摘要
乳腺癌仍然是全球女性中最常见的恶性肿瘤。新兴证据表明，微量元素，特别是硒(Se)和汞(Hg)，可能与乳腺癌的发病机制有关。本研究旨在评估生物样本中Se和Hg水平的变化是否与乳腺癌分期、相关血液学变化和乳腺X光密度有关。我们进行了一项病例-对照研究，包括285名经组织学确诊的乳腺癌患者和215名年龄匹配的对照。通过原子吸收光谱法分析生物样本(头皮头发和血液)。使用Shapiro-Wilk检验正态性；根据需要应用参数检验(t检验、ANOVA)或非参数检验(Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验)，并进行Tukey/Dunn事后校正。与对照组相比，乳腺癌患者在所有分期中均表现出显著较低的Se水平和较高的Hg水平。例如，IV期患者的头发Se浓度为0.25 μg/g (95%置信区间0.23–0.27)，而对照组为1.59 μg/g (95%置信区间1.54–1.64)(t = −46.2，p < 0.001；Hedges g = −5.12)。头发Hg浓度为4.31 μg/g (95%置信区间4.24–4.38)对比对照组的1.19 μg/g (95%置信区间1.17–1.21)(t = 84.7，p < 0.001；Hedges g = +7.05)。血液Se浓度从对照组的220.0 ± 8.2 μg/L逐渐下降到IV期的51.3 ± 5.8 μg/L(p < 0.001)，而血液Hg浓度则从0.97 ± 0.05上升到2.94 ± 0.11 μg/L(p < 0.001)。血红蛋白水平也随分期下降(对照组为12.7 ± 1.2 g/dL，IV期患者为5.62 ± 0.38 g/dL，p < 0.001)。这些发现表明，低Se和高Hg水平与乳腺癌进展期和血液学指标下降存在一致的关联。值得注意的是，Se水平低于70 μg/L的GPx3充足阈值，而头发Hg水平超过了2 μg/g的毒理学指导阈值，这突显了Se的临床相关性。虽然因果推断有限，但这些结果表明Se和Hg的不平衡可能作为疾病进展的生物标志物。考虑到国际数据显示Se缺乏较为罕见，应谨慎解读这些发现，这突显了特定人群的风险。
引言
乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，代表着日益增长的全球公共卫生问题，尤其是在低收入和中等收入国家。2020年，乳腺癌约占230万新发病例和68.5万死亡病例，预计到2040年发病率将继续上升(世界卫生组织，2023)。这一全球增长反映了人口结构变化、生殖行为改变以及环境和生活方式相关风险因素暴露增加。
在巴基斯坦，乳腺癌是女性中最常见的癌症，占所有女性恶性肿瘤的34.6%，是亚洲发病率最高的国家。预计到2025年，卡拉奇地区的乳腺癌病例数将比2015年增加60.7%，其中30-34岁女性的病例预计将惊人地增加130.6%。这一趋势是由人口扩张、遗传易感性和早期检测与治疗的社会经济障碍等复杂因素共同驱动的。
在巴基斯坦人群中，主要风险因素包括高龄、初潮早、未生育、肥胖、缺乏身体活动和低社会经济地位。遗传易感性，如BRCA突变和高近亲结婚率，进一步增加了疾病负担，但仍有相当一部分家族风险无法解释。社会经济和文化决定因素，特别是污名化、意识有限和诊断服务获取不足，显著导致晚期就诊和死亡率升高。
乳腺X光密度(MD)，定义为乳腺中纤维腺体组织与脂肪组织的比例，既是主要风险因素也是检测障碍。高MD与乳腺癌风险增加四至六倍相关，并将乳腺X光检查的敏感性从脂肪型乳房的85%降低到极高密度乳房的60%以下。这种"遮蔽效应"导致诊断延迟。筛查准确性降低使治疗规划变得复杂。
巴基斯坦女性中高MD的患病率明显升高。一项研究报告称，56.9%的女性BI-RADS分类为3或4级密度，而另一项研究报告称45岁以下女性中患病率为62.4%。在乳腺癌患者中，76.7%被归类为BI-RADS B或C级。高MD的风险因素包括年轻年龄、较低BMI、激素暴露和良性乳腺疾病史。从生物学角度看，高MD反映了基质和上皮组织的丰富，可通过机械硬度、胶原沉积和促炎微环境促进肿瘤发生。高密度乳腺组织中的炎症介质如MCP-1、TNF-α和TGF-β升高，可能促进局部免疫激活和DNA损伤。调节MD的遗传因素包括雌激素代谢和炎症通路中的多态性。
