摘要
引言 越来越多的证据表明中枢和外周炎症在包括路易体痴呆(DLB)和阿尔茨海默病(AD)在内的所有神经退行性疾病中都起着关键作用。这些疾病中观察到的免疫系统改变可能在临床和认知症状出现之前很久就已发生；然而，炎症在神经退行性疾病发病机制中的确切时间和作用仍不清楚。迄今为止的研究结果存在矛盾，大多数工作集中在AD而非其他痴呆症上，且大多数研究来自单个站点和横断面研究。通过使用质谱流式细胞术纵向检查外周免疫系统的详细表型，早期认知障碍免疫特征分析研究旨在揭示早期AD和DLB中的特定免疫特征，这些特征如何随时间变化，以及它们如何与疾病进展和认知变化相关联。
方法与分析 将从轻度认知障碍(MCI)或早期路易体痴呆或阿尔茨海默病患者(MCI-LB和DLB；MCI-AD和AD)以及健康对照者中收集血液、脑脊液、唾液和尿液样本。通过质谱流式细胞术进行免疫表型分析，将为这些组别识别详细的免疫指纹。我们将评估哪些关键免疫细胞簇组合可预测疾病表型、认知下降和向痴呆症的进展。样本还将使用新技术评估变性病理和炎症标志物。
伦理与传播 本研究已获得普雷斯顿西北研究伦理委员会(21/NW/0314)批准，并在ISRCTN注册中心(ISRCTN62392656)注册。研究正在进行中(自2022年6月起)。基线访问正在进行中，部分参与者的随访访问已经开始。研究完成后将完成全面数据分析并提交发表。
优势与局限性
⇒纵向设计允许探索外周炎症生物标志物，并评估这些标志物如何随时间变化以及与疾病进展的关联。
⇒尖端技术：本研究使用质谱流式细胞术对免疫细胞进行分析。该技术可实现对细胞的精确定量和详细表征。
⇒同时测量中枢和外周炎症指标，可探索神经退行中外周和中枢免疫变化的相互作用。
⇒本研究将基于临床研究标准招募参与者，这意味着只有因临床原因需要生物标志物检测的参与者才会在研究开始时拥有这些检测；然而，这将更好地反映更真实的记忆门诊人群。
⇒本研究没有神经影像学部分；虽然这扩大了可及性并符合向血液生物标志物转变的趋势，但它不会导致炎症标志物和神经影像学发现之间的直接关联。
引言
背景
据估计，英国有94.4万人患有痴呆症，这是英国和许多其他国家的主要死因。阿尔茨海默病(AD)和路易体痴呆(LBD)是导致痴呆的两种最常见疾病，在65岁以上人群中分别约占痴呆病例的55%和20%。虽然特定的神经退行性疾病在临床上表现为定义明确的特征症状，但近期研究揭示了不同神经退行性疾病之间既独特又重叠的病理过程越来越多。
AD是痴呆最常见的病因，其病理特征是神经间纤维状淀粉样β(Aβ)斑块和神经内错误折叠τ蛋白缠结的逐渐沉积。大脑实质内这些蛋白的积累随后导致颞叶、顶叶和枕叶区域的退化，从而表现为一系列记忆、视觉空间和语言症状。Aβ和τ蛋白的密度和分布可通过正电子发射断层扫描(PET)成像进行体内测量，并通过脑脊液(CSF)采样进行量化。目前，正在开发用于在AD背景下准确测量这些蛋白的血液生物标志物。
路易体痴呆(DLB)包含在LBD范畴内，包括DLB和帕金森病痴呆(PDD)。DLB和PDD在病理上重叠，通过症状发作的1年规则在临床上区分开来，基于认知和运动症状的时间发作。当认知症状比运动症状提前1年或更长时间时，给出DLB诊断；而当运动症状比认知症状提前1年或更长时间时，则诊断为PDD。从病理学上讲，LBD的特征是神经元内含有错误折叠α-突触核蛋白的路易体，导致包括纹状体多巴胺能神经元损失在内的皮质下神经退行性变，但内侧颞叶相对保留。DLB中可见特定的认知特征，通常包括注意力和视觉空间障碍。诊断标准包括认知波动、视觉幻觉、帕金森症状和快速眼动睡眠行为障碍的存在，支持性症状包括自主神经功能障碍和抑郁。
