Anne H. Cross医学博士：大家好。我是华盛顿大学神经病学教授Anne Cross，欢迎收听Medscape的InDiscussion多发性硬化症系列节目。今天，我们将与Mark Freedman博士探讨液体生物标志物与多发性硬化症的关系。Freedman博士是加拿大渥太华大学医学教授、渥太华医院研究所高级科学家，也是渥太华综合医院MS研究单元主任。欢迎来到InDiscussion，Mark。能否简单介绍一下自己？您是如何成为一名神经科医生的？又是什么让您进入MS领域的？
Mark S. Freedman理学硕士、医学博士：选择神经病学对我来说是顺理成章的，因为我原本就在攻读分子神经科学博士学位。当时我的导师对非医学博士获得的研究经费之少感到不满。有一天他直接把一叠文件扔在我桌上。我问："这是什么？"他说："我想让你看看我需要写多少份资助申请才能支持团队研究。这份是1万美元，这份是3万，这份是5万。如果你有医学博士学位，你可以申请20万美元的资助。你该去医学院了。"我申请并被录取，自然开始探索与神经科学相关的职业道路。我在多伦多求学时，一位导师与伦敦女王广场有联系，他建议："为何不去那里工作一段时间？这会让你接触临床神经病学，看看是否喜欢。"我在女王广场遇到的临床医生们令我深感钦佩，一切就此水到渠成。于是，我选择了神经病学。在神经病学轮转期间，有一天我负责MS门诊，当时我是高年资住院医师。大家都知道流程：低年资医生处理所有入院病例，作为高年资医师，我每天结束前审核所有病例，第二天早晨向主管汇报。他们向我介绍一位与我年龄相仿的住院患者，这大约是1980年代中期。他因进展型MS正在接受环磷酰胺治疗。当时我们就是这么做的；没有药物可用，没有任何获批疗法。我进来后他们介绍了病情，这个人看起来有点眼熟。检查进行到一半时，他看着我说："Mark，你不认识我了吗？"我赶紧查看病历姓名，顿时惊呼："天啊，这不就是我在研究生院一起打壁球的那个人吗！"我问他："你什么时候知道自己得了MS的？天哪，病情已经这么严重了。"这是最后一个病例，我让其他人离开，我们聊了一会儿。临别时他问我："你快完成神经病学培训了，会做研究吗？"我说："我确实考虑过，因为上医学院前就做过研究。"他说："看看我，看看这种疾病。我们不知道病因，也没有治疗方法。为什么不研究这个？"那天晚上开车回家时，我灵光一现——我想我们都有这样的顿悟时刻。我说："我想这就是我想做的。"于是，我走到了今天。
Cross：你的经历与我惊人地相似。我也有几位朋友得了MS，当然，我和你处于同一时代，当时没有任何治疗方法。你只想为同龄朋友做点什么，他们当时都很年轻，前途光明。感谢你投身这一领域，因为你整个职业生涯中做了大量出色且卓有成效的工作。多年来你一直研究液体生物标志物，用于MS诊断特别是预后评估。我想知道这项工作目前进展如何？
Freedman：谢谢你的评价，Anne。说实话，我们都很沮丧，因为除了MRI外，我们无法真正了解疾病是否恶化。更重要的是，如今我们有这么多疗法，但无法确定任何一种是否真正有效。患者经常对我说："我在服用这些药物，有副作用，怎么知道它对我有效？怎么知道它对疾病有作用？你说MRI上没有新病灶，检查结果没变化。"他们没有复发，但药物真的起作用了吗？我们在寻找某种生物测量指标。当时我主要研究脑脊液，因为这与大脑紧密相关。
我们首先关注的是神经丝蛋白。我们从重链开始研究，因为最容易测量——含量丰富，可通过脑脊液酶联免疫吸附测定(ELISA)检测。但脑脊液不易获取，需要腰椎穿刺，许多患者不愿反复接受这种检查。于是我们思考：如何更进一步？能否进行血液检测？哪种神经丝链在血液中更有用？因此我们转向轻链，因为它更有价值。重链虽可测量，但背景噪音太大，在血液中检测波动时，其水平远高于普通人正常值。
