S-亚硝基化
为了研究硝化信号在衰老背景下BAT中的病理生理相关性，我们检查了年轻（3和6个月）和老年小鼠（12和22个月）雄性C57BL/6J小鼠BAT中的一般蛋白质SNO状态。使用免疫荧光（IF）和基于碘TMT的S-亚硝基化（SNO）分析，我们发现与年轻小鼠相比，老年动物的BAT-SNO总体蛋白质增加。蛋白质S-亚硝基化受一氧化氮合酶（NOS）介导的NO生成和细胞去亚硝基化的调控，后者由主要的去亚硝基化酶酒精脱氢酶5（ADH5；也称为S-亚硝基谷胱甘肽还原酶）严格控制。在这里，我们发现衰老在BAT和腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中下调了Adh5。
为了确定BAT-ADH5在衰老背景下的功能作用，我们接下来通过将Adh5fl/fl小鼠（在C57BL/6J背景下）与Ucp1-Cre转基因小鼠系杂交，生成了BAT ADH5敲除（Adh5BKO）小鼠。与年龄相关的衰退的主要驱动因素之一是细胞衰老的诱导，其特征是细胞周期抑制剂（如p16INK4a和Cdkn1a(p21)）以及衰老相关分泌表型（SASP）标记物（例如，Il6和Sesn1）的诱导。如图1E所示，与Adh5fl小鼠相比，BAT-ADH5缺失在3个月大时增加了衰老标志物。值得注意的是，年轻Adh5BKO小鼠BAT中的衰老标志物水平与老年野生型小鼠相当。一致地，IF分析和衰老相关β-半乳糖苷酶（β gal）染色显示Adh5BKO小鼠中p16Ink4a增加，与其同年龄匹配的对照小鼠相比（图1F）。总之，这些数据表明衰老与BAT ADH5介导的一氧化氮活性异常相关，而AHD5的缺失加速了BAT衰老。
3.2 BAT ADH5缺失加剧年龄相关功能衰退
脂肪库的重新分布是衰老的关键特征。一致地，我们发现年龄相关体重增加，而BAT ADH5缺失加速了年龄相关脂肪增多和瘦体重损失。BAT对维持全身能量消耗和葡萄糖稳态至关重要。因此，我们接下来确定了BAT-ADH5缺失对年轻（3个月）和老年小鼠（12个月）系统能量和代谢稳态的影响。使用间接热量测定评估的代谢谱显示，与同年龄匹配的对照相比，12个月大的Adh5BKO小鼠的热量和氧气消耗减少。这些系统能量平衡结果进一步得到了年轻和老年BAT-ADH5缺陷小鼠葡萄糖耐受不良的支持。值得注意的是，3个月大Adh5BKO小鼠的葡萄糖不耐受与12个月野生型小鼠相当，表明BAT Adh5缺失的小鼠可能加速了年龄相关的代谢功能下降。
衰老降低了肌肉质量、力量和下肢表现。我们接下来比较了老年Adh5BKO小鼠与对照小鼠的传感器运动变化。如图2G和H所示，BAT中ADH5缺失显著降低了19个月大老鼠的抓握力和运动表现。衰老是一个与进行性认知障碍相关的复杂过程。为了回答BAT ADH5缺失是否以及在多大程度上改变小鼠神经功能，我们接下来在老年Adh5BKO小鼠及其对照小鼠中进行了Barnes迷宫测试。与对照相比，Adh5BKO小鼠表现出降低的速度（图2I）、空间学习和短期记忆（目标区域内的频率降低和初级错误增加）（图2J和K）。衰老是心脏功能障碍的主要风险因素，而BAT可以防止与年龄相关的疾病，如心血管疾病。超声心动图显示，22个月大Adh5BKO小鼠的心脏质量和左心室厚度比同年龄匹配的对照增加。总之，这些数据表明BAT ADH5对于维持衰老过程中的代谢、运动、认知和心脏功能是必需的。
3.3 BAT ADH5缺失加剧年龄相关炎症和线粒体缺陷