临床AD和DLB之前都有前驱阶段，称为轻度认知障碍(MCI)，因AD/LB而致(MCI-AD/MCI-LB)，具有已发表的标准研究标准。
尽管是不同的疾病，AD和DLB在病因学上有重叠方面，包括血管变化、混合病理和神经炎症。越来越多的证据表明神经炎症是包括痴呆在内的几种神经退行性疾病的关键病理生理过程。流行病学研究证明了长期使用抗炎药(如非甾体抗炎药)的保护作用，而全基因组关联研究已确定了包括白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、髓系细胞表达的触发受体2(TREM2)和几丁质酶-3-样蛋白1(YKL40)在内的几种炎症信号通路中的多态性，以及其他小胶质细胞风险基因。病理学上，小胶质细胞激活增加和转录改变是神经退行性疾病尸检中的常见特征。通过PET成像测量的神经炎症已被发现在MCI-AD和轻度DLB参与者中比对照组增加；在AD中，TSPO结合与大脑网络功能障碍和未来认知下降相关。还假设了小胶质细胞及其在AD病程中的激活的动态作用。此外，外周炎症标志物指向炎症在神经退行性变中的作用。例如，血液血浆中高水平的C反应蛋白与记忆和视觉空间障碍风险增加相关，血浆TNF-α与脑容量呈负相关，胶质纤维酸性蛋白在MCI-AD和LBD中升高。这些研究共同表明免疫系统在许多神经退行性疾病中起着关键作用，突显神经炎症可能既是早期疾病标志物又是AD和DLB的治疗靶点。旨在靶向免疫系统的早期治疗研究在临床前研究中显示出有希望的结果，尽管最初的早期临床试验未显示疗效，但有广泛的更针对性的免疫调节药物正在进行临床试验。迫切需要稳健且与临床相关的早期疾病阶段免疫生物标志物，以确保这些试验的未来成功。
此前为识别神经退行性疾病中外周炎症生物标志物所做的大量工作集中在细胞因子上，无论是在CSF还是血液中。虽然荟萃分析已经突显出痴呆患者和对照者之间外周细胞因子浓度的显著差异，但个别研究显示不一致的结果，这些结果并未明确将生物标志物与临床表型联系起来。例如，一项研究发现DLB参与者的CSF白细胞介素(IL)-6浓度低于AD参与者和对照组，而其他研究发现DLB参与者的外周IL-6水平高于对照组，而另一项研究观察到DLB、AD或对照组之间CSF IL-6(或IL-1β)没有差异。还报道了DLB和AD中外周IL-6或其他细胞因子在疾病组参与者和对照组之间没有可观察到的差异。在DLB和AD中，较高的外周IL-6水平与更差的认知表现相关，而TNF-α浓度与DLB中神经精神症状的严重程度相关。当比较中枢和外周免疫标志物时，由于血脑屏障阻碍了细胞因子的自由交换以及神经免疫学小生境的特殊性质，进一步的挑战出现了，先前观察到中枢和外周炎症之间缺乏关系。
具有不同的病理，AD、DLB和其他神经退行性疾病可能具有特定的外周免疫特征。事实上，在CSF中，IL-8在AD中比对照组高，在对照组和DLB之间没有差异。此外，在AD中，CSF中YKL40的浓度增加，但在DLB或MCI-LB参与者中与对照组相比并未升高，而可溶性TREM2和颗粒蛋白原在DLB中并未升高，除非这些个体中共存AD病理。一个混杂因素是免疫系统沿疾病轨迹的动态性质。例如，King及其同事证明MCI-LB或MCI-AD参与者的血浆IL-1β、IL-2、IL-4和IL-10水平显著高于对照组、DLB和AD痴呆组，而TNF-α浓度则较低。此外，在同一组参与者中，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10和INF-γ的纵向下降与认知表现的恶化相关。尽管纵向研究很少，但这些与疾病进展相关的促炎和抗炎标志物随时间的变化使理解潜在疾病机制的能力复杂化，因此，细胞因子作为准确生物标志物的效用也受到影响。