而轻链——得益于微阵列新技术的发展——现在可以测量到纳克和皮克水平。这样就能消除背景干扰，获得比脑脊液更易获取的标志物。我们从脑脊液研究获得启示，现已将整个研究领域转向血液检测。作为渥太华过去35年的脑脊液诊断实验室负责人，我保存了所有患者在知情同意下的血清样本，包括血清和脑脊液。其中许多患者我们仍在门诊随访。我们可以回溯到90年代初：当时脑脊液中的神经丝含量如何？20年后这些患者现状如何？这是我们最早发表的论文之一，证明早期神经丝测量确实是预测患者15-20年预后的指标，不是预测明天，而是预测未来15-20年。
随后我们转向标志物的前瞻性应用，定期随访患者。现在很多人在做同样的事，因为它太便捷了。我们发现神经丝轻链(NfL)的波动实际上能预测新疾病活动。它还能判断药物是否有效，因为NfL如果初始水平高，几乎任何当今有效疗法都能使其显著下降。在世界某些地区，患者获取MRI检查更为困难——我必须说加拿大也属此列。我们并非处处都有MRI设备。这是一种受管控的检查，大多数MS常规监测的MRI都在深夜进行，患者非常反感。这种方式下，患者每3-6个月来做一次血液检测，我们就能监测其疾病状况。
Cross：你提到神经丝重链。我想再跟进一下，你现在还使用它吗？它与NfL含义相同还是不同？
Freedman：我认为我们已放弃重链研究，因为轻链提供的信息丰富得多。中链也有一些研究兴趣，但主要仍在脑脊液中研究。轻链是目前普遍使用的，因为已有现成的检测套件。市面上有三四种高度可比的检测方法，其中一些已实现快速周转。我们现在使用的检测方法一小时就能出结果，就像肌钙蛋白检测一样。你将样本送至实验室，就像生化检测一样简单。而我们最初进行的第一代检测需要96孔板，必须收集样本，批量处理，无法立即获得结果。
情况也在变化，因为NfL相当敏感。我们在血液中测量它，但它对MS并不特异。任何导致轴突断裂的原因，无论是中枢还是周围神经系统，都会升高NfL水平。但在没有其他干扰性神经系统疾病的情况下，它很可能代表MS活动。我们知道干扰因素——例如高BMI、大体型；分布容积可能使水平远低于预期。轻链经肾脏过滤，若有严重肾病，血液水平会升高，这可能不代表神经系统疾病。问题在于神经丝的清除。但我们在血液中测量的物质来自大脑。脑脊液水平比血液中测量的高2-300倍。因此，血液中看到的量是从脑脊液"渗漏"而来的。
这个过程需要时间，意味着如果今天发生某些事情导致脑脊液中神经丝增加，血液检测可能仍正常，没人知道类淋巴系统需要多长时间才能将这些物质输送到血液。但可能数天到数周后，NfL也会升高。但如果恰好在某位感觉良好的人身上测到NfL升高，大多数研究表明这预示即将发作、新病灶形成或可能的疾病进展。这给了我们机会采取不同治疗策略，不再是被动应对——我用这些术语描述——像打地鼠游戏一样。疾病恶化了，所以我们更换药物或增加剂量。如果这些液体生物标志物预示即将发病，我们就有机采取主动策略，可以说NfL升高的原因别无他解。或许我可以为这位患者选择比当前疗法更好的方案，不必等待发作、新病灶或进展，尤其现在我们有这么多不同疗法可供选择。
Cross：我一直好奇的是，NfL似乎来自轴突和神经元，却能反映复发活动。你对此有何解释？
Freedman：回想一下Bruce Trapp多年前在《新英格兰医学杂志》发表的开创性论文，其中有些精美图片。这些图片用神经丝抗体染色，他让人计数轴突横断。最令人惊讶的发现是，当轴突横断发生时，当时所有人都会说："哦，可能发生在患者开始进展时。看到活动性进展，就会看到最多的轴突横断。"事实恰恰相反。所有或大多数轴突横断发生在急性斑块中，与炎症和脱髓鞘同时发生。这就是他向我们展示的，这是一个游戏规则改变者，因为当你看到进展时，实际上看到的是轴突横断累积到无法补偿的程度。这就是你进展的原因，而非横断发生的时间。这有点像帕金森病的故事：当你看到运动问题时，80%的黑质神经元已经死亡，但你想知道第一个神经元何时死亡。正因如此，NfL向我们报告新的炎症事件并不令人意外。
Cross：你不久前在《科学报告》上发表了一项很好的研究，涉及脑脊液和血清NfL及GFAP（胶质纤维酸性蛋白）。我相信这来自你在自体造血干细胞移植方面的工作。能否介绍一下？