环境和微量元素已被研究与乳腺癌相关。Se是一种必需微量元素，具有抗氧化、抗炎和抗增殖作用，可能调节氧化应激和雌激素信号传导，尽管这些发现具有环境依赖性。然而，很少有研究同时考察Se和Hg与乳腺癌分期或乳腺X光特征的关系。相比之下，Hg是一种已知的有毒物质，能够产生活性氧(ROS)、诱导DNA损伤并破坏内分泌信号传导。Hg暴露与癌症风险增加相关，尽管针对乳腺癌的具体数据仍在不断涌现。
Se和Hg之间存在重要的生物相互作用，其中Se可以与Hg形成生物惰性复合物，可能中和其毒性。这种拮抗作用突显了需要同时研究这两种元素，特别是在环境暴露升高的群体中。然而，来自南亚，特别是巴基斯坦的证据仍然有限，大多数现有研究仅关注血清浓度，而未评估乳腺X光密度或血液学参数。
Se通过维持细胞氧化还原稳态的硒蛋白发挥其生物学作用。特别是，谷胱甘肽过氧化物酶-4(GPX4)解毒膜脂质过氧化物，从而抑制铁死亡，这是一种与乳腺癌生物学日益相关的细胞死亡程序。同样，硫氧还蛋白还原酶(TrxR1/TrxR2)再生硫氧还蛋白系统，支持核苷酸合成和抗氧化防御。相比之下，Hg以高亲和力与硒醇和硫醇基团结合，并直接抑制这些酶，特别是TrxR——从而削弱过氧化物解毒并放大氧化应激。此外，全身硒输送依赖于硒蛋白P(SELENOP)及其受体LRP8/ApoER2和巨蛋白/LRP2；该轴的破坏会降低硒蛋白活性。最后，由于Hg可以在惰性Hg-Se复合物中螯合Se，Se:Hg平衡在生物学上具有相关性；然而，简单的">1:1摩尔比"规则是过度简化，不能保证对人类的保护。
Se和Hg通过影响氧化平衡和解毒的复杂生化机制相互作用。汞与TrxR和GPx中的半胱氨酸/硒代半胱氨酸位点结合，降低酶活性和抗氧化能力；而Se通过形成惰性Hg-Se复合物促进螯合和排泄，从而缓解毒性(图1)。
受此框架指导，我们旨在解决这些差距。我们在巴基斯坦信德省测量了乳腺癌女性和年龄匹配的健康对照者的血液和头皮头发中的Se和Hg，并评估了与(i)临床分期(T-I至T-IV)、(ii)乳腺X光密度(BI-RADS类别)和(iii)血液学指标(血红蛋白、红细胞[RBC]计数、血细胞比容、MCV、MCH、MCHC、铁蛋白和TIBC)的关联。我们假设较低的Se和较高的Hg将与更晚期的分期、更大的乳腺X光密度和不太有利的血液学特征相关，这与硒酶活性受损和氧化应激升高一致。
材料和方法
研究设计和伦理
本病例-对照研究于2021年至2023年进行，旨在评估生物样本中Se和Hg浓度与乳腺癌进展和乳腺X光密度的关联。总共招募了285名经组织学确诊的女性乳腺癌患者和215名健康年龄匹配的女性，她们来自信德省各地的医院和筛查中心(图2)。该研究的伦理批准由信德大学国家分析化学卓越中心(NCEAC)获得。在纳入前，从所有参与者处获得书面知情同意。认证医院肿瘤学家和放射科医生进行临床评估、诊断和影像学评估，而分析程序在NCEAC实验室进行。
参与者和样本量合理性
先验功效分析(G*Power 3.1)假定两组平均差异(独立样本，双尾)，α = 0.05，功效(1−β) = 0.80，以及在肿瘤学队列中报道的中至大效应量(Cohen's d ≈ 0.5–0.8)。在此假设下，每组需要≥200名参与者。最终分析样本(患者=285；对照=215)超过此阈值，提供≥80%的功效来检测元素和血液学指标的分期差异。
纳入和排除标准
年龄在35-79岁之间、经组织学确诊为乳腺癌且在过去3.5个月内未补充矿物质的女性有资格纳入患者组。选择具有相似年龄和区域背景、无癌症或慢性疾病史的健康女性作为对照。排除标准包括既往化疗、放疗或激素治疗；合并慢性疾病(如肾、肝或自身免疫)；先前恶性肿瘤；或不完整的临床或生物样本数据。
样本收集和制备
按照先前研究的详细协议，从参与者处收集头皮头发和静脉血样本。样本储存在-20°C以防止金属污染。根据标准程序使用4-5 mL静脉血进行生化分析。从枕部区域收集的头发样本用非离子洗涤剂和去离子水清洗并在烘箱中干燥。通过酸洗聚丙烯管抽取血液以最小化污染。所用设备基于先前研究的方法。使用Milestone微波炉(型号Rotar MPR-300/12S)和Hitachi型号180-50进行测量，参数列于补充表S1中。样品制备在Pel微波炉(型号PMO23)中进行，溶液储存在酸洗PTFE容器中。