基于流式细胞术的细胞因子产生白细胞在AD、DLB及其前驱对应物中的免疫表型分析是表征与疾病指标相关的免疫系统差异的另一种流行方式。表征患者来源的外周血单个核细胞(PBMCs)的横断面研究产生了更丰富的疾病状态下免疫系统变化特征。此前的大部分研究集中在AD背景下的流式细胞术表征。例如，AD研究显示CD8+T细胞和CD4+CD28记忆T细胞增加，而CD4+CD28+CD27+幼稚T细胞与对照组相比减少。然而，Amin及其同事发现，与AD患者相比，DLB患者表现出CD4+辅助T细胞和CD19+HLA-DR+活化B细胞比例降低，进一步突显了AD和DLB之间的差异。与对照参与者相比，MCI个体也表现出CD4+T细胞浓度增加。与对照和MCI参与者相比，AD中的循环髓系树突状细胞减少，尽管后来转化为AD的MCI受试者表现出髓系树突状细胞的显著下降，与转化为痴呆平行。此外，较高的CD56+CD3+自然杀伤T细胞浓度与更大的疾病严重程度和测试中更差的认知表现相关，而活化的CD8+T细胞水平与弥散张量成像测量的海马旁微结构组织损伤相关。有趣的是，更高的CD4+调节性T细胞(Treg)和总体CD3+T细胞数量独立地与简易精神状态检查(MMSE)上的表现呈正相关，表明更好的表现。Treg水平与认知之间的正相关关系通过在MCI患者中看到的Treg比例高于AD患者而得到突显，进一步突显了疾病进展过程中免疫系统的波动。此外，在Aβ阳性的MCI参与者中，与Aβ阴性、认知正常的参与者相比，循环髓系和树突状细胞水平增加，而无论认知状态如何，CD3+T细胞在Aβ阳性参与者中均增加。由于技术挑战，很少有研究探索AD/DLB中的中性粒细胞，一项AD研究发现CD11b+中性粒细胞增加，这与疾病严重程度相关。尽管需要更大的澄清，但外周免疫细胞的评估可能有助于区分神经退行性疾病，如AD和DLB及其前驱形式，这将提高诊断准确性并证明对疾病分期有用。
最近开发的商用质谱流式细胞术试剂盒，用重金属抗体偶联代替传统流式细胞术中使用的荧光分子，允许在单个标准化测定中应用更多抗体探针。与传统流式细胞术相比，质谱流式细胞术可以在较小的血液体积(~250 uL对9 mL)上进行，细胞处理最少。这减少了技术伪影，并允许包括中性粒细胞以及PBMCs。这为深入表征AD和DLB等神经退行性疾病的外周免疫特征提供了更大机会。在一项使用质谱流式细胞术的横断面研究中，AD参与者增加了外周血CD8+T效应记忆CD45RA+(ERMA)细胞，这些细胞与认知表现呈负相关。对炎症的影响以及其在AD和DLB中影响的时间的理解仍然不足。因此，改进这种理解对于实现早期诊断和指导未来临床试验至关重要。通过使用质谱流式细胞术纵向检查外周免疫系统的详细表型，早期认知障碍免疫特征分析研究旨在揭示早期AD和DLB中的特定免疫特征，这些特征如何随时间变化以及它们如何与疾病进展和认知变化相关联。
方法与分析
摘要
本方案描述了一项纵向观察性研究，包括基线、标准化的临床和神经心理学评估，随后是包括血液和可选CSF的生物标志物采样；唾液和尿液也将收集用于未来的实验分析。这些基线评估将在18个月后的随访期以及尽可能长的(3年)结果确定期重复进行(图1)。
研究问题