衰老的特征是慢性低度系统性炎症以及先天和适应性免疫的破坏。我们发现BAT特异性Adh5缺失增加了年轻Adh5BKO小鼠BAT的SVF和血清ILIZI1β中的促炎标志物，与Adh5fl小鼠相比（图3A和B）。为了确定衰老对ADH5调控的BAT炎症的影响，我们接下来测量了老年Adh5BKO和Adh5fl小鼠BAT中F4/80的表达。如图3C所示，BAT-ADH5缺失增加了年轻和老年小鼠中F4/80阳性细胞的浸润。位于iWAT中的米色脂肪细胞通过β3-肾上腺素受体刺激被激活，导致褐变。我们还发现，与同年龄匹配的对照相比，年轻和老年Adh5BKO小鼠的iWAT中F4/80阳性细胞浸润增加（图3D）。总之，这些数据暗示ADH5缺陷的产热脂肪细胞加速了"炎症衰老"。
先前，我们证明BAT-ADH5缺失会损害小鼠在冷和高脂饮食挑战下BAT的线粒体呼吸。在这里，我们发现BAT-ADH5缺失降低了氧化磷酸化复合物I、III和IV的表达——线粒体电子传递链（ETC）的关键成分（图3E和F）。使用透射电子显微镜（TEM）分析的进一步评估显示，与对照相比，Adh5BKO小鼠BAT中的线粒体较小且嵴形态异常（图3G和H）。为了确定ADH5缺失对BAT代谢稳态的影响，我们接下来使用气相色谱-质谱法（GC-MS）对同年龄匹配的Adh5BKO和Adh5fl小鼠的BAT进行了稳态代谢组学分析。如图3I所示，BAT ADH5缺失显著降低了年轻小鼠BAT中的糖酵解代谢物和TCA循环中间体，并提高了支链氨基酸（BCAAs）水平。总之，这些数据表明BAT ADH5对于维持线粒体形态和代谢功能是必需的。
3.4 BAT-HSF1激活改善年龄相关结果
HSF1是热休克反应（HSR）的主要调节因子，这是一种对多种刺激的高度保守的生理应激反应。我们先前表明肥胖会抑制BAT HSF1和HSF1诱导的ADH5表达。在这里，我们发现衰老从6个月大开始在转录和蛋白质水平上下调BAT HSF1（图4A和B）。染色质免疫沉淀（ChIP）分析进一步证实HSF1与Adh5启动子结合，这通过药理学HSF1激活剂HSF1A增加（图4C）。一致地，HSF1的药理学激活（HSF1A）或抑制（KRIBB11）显著增加了或减少了BAT Adh5。
为了建立BAT HSF1-ADH5轴在衰老背景下的功能影响，我们利用纳米粘土（纳米硅酸盐，NS/NC）介导的药物载体系统，确保最佳的药物释放效率、生物相容性和生物降解性。纳米粘土矿物材料具有药物递送所需的优异物理化学特性。在这里，胶原蛋白被用作NC介导的HSF1A或载体递送的支架。如图5A所示，与胶原蛋白-HSF1A组相比，胶原蛋白-NC-HSF1A有效地持续释放化合物。因此，将胶原蛋白-NC-载体或胶原蛋白-NC-HSF1A制剂注射到老年小鼠的BAT中。我们发现，注射后一个月，HSF1的激活显著改善了年龄相关的系统能量不平衡（图5B和C）和葡萄糖不耐受（图5D）。此外，这些代谢改善与缓解的年龄相关认知功能障碍、BAT形态以及衰老和炎症标志物的表达相关（图5E-J）。总之，这些数据支持BAT-HSF1信号在改善年龄相关功能衰退中的生理相关性。
4. 讨论
衰老与产热脂肪组织功能和质量的下降相关，这导致能量和代谢稳态的破坏以及代谢疾病的流行。目前，已有几种机制被牵涉到年龄依赖性BAT衰退中，包括线粒体功能障碍、异常蛋白质稳态、炎症和褐变缺陷。在这里，我们提供了第一个证据和机制，说明硝化信号如何在衰老背景下将蛋白质稳态与产热脂肪组织中的代谢功能联系起来。
在人类中，异常的一氧化氮生物活性已被牵涉到包括衰老在内的多种生理学中。已经证明，衰老显著改变了BAT细胞内谷胱甘肽平衡和系统血浆氮/精氨酸特征，这些都是硝化信号级联的关键组成部分。值得注意的是，在人类中，约60%与衰老显著相关的血浆蛋白质是S-亚硝基化的。具体来说，在BAT中，超过15%的蛋白质半胱氨酸受到氧化修饰，调节BAT生理学。然而，BAT硝化信号在衰老中的功能意义尚未确定。在这里，我们证明了ADH5与衰老诱导的BAT蛋白质S-亚硝基化总体水平呈负相关，这与先前证明ADH5在衰老中相关性的研究一致。例如，最近的研究表明，AHD5在DNA损伤修复和染色质结构中起着关键作用，这种调节的丧失会导致多系统疾病和癌症进展。此外，全基因组分析将包含ADH5的基因簇与人类长寿联系起来。最后，寿命的变化与衰老小鼠胚胎成纤维细胞、神经元和老年人外周血单核细胞中的Adh5呈负相关。我们发现，有缺陷的ADH5调控的S-亚硝基化信号加速了BAT衰老。未来的研究需要阐明ADH5对BAT中细胞衰老网络的直接作用。