微量元素分析
通过原子吸收光谱法(AAS)测量硒和汞水平。使用石墨炉AAS(PerkinElmer AAnalyst 700)测定硒，而使用冷蒸气AAS通过氢化物发生系统HGA-900定量汞。使用认证多元素标准溶液进行校准。所有试剂均为分析级，购自Merck和Sigma-Aldrich。
临床评估和分期
根据美国癌症联合委员会(AJCC)TNM分类进行癌症分期，该分类基于肿瘤大小、淋巴结受累和转移。患者分为四个临床阶段：T-I、T-II、T-III和T-IV。使用乳腺X光检查、CT扫描、超声和正电子发射断层扫描(PET)等成像技术进行诊断确认。乳腺X光密度通过乳腺影像报告和数据系统(BI-RADS)进行分类，致密乳腺组织被认为是肿瘤延迟检测的风险因素。医院肿瘤学家和放射科医生完成诊断程序和影像学解释；研究团队分析匿名临床报告和元素数据。
血液学和生化分析
使用自动化血液分析仪测量包括血红蛋白(Hb)、红细胞计数(RBC)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和白细胞(WBC)计数在内的血液学参数。通过标准免疫测定和比色法评估铁相关标志物，包括血清铁蛋白和总铁结合能力(TIBC)。
统计分析
计算组级汇总统计(均值、标准差、n)，并通过Welch's t检验将每个癌症阶段(T-I–T-IV)与对照组进行比较。我们报告了平均差异(Δ)、t统计量、自由度(df)、双尾p值、Δ的95%置信区间(CI)以及效应量(Cohen's d和Hedges' g)。通过Benjamini-Hochberg程序控制分析家族(元素和血液学)内的错误发现率。生成组均值±标准差图和分期编码散点图。所有分析均通过SPSS v25和Python(scipy/statsmodels)进行，α = 0.05。
结果
患者人口统计学和临床特征
我们分析了285名女性乳腺癌患者和215名年龄匹配的健康对照(图2)。患者的平均年龄为51.7 ± 9.4岁，而对照组为50.8 ± 8.9岁(t = 0.81，p = 0.42，95% CI −0.9至2.7；Hedges g = 0.10)。肿瘤分期为T-I(n = 25，8.8%)、T-II(n = 38，13.3%)、T-III(n = 105，36.8%)和T-IV(n = 117，41.1%)(图2)。超过60%的早期阶段患者(T-I/T-II)有致密乳房(BI-RADS c/d)，这与筛查敏感性降低和延迟检测一致(补充图S1)。临床表现随阶段演变：早期疾病为无痛肿块，晚期阶段为乳头回缩/皮肤凹陷/可触及淋巴结病(补充图S2)。通过细针穿刺抽吸活检(FNAC)和/或核心活检以及多模态成像(超声、乳腺X光检查、CT；补充图S3)确认诊断。
硒和汞的元素分析
我们将健康对照和T-I至T-IV阶段乳腺癌患者的头皮头发和血液中Se和Hg浓度进行了比较(图3；表1)。在对照组中，头发中Se浓度为1.59 ± 0.29 μg/g，血液中为220.0 ± 8.19 μg/L，而Hg浓度在头发中为1.19 ± 0.09 μg/g，在血液中为0.97 ± 0.05 μg/L。相比之下，患者表现出与阶段相关的Se下降和Hg同步增加。在T-I阶段，头发中Se浓度降至0.45 ± 0.09 μg/g，血液中为125.1 ± 5.35 μg/L，而Hg浓度在头发中增至2.85 ± 0.21 μg/g，在血液中为2.15 ± 0.35 μg/L。到T-IV阶段，头发中Se达到0.25 ± 0.01 μg/g，血液中为51.3 ± 5.75 μg/L，而Hg在头发中升至4.31 ± 0.15 μg/g，在血液中为2.94 ± 0.11 μg/L。这些阶段性模式显示在图3中，并在补充表S2中总结。