Freedman：这让我们回到我正在做的另一项主要工作——对早期侵袭性MS患者进行造血干细胞移植(HSCT)治疗。我们在千禧年之际有一个试验方案，对患者进行移植，并在基线及之后每年收集脑脊液和血液样本3年。这是为了了解免疫学变化，因为当时没人预期HSCT能阻止疾病。遗传学专家告诉我们："你在浪费时间。你要消除免疫系统，它会恢复，而疾病是由基因产生的，基因会让一切重演。"当然，这并未发生。这是一次失败的实验，因为我们从这些患者身上没有学到任何免疫学知识。但他们非常满意，因为没有人再出现炎症事件。于是我们试图理解这怎么可能，这些人身上发生了什么。
我们收集了脑脊液、血清和细胞样本，冷冻保存了细胞。我的许多同事，特别是蒙特利尔和宾夕法尼亚大学的同事做了大量工作；Amit Bar-Or团队负责了大部分细胞学研究。但我们也能观察这些生物标志物，我们有大量潜在标志物。
星形胶质细胞活跃时GFAP会上升，星形胶质细胞有很多有益作用。我们知道它们非常重要，但似乎也普遍负责神经系统疾病包括MS的瘢痕形成过程。如果GFAP上升，可能表明MS进入更严重的进行性瘢痕阶段。这可不是好事。NfL代表早期炎症，GFAP代表瘢痕形成。我们在血液和脑脊液中测量了所有这些指标，果然，血液中的GFAP也代表脑脊液中的情况。但我们注意到，尽管脑脊液和血清中NfL的关系相当线性——你测量的是脑脊液中发生的直接反映——GFAP却没有这种关系。其他人观察到线性关系，有些报告非线性。GFAP可能更像曲线。需要在大脑中释放大量GFAP才能开始测量到它，这正是我们在复发型MS中看到的——GFAP不太有信息量，而NfL是。但当你进入更严重的进行性病例时，GFAP也会上升。我认为我们在骨髓移植或HSCT患者中看到了这一点，因为他们是早期侵袭性患者，但已开始形成瘢痕。我们同时看到了两者。但一年后，两者都急剧下降，并在我们测量期间一直保持低位。血液测量已持续超过3年，它们仍保持低位。但我们只对前3年进行了脑脊液检测。
Cross：你对为何GFAP在进展期升高的原因有何想法？
Freedman：我不知道导致进展的确切原因。我仍然认为人们进展的一个重要原因是对各处损伤无法补偿。有些人确实是优秀的修复者，而有些人不是。
我们无数次看到：有些患者经历轻微复发后终身受困于相同症状，而有些经历严重复发的患者却能跑出医院。显然，有些人能更好地恢复。但这是多年累积的损伤，最终达到无法挽回的点。无论这个点是什么，对每个人来说都是独特的。每个人都寻找那个转折时刻——"好吧，我们在复发，现在突然变成进行性了"。我认为并非如此。这让我回想起早期的一些病理观察。脱髓鞘病变最显著的特点之一是：如果你观察髓鞘染色，它不会逐渐消失，而是一条突兀的边界线。这很神奇，脱髓鞘线后就是正常组织；边界处必然发生了急性事件。因此，这些病变中存在一个演变过程。我认为从复发性到进行性的转变不是急性事件，而是累积的结果。如果我们让炎症持续数年，就会导致这种累积损伤，然后达到无法挽回的点。我们在临床上看到，随着患者病情发展，MRI上形成的新病灶越来越少，复发减少，NfL不再上升，但GFAP却在上升。总体来看，这两种标志物在某种程度上是互补的。NfL反映大量炎症活动，而GFAP更多反映这种累积损伤。
Cross：你现在在临床中是否使用这些指标来决定患者护理，甚至在开始时决定给新患者使用哪些初始药物？
Freedman：简短回答是肯定的。我们像多年来许多同行一样，对患者进行特征分析。我认为我们将进入人工智能(AI)时代，每个人都在这样做，关于个体患者的大量信息不断涌现：年龄、性别、基因型、EBV（爱泼斯坦-巴尔病毒）暴露史、既往用药、复发类型、EDSS（扩展残疾状态量表）评分、MRI上病灶数量及位置等。我可以继续列举。你能想象这个问题：我们如何将所有这些因素综合起来？AI将解决这个问题，NfL是其中一部分。
如果NfL高，且距离已知发作2-3个月，这是不良预后。多年来所有研究都表明，基线NfL高不仅预测下一年情况，还预测5-10年后的状况。我们自己的数据清晰地证明了这一点，因为我们拥有过去30年门诊随访患者的脑脊液和血液样本。初始高水平——这是治疗前时代——无论我们用什么方法治疗，NfL最高的患者预后最差。现在前瞻性研究也告诉我们同样的结果。