本研究的主要目标是比较早期AD和DLB与同龄健康对照者的免疫变化进行深度免疫分析。具体研究问题如下：
- 能否在早期AD和早期DLB参与者(我们将其定义为包括前驱期和轻度痴呆)与同龄健康对照参与者之间识别出血液和CSF中免疫特征的差异？
- 这些免疫生物标志物随时间是否有纵向变化，这些变化如何与临床特征和疾病进展相关？
患者和公众参与(PPI)声明
在研究设计过程中成立了一个患者和护理人员小组，他们对协议和面向参与者的材料提供了反馈，这些反馈已被纳入研究中。这包括审查完成问卷的时间和精力以及腰椎穿刺的纳入。在研究过程中，所有参与者都会收到一份反馈问卷，以评估他们对研究的体验并为未来研究提出建议。该方案已在与NIHR剑桥生物医学研究中心相关的当地PPI活动上展示，研究参与者通过新闻通讯随时了解研究进展。
参与者、招募和选择
对于早期DLB和早期AD组，参与者将从剑桥大学医院(CUH)、剑桥和彼得伯勒NHS基金会信托以及帝国理工学院医疗NHS信托的神经病学、老年精神病学和其他相关服务的认知障碍诊所招募。我们还将寻求来自其他相关站点的转诊，并从"加入痴呆研究"(JDR)平台招募，其中参与者能够前往CUH或帝国理工学院医疗NHS信托进行生物采样。对照参与者将从愿意通过本地研究登记册和JDR参与研究的健康老年人中招募，以及从患者参与者的健康朋友和非血缘家庭成员中招募，他们也表示愿意参与。
潜在参与者将获得一份参与者信息表副本，在考虑这些材料一段时间后，将联系他们以确保其符合参与研究的资格和适宜性。然后将为那些愿意且适合参与的人安排预约，以便他们前往研究场所或由研究团队成员进行家访，以提供进一步提问的机会并获得参与者的正式书面同意。将获取参与研究和共享假名化数据和样本的同意。由于研究人群的脆弱性和研究的纵向性质，将在整个研究过程中考虑同意参与的能力。招募到本研究的临床医生和研究人员都接受了能力评估培训，能力评估将在每次研究访问时进行。将在基线研究访问时确定潜在咨询员，如果参与者在研究过程中失去能力，将遵循咨询员程序。将为所有研究访问提供旅行和餐饮补偿。
纳入标准
只要年龄超过50岁且有足够的英语能力以允许标准化认知测试，男性和女性参与者均有资格纳入。除健康对照受试者外，所有参与者必须有足够接触以完成 informant 评定量表问卷并提供参与者背景历史的可靠 informant。每个队列的DLB和AD组特定纳入标准如下所述。对于DLB队列，既往帕金森病诊断不会排除参与者，只要他们符合MCI-LB或DLB标准。将招募符合MCI标准(包括MCI-LB和MCI-AD)的参与者加入研究。尽可能对于MCI组，我们将寻求包括具有LB或AD病理生物标志物证据的人。在DLB和AD痴呆组中，我们只会包括轻度痴呆参与者，因为严重受损的参与者不太可能遵守研究方案。本研究将轻度痴呆定义为临床痴呆评定量表(CDR)为0.5或1。
排除标准
如果潜在参与者患有并发的主要精神疾病、严重身体疾病、神经系统疾病(患者组参与者的AD或DLB除外)或可能限制其充分参与研究的任何其他合并症，则将被排除。由于本研究特别感兴趣地探索血液中的炎症细胞和标志物，任何患有炎症性疾病(如类风湿关节炎)或服用免疫抑制剂(如口服类固醇)的参与者将被排除在研究之外。
队列
参与者将被招募到三个独立的队列中。为每个队列详细说明的招募目标允许研究过程中20%的脱落率。这些队列将是：
- 健康对照参与者，定义为MMSE评分>26且没有常规记忆投诉/症状或任何提示痴呆的迹象或症状的参与者。
- 早期DLB参与者包括：