推断比较(表1)证实这些差异在统计学上显著且幅度大。与对照头发相比，Se低−1.34 μg/g (95% CI −1.399–−1.281；Welch's t ≈ −45.2；p = 1.78 × 10⁻⁶⁶；Hedges g = −5.05)，而Hg高+3.12 μg/g (95% CI 3.05–3.19；t ≈ 91.8；p = 2.88 × 10⁻³¹；Hedges g = +30.1)。T-I、T-II和T-III患者的阶段与对照结果在表1和补充表S2中提供，所有比较在错误发现率调整后仍保持显著。
从临床角度看，晚期疾病患者(T-III/T-IV)的血液Se落在约70–120 μg/L的功能充足范围内或低于该范围，这与硒蛋白活性潜在受损一致。同时，所有癌症阶段的头发Hg均超过2 μg/g指导水平，表明暴露或积累增加。综合起来，这些发现清楚地揭示了随着进展，硒缺乏和汞过载的趋势。与此模式一致，图4中的散点图说明了Se和Hg之间的显著逆向关系，这在较高阶段最为明显。
血液学和铁相关参数
与对照组相比，乳腺癌患者表现出血液学指标的显著异常(图5；表2；补充表S3)。血红蛋白从对照组的12.7 ± 1.21 g/dL降至T-IV阶段的5.62 ± 0.38 g/dL (Δ = −7.08 g/dL；Welch's t = −78.94；df = 281.5；p < 1 × 10⁻¹⁶；Hedges g = −7.06)。红细胞从4.02 ± 0.30 × 10¹²/L降至1.35 ± 0.17 × 10¹²/L (Δ = −2.67 × 10¹²/L；t = −103.49；df = 329.4；p < 1 × 10⁻¹⁶；g = −10.18)。其他指标随阶段进行性下降：血细胞比容从41.9 ± 1.05%降至17.9 ± 1.26%，平均红细胞体积从93.6 ± 1.45 fL降至58.5 ± 1.99 fL，平均红细胞血红蛋白从30.7 ± 0.62 pg降至11.9 ± 0.98 pg，平均红细胞血红蛋白浓度从34.8 ± 0.59 g/dL降至16.5 ± 1.51 g/dL (所有p < 1 × 10⁻¹⁶，效应量大；表2)。相比之下，铁相关标志物水平从53.9 ± 5.15 ng/mL升至165.0 ± 7.41 ng/mL (Δ = +111.1 ng/mL；t = 144.31；df = 178.3；p < 1 × 10⁻¹⁶；g = 18.35)，总铁结合能力从293.0 ± 9.52 μg/100 mL升至685.0 ± 26.9 μg/100 mL (Δ = +392.0 μg/100 mL；t = 152.51；df = 132.0；p < 1 × 10⁻¹⁶；g = 22.10)(表2)。所有阶段与对照比较在错误发现率调整后仍保持显著。从临床角度看，这些发现表明，随疾病阶段进展，炎症相关、铁限制性贫血逐渐加重。
讨论
在本病例-对照研究中，我们观察到乳腺癌女性中微量元素的清晰阶段相关不平衡。与健康对照相比，硒(Se)水平从T-I到T-IV阶段逐渐降低，汞(Hg)水平明显升高，这在血液和头皮头发样本中均如此。这一趋势在所有比较中保持一致，并在校正多次检验后仍具有统计学显著性。这些结果表明，乳腺癌进展与氧化应激增加和抗氧化防御减少相关，这是由Se和Hg的对立生物学作用驱动的。
硒是一种必需微量元素，通过其在硒蛋白(包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR))中的作用支持抗氧化防御和氧化还原平衡。这些酶防止对脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，这对维持细胞稳态和防止恶性转化至关重要。相比之下，汞是一种有毒重金属，与蛋白质中的硒醇和硫醇基团结合，从而抑制GPx和TrxR活性并增加活性氧(ROS)产生。这些元素之间的机制关系如图1所示。汞不仅抑制硒依赖性酶，还形成稳定的Hg-Se复合物(如硒化汞(HgSe))，降低汞毒性并增强其排泄。当硒不足时，这种解毒途径变得不太有效，允许汞在组织中积累。因此，硒缺乏可能加剧汞诱导的氧化应激，而汞暴露可能进一步耗尽功能性硒储备，形成导致癌症进展的恶性循环。