先前已证明，具有生殖系ADH5缺失的小鼠表现出加速衰老表型，包括免疫反应降低、内毒素休克时发病率增加、胰岛素抵抗、骨骼肌萎缩以及大脑皮层中蛋白质聚集体的积累，这些与运动障碍相关。系统地，我们表明与同年龄匹配的对照相比，BAT ADH5缺失的小鼠在老年小鼠中表现出体重增加、脂肪量增加和炎症增加。这些加剧的年龄发展代谢缺陷伴随着传感器运动和认知功能的恶化。这些结果与先前的研究一致，表明ADH5介导的蛋白质S-亚硝基化失调会损害心脏和大脑中的线粒体功能，以及衰老背景下的线粒体动力学。此外，在细胞水平上，我们发现BAT ADH5缺乏降低了ETC复合物的表达并破坏了线粒体形态，这与BAT支链氨基酸（BCAA）水平升高相关，表明Adh5BKO小鼠中BAT燃料利用可能存在潜在缺陷。研究表明，乳酸和BCAA衍生代谢物控制BAT线粒体氧化还原稳态，进而对维持BAT代谢功能起着关键作用。有趣的是，最近在人类中的研究表明BCAAs与长寿呈负相关。此外，在啮齿动物中，脂肪组织中BCAA代谢受损会促进年龄相关的代谢缺陷。最后，在人类和动物研究中，血浆BCAA水平异常是神经退行性疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）的生物标志物。探索BAT ADH5在多大程度上调节BCAA利用非常有意义。
实质细胞过度产生NO会驱动衰老相关疾病和肥胖中的免疫细胞浸润和极化。此外，异常的NO生物活性和亚硝化应激调节转录因子活性，直接调控炎症和脂肪生成特征。我们发现BAT中Adh5的缺失增加了BAs中NO的产生，并增加了BAs和SVF中的促炎基因，表明来自Adh5缺陷BAs的过量NO可能作为诱导促炎介质表达和免疫细胞激活的信号，导致BAT线粒体功能受损。
众所周知，热休克因子1（HSF1）的表达和活性在衰老的人类细胞中下降，从而加剧蛋白质稳态崩溃和衰老过程。事实上，HSF1缺陷生物体会发展出与年龄相关的神经退行性疾病，主要是由错误折叠蛋白质聚集体的积累引起的。然而，包括发育缺陷和炎症细胞因子表达增加在内的多种异常的机制尚不清楚。在全身HSF1 KO小鼠中，HSF1缺失导致冷不耐受和棕色及米色功能障碍。值得注意的是，HSF1在产热脂肪细胞中更为丰富，恢复BAT中的HSF1可防止与肥胖相关的BAT功能障碍。在这里，我们表明年龄依赖性HSF1-Adh5信号级联的损伤导致BAT代谢稳态的破坏。相反，使用新型纳米粘土介导的药物递送系统激活HSF1改善了年龄相关的细胞和系统衰退。尽管驱动年龄抑制HSF1的因素尚不清楚，且对未来研究非常感兴趣，但我们的研究表明了一种对抗衰老背景下产热脂肪衰退的新策略。我们认识到硝化信号广泛影响细胞信号级联，BAT的功能受多种转录和信号程序、神经张力以及内分泌因素的调控。因此，我们不能排除Adh5对BAT线粒体动力学和燃料利用的影响可能是由于其他细胞功能的破坏而引起的可能性。在未来的研究中，我们将检查Adh5缺失对其他细胞器功能（如内质网和溶酶体）的影响。
总之，我们提供了NO生物活性调控BAT免疫-代谢稳态的第一个证据，以及硝化信号将蛋白质稳态与产热脂肪组织中代谢功能联系起来的新机制。此外，我们强调了一种新的抗衰老策略，以对抗年龄相关的细胞氧化还原失衡。最终，这项研究将为开发缓解年龄依赖性产热脂肪细胞功能丧失和促进健康衰老的新治疗策略提供新途径。
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