因此，特征分析是其中一部分。选择疗法后随访患者时，如果NfL非常高，我们现在就有选择：是否对100%的人采用高效力疗法？还是有些人可能对所谓低效力疗法（安全性更好）反应良好？NfL是其中一部分，它会告诉我们：如果你水平非常高，你就属于更高风险层级，可能需要从高效力治疗开始。它在开始时帮助我们，随访患者时，我们期望NfL会下降，或者如果未下降，可能表明疗法无效，因为这是生物效应。这也是我们的担忧之一。我们减少了约30%-40%所需的监测MRI数量。头几年后，我们不做常规MRI，只跟踪NfL。如果出现波动，我们再安排MRI。现在我们一小时就能获得检测结果：有多少次患者因新症状打电话，认为可能发作？与其反应性地直接给予类固醇（这是常规做法），我们会检测NfL。如果正常但已有症状，可能只是假性发作。它在门诊或急诊室的急性病例中帮助很大，能区分假性发作和真实的新炎症事件。
Cross：顺着这个思路，你现在是否对所有新患者都进行腰椎穿刺？如果是，你是否将其用于预后评估？
Freedman：我们对大多数患者进行腰椎穿刺，但并非因为寻找液体生物标志物。脑脊液是诊断检查的重要部分，对我来说，它是麦当劳诊断标准第一项"无更好解释"的最重要测试之一。通常，你寻找任何可能模仿MS的情况，因为最不想做的是错误贴上标签。然后开始可能无效或对个体有害的治疗，使其面临安全风险。我认为腰椎穿刺很重要，尤其是现在有新标准。对于影像学孤立综合征(RIS)类别，我想在完全无症状者开始治疗前，获取所有能证明这是MS的证据——当情况明确且符合所有标准时。老话说："如果它看起来像鸭子，叫声像鸭子，飞行像鸭子，那它就是鸭子。"我们不对这些个别患者做脑脊液检查。但我认为在新发病例中，尤其是早期，这是一个非常重要的检查，因为它不仅能排除其他情况，还能获得重要的免疫学特征，在某些情况下几乎能确定就是MS而非其他疾病。我们不需要它来测NfL；我们不在脑脊液中测量NfL，因为血清与脑脊液关系非常线性，无需在那里检测就能获得结果。有趣的是，在其他情况下——我不想深入讨论，因为我们现在不谈这个——但在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体相关疾病(MOGAD)中，脑脊液和NfL可能很有意思，这将是未来的话题。
Cross：既然你有能力在患者身上检测，你是否常规获取脊液GFAP水平？
Freedman：我们尚未常规检测；NfL在我们医院已是常规检测。费用由医院承担，而非患者。通常对所有患者进行检测。我们现在正努力使GFAP达到同样水平，这需要我们提供更多数据。目前它仅限研究使用。我们有脊液样本，正在收集，我相信它将成为未来论文的一部分，但尚未常规使用。
Cross：血液或脊液中是否有让你兴奋的生物标志物，你认为它们可能比NfL更有价值或补充NfL？
Freedman：我相信它们会有补充作用。有许多免疫学标志物正在研究中，可能更能指示正在发生的炎症类型。天哪，那将太棒了。如果你知道炎症的驱动力，就可能更精准地针对机制进行治疗。但它们远未达到NfL和GFAP的水平，后者在过去十年积累了大量数据。目前出现的信息只是候选分子，需要在其他群体中验证。我无法从当前研究的众多试剂中挑选出接近NfL的。但也许5-10年后我们会有一套组合。这套组合不仅包含NfL这样的非特异性标志物，还包含更针对个体实际疾病的特异性标志物。然后我们就能更精准地进行治疗。
Cross：非常感谢Mark Freedman博士分享关于液体生物标志物的知识，特别是NfL和GFAP。我学到了大量知识，不仅现在有用，未来也会受益。你确实让我对未来充满希望，相信我们能更好地预测和理解患者状况。非常感谢你的工作。我们一直在收听InDiscussion。我是Anne Cross。希望所有听众都享受了这次关于MS液体生物标志物的讨论。
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