我们的统计发现支持这些机制。头发Se从对照组的1.59 μg/g降至T-IV阶段患者的0.25 μg/g，而头发Hg从1.19 μg/g升至4.31 μg/g。同样，血液Se从220 μg/L降至51.3 μg/L，血液Hg从0.97 μg/L升至2.94 μg/L。这些大而一致的差异(p < 0.0001；Se的Hedges g > 2，Hg > 10)显示Se-Hg不平衡与疾病严重程度之间的稳健关联。在两种基质中观察到的Se-Hg逆向趋势支持这两种元素在生物化学上相互关联并共同影响氧化还原稳态的假设。
血液学参数也随癌症阶段发生显著变化。T-III和T-IV疾病患者与对照组相比，血红蛋白和红细胞指标较低，铁蛋白和TIBC水平较高，与炎症相关、铁限制性红细胞生成一致。这种模式表明对慢性氧化应激和炎症的全身反应，已知这会抑制促红细胞生成素产生和铁可用性。这种贫血导致晚期乳腺癌患者疲劳、功能状态差和生活质量降低。
这些发现的生物学合理性进一步得到先前研究的支持，这些研究表明汞干扰抗氧化和免疫功能，而足够的硒水平有助于维持氧化还原平衡和免疫能力。人群研究还报告称，硒状况因地区而异，取决于土壤含量、饮食和补充政策。例如，硒缺乏在中国和东欧部分地区很常见，而北美摄入量通常充足。相反，沿海和河流社区中汞暴露更为频繁，这些社区严重依赖海鲜或从事手工黄金开采。这些全球差异使得难以建立用于癌症预防或管理的通用Se/Hg阈值。
最近的临床报告还指出，治疗期间明显的硒缺乏可能不常见，并且在没有监测的情况下补充可能有过度剂量风险。在我们的研究中，晚期平均值落在或低于功能充足范围(~70 μg/L)，而对照组较高，支持基于情境的监测而非常规补充。从临床上看，我们研究中许多晚期疾病患者的Se浓度在或低于较低功能范围(~70 μg/L)，头发Hg值高于世界卫生组织/联合国环境规划署2 μg/g的指导限制。虽然本研究未提出明确的诊断截断值，但这些水平可作为更密切监测、饮食咨询和环境暴露评估的实用指标。将微量元素检测与常规血液学和影像学结合，可能会改善风险分层，特别是在晚期就诊常见的资源有限环境中。
未来研究应包括前瞻性队列和干预性研究，测量饮食摄入、暴露源和功能性硒蛋白活性(如GPX4、TrxR)。关于铁死亡和氧化信号的机制研究可以阐明Se-Hg不平衡是否直接导致癌症进展。评估受控Se补充和Hg减少策略的临床试验，辅以生物化学监测，可能有助于确定修改这些暴露是否改善结果。
总之，本研究提供了证据，表明乳腺癌女性中存在强烈的阶段相关Se-Hg不平衡，得到统计和生物学发现的支持。硒消耗和汞积累似乎随疾病进展而恶化，可能通过氧化还原破坏和酶抑制。这些结果突显了将环境和营养评估纳入乳腺癌预防和管理的重要性，特别是在硒摄入量低或汞暴露高的地区。
局限性和影响
本研究有几个局限性。首先，病例-对照设计无法确定因果关系或暴露时间与疾病发展的时间关系。其次，没有详细的个体饮食(包括鱼类摄入)、环境暴露和汞形态数据；因此，可能存在残余混杂，无法进行完整的多变量调整。第三，血液和头发样本代表不同的暴露期和汞形态，限制了它们之间的直接比较。第四，来自单一地区的基于医院的样本可能限制对其他人群的普遍性。第五，未测量功能性生物标志物，如硒蛋白活性(如GPX4、TrxR)和铁死亡标志物，这限制了机制解释。最后，此处讨论的临床阈值应被视为指示性参考点，而非诊断截断值，直到在前瞻性研究中得到验证。
未来研究应包括具有标准化暴露评估的前瞻性队列研究，包括饮食摄入、鱼类消费和汞形态。需要调整回归或生存模型来识别独立关联，并且验证研究(如ROC分析)应测试血液Se < 70 μg/L和头发Hg > 2 μg/g是否能改善风险预测。测量硒蛋白活性和铁死亡通路的机制调查，以及精心设计的干预措施以优化硒状态和减少汞暴露，可能有助于确定修改这些因素是否能改善患者结果。
结论
在本病例-对照研究中，从T-I到T-IV阶段，血液和头皮头发中Se水平下降而汞Hg水平上升，伴有进行性贫血，表现为血红蛋白和RBC指数降低，以及铁蛋白/TIBC升高。研究结果表明，较低的Se可能降低抗氧化防御能力，而较高的Hg增加毒性应激，尽管仍为关联性发现。血液Se水平在70–120 μg/L范围内且头发Hg高于2 μg/g可能表明需要随访、咨询和支持性护理。前瞻性研究应确认这些阈值，并测试改善Se状态和减少Hg暴露是否能改善结果。
【全文结束】