- 符合MCI-LB诊断研究标准者。
- 符合轻度DLB(CDR评分为0.5或1)标准者。
- 早期AD参与者包括：
- 符合MCI-AD诊断标准者。
- 符合轻度AD痴呆(CDR评分0.5或1)诊断标准者。
方案概述
一旦提供书面知情同意，参与者将进行初步临床评估，包括收集临床和人口统计学信息(当前用药、吸烟史、饮酒量、教育史等)。此后，将进行包括神经心理学评估电池、血液采样(最多80 mL)和可选腰椎穿刺以收集CSF(最多20 mL)的基线访问。这些程序的详细信息如下所述。每位参与者将在基线访问后的18个月和3年重复这些评估。
临床评估、神经心理学电池和 informant 问卷
在所有三次研究访问中，使用表1中概述的电池进行详细的神经心理学测试和 informant 问卷。神经心理学评估电池在队列组之间保持一致，以便允许组间比较。临床和人口统计学信息的收集与神经心理学测试同时进行。
血液样本
将在基线和18个月访问期间抽取最多80 ml的血液。只要实际可行，这些采集将在早晨(上午9点至11点之间)进行，参与者处于空腹状态。血液样本将使用详细的免疫表型分析方案进行检查，该方案使用多参数质谱流式细胞术——一种在单细胞水平分析免疫系统种群动态、细胞表型和功能的强大力量。将使用用重金属离子标记的综合抗体面板来识别全血中细胞表面标志物的表型和功能，样本收集当天进行。为质谱流式细胞术准备的样本随后将被冷冻，并在质谱仪上批量获取前解冻，根据我们先前发表的方法。此过程系统地评估独特的细胞亚群和激活标志物库，以提供个人免疫景观的详细地图。在数据清洗和质量控制后，将应用生物信息学方法，对表型相似的细胞进行分层聚类和量化，用于分析管道。在参与者亚组中，将使用新鲜血液进行刺激研究，以调查属于不同疾病组的细胞在免疫挑战后产生的蛋白质和代谢物。将进行常规实验室血液检查以检查凝血因子，确保安全性和CSF通过可选腰椎穿刺采集的资格。PBMCs将被收集并储存在液氮中用于未来的验证分析。剩余血液将被离心以产生血清和血浆样本，储存在-80°C用于未来对炎症和神经退行性标志物的进一步测试，而剩余细胞将被储存用于未来的遗传和转录分析。
CSF样本
CSF的可选收集预计约20-25%的参与者会同意。在获得知情同意后，将通过腰椎穿刺收集最多20 ml的参与者CSF。如果CSF收集作为NHS诊断的一部分进行，并且人们符合资格并同意参加本研究，为了避免需要第二次腰椎穿刺，将在NHS腰椎穿刺时收集最多10 ml的CSF并储存用于研究目的。腰椎穿刺是可选的，将向参与者提供有关该程序的详细书面信息。所有参与者将与将进行个体安全评估的临床医生讨论该程序。该人群腰椎穿刺的安全性记录良好，头痛是最常见的不良事件(发生在0.9-9%的程序后，超过80%不需要治疗)。感染或出血等严重不良事件发生在不到1/10,000的程序中。关于上述血液样本免疫表型的分析协议将与CSF样本重复。剩余CSF还将分析感染、炎症和神经退行性变的生物标志物，这些可能提供关于疾病存在或不存在的信息，或与疾病预后或严重程度相关。从同一参与者收集多个样本(即血液和CSF)将显著丰富研究，由于多模态数据，允许对认知障碍患者中涉及的免疫变化进行更完整的分析。例如，一个关键的科学问题是外周和中枢炎症之间的关系，通过在参与者子集中收集配对血液和CSF，我们将能够为这一重要领域做出贡献。
唾液样本
在参与者亚组中，将在休息、未受刺激状态下通过参与者将唾液滴入50 mL收集瓶中收集唾液，头部前倾，允许唾液在口中积聚。将在10分钟时间内收集5-20 mL，遵循1小时不进食或饮水的时期。处理后，唾液样本将经历多种高级分析程序，以识别炎症、τ、磷酸化-τ、Aβ和α-突触核蛋白的标志物。
尿液样本
在研究访问期间，将在无菌容器中收集20-30 mL的中段尿液，并将评估炎症、感染和变性变化的标志物。遵循分析协议，剩余尿液样本将储存用于未来分析。
分析
作者有完成和分析这些和类似人群中纵向研究数据的广泛背景。例如，NIMROD研究包括深度表型和神经影像学与纵向认知评估，探索脑炎症在痴呆中的作用。本研究的目标是检测队列之间免疫特征的差异。由神经心理学评估电池测量的认知下降连续变量，以及从MCI向痴呆的二元进展，也是感兴趣的结果。将使用多变量统计技术以及高维聚类、注释和差异分析来分析免疫细胞计数和临床测量，以识别预测疾病表型和下降率的关键免疫细胞簇组合。此程序还将减少数据的维度。此外，将应用标准自动和/或手动门控，然后根据数据集的分布应用参数/非参数检验。将使用标准参数方法比较生物样本中炎症、τ、磷酸化-τ、Aβ和α-突触核蛋白的标志物。还将比较健康对照、MCI-DLB/轻度DLB和MCI-AD/轻度AD组之间的认知和生物标志物数据，以识别任何组级差异。神经心理学测试分数将转换为域z分数，用于与生物标志物和临床数据的相关分析。随访评估的重复测量将标准化为基线对照分数，变化分数与基线变化相关以确定下降预测因子。如果识别出多个下降预测因子，将使用回归和其他多变量统计方法(包括混合效应模型)确定关键预测因子。遗传分析将用于确认与炎症或神经退行性变相关的等位基因的遗传学，并用于协作研究中的探索性分析。
功效计算
我们的目标是使研究具有80%的功效，在α为0.05的情况下检测组间免疫细胞群比例的差异。对于具有三个组和两个协变量(年龄和性别)的协方差分析，90的样本量(每组30)将有足够的功效检测0.33的效果大小(Cohen's f，相当于Cohen's d ~0.35)。180的样本量(每组60)将检测0.23的效果大小(Cohen's f，相当于Cohen's d ~0.24)。通过使用本组先前发表的工作中的数据，该工作使用流式细胞术在NIMROD队列中研究髓系细胞亚群，我们估计DLB、AD和对照组之间显著免疫细胞差异的效果大小在Cohen's D 0.5-0.8之间。这表明每组样本量超过30将足以检测这些差异，更大的样本量将检测更细微的差异。
对于与认知的相关性，Gate等人通过质谱流式细胞术确定了AD中的免疫细胞群与认知评分相关，斜率大小约为0.5。已经证明使用质谱流式细胞术检测的免疫细胞亚群与AD中认知下降的相关性具有相似大小的相关性(r = 0.37-0.64)。要检测这种大小的相关性，每组需要29的样本量(80%功效，α = 0.05)。每组60的样本量将检测更温和的相关性~0.35(所有功效计算在G*Power v3.9.7.1中执行)。
伦理与传播
本研究方案已获得普雷斯顿西北研究伦理委员会(参考21/NW/0314)批准。本研究已在ISRCTN注册中心注册(注册号ISRCTN62392656)。研究正在进行中(自2022年6月起)。基线访问正在进行中，部分参与者的随访访问已经开始。研究完成后将完成全面数据分析，并提交在国际会议上展示并在同行评审期刊上发表。研究结果还将通过当地和区域患者和公众参与活动以及定期新闻通讯更新与研究参与者及其亲属分享。将寻求参与者对他们参与研究体验的书面反馈。
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