植物外泌体注射：激光后血管修复的新突破Plant Exosome Injection: A New Boost for Postlaser Vascular Repair | JCAD - The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology

《临床与美容皮肤病学杂志》. 2026;19(4):10–15.

作者：Noury Adel，理学硕士，健康医学博士，哲学博士；Youn Kyong Jo，医学博士；Ida Vega Thulesen，内外全科医学士

Adel博士是埃及开罗私人诊所的口腔颌面外科专家。Jo博士任职于韩国首尔Orsayun诊所。Thulesen博士任职于丹麦罗斯基勒大学医院眼科。

资金支持：本文未获得任何资金支持。

利益披露：作者无相关利益冲突。

摘要：背景：微血管激活是口腔伤口愈合中一个关键的早期事件，尤其是在激光诱导的损伤中，热效应会改变内皮行为。CD31是一种关键的内皮粘附和信号分子，为评估血管生成开始、血管重组和内皮稳定性提供了可靠的标记。植物源性纳米囊泡（PDNVs）已成为能够调节细胞通信的有前景的生物治疗剂，但它们对激光伤口中CD31介导的血管重塑的影响在很大程度上仍未得到充分探索。目的：研究2种不同的PDNV配方如何调节在兔舌组织中创建的标准蓝光二极管激光伤口中的CD31表达和CD31+微血管密度。方法：在兔舌上产生受控的450纳米二极管激光微切口，并用Exoline或Glow外泌体进行局部治疗。未处理的伤口作为对照。在基线、第3天和第7天采集组织样本。组织学评估主要集中在CD31免疫组织化学上，以量化内皮激活、血管出芽和重塑强度。额外的形态学评估支持对血管变化的解释。结果：与对照组相比，两种PDNV配方均显著增加了CD31+内皮结构。Exoline诱导了最高的早期CD31表达，伴随着密集的微血管出芽和明显的内皮聚集，到第3天时尤为明显。Glow产生中等但持续的CD31标记升高，血管组织更为渐进。到第7天，Exoline处理的伤口显示出成熟、方向良好的血管网络，而Glow处理的组织显示出中间阶段的重塑。结论：PDNVs能有效增强激光诱导的黏膜损伤后CD31介导的血管生成激活，其中Exoline表现出最强大的内皮反应。这些发现突显了PDNVs作为口腔再生环境中早期微血管重塑的有前景的调节剂。关键词：外泌体、口腔伤口、伤口愈合、再生医学、再生美学、激光切口、二极管激光、口腔组织、口腔黏膜

引言

口腔软组织的伤口愈合是一个复杂且高度调控的过程，涉及炎症、细胞增殖、细胞外基质沉积和血管生成。舌部，特别是其尖端，由于咀嚼、发音和吞咽带来的持续机械应力，加上高血管化和微生物暴露，成为研究再生疗法的临床重要模型。这些因素可能损害及时愈合，使舌尖成为评估软组织修复新干预措施的严格且相关的实验模型。

血管生成，即从现有血管形成新血管的过程，是有效组织再生的关键决定因素。毛细血管网络确保氧气和营养物质的输送，支持成纤维细胞增殖，并促进细胞外基质重塑，最终影响伤口闭合和组织功能。CD31（血小板内皮细胞粘附分子-1，PECAM-1）是内皮细胞广泛接受的免疫组织化学标记物，作为组织修复过程中血管生成的可靠指标。CD31表达的定量和定性评估为血管生成动态提供了关键见解，这对于优化再生策略至关重要，特别是在需要快速功能恢复的区域。

外泌体是富含生物活性蛋白、脂质和核酸的纳米级细胞外囊泡，介导细胞间通信并调节炎症、血管生成和成纤维细胞活性。植物源性外泌体为哺乳动物来源提供了一种有前景的、生物相容性替代品，具有固有的抗炎、抗氧化和促再生特性。临床前研究表明它们能够增强组织修复，但它们对口腔黏膜伤口的影响，特别是在微血管水平，在很大程度上仍未得到探索。

激光辅助软组织手术，包括450纳米二极管激光的使用，在美容医学和口腔手术中越来越受欢迎，因其精确性、止血和最小的附带损伤。然而，激光诱导的热损伤会影响局部血管反应，突显了增强血管生成的辅助疗法的重要性。

本研究旨在调查2种商业化的植物源性外泌体配方对兔模型中激光诱导的舌尖伤口CD31介导的血管生成的影响。通过关注血管再生，这项工作寻求为再生医学、口腔软组织再生和美容外科实践提供机制见解。

方法

研究设计：进行了一项受控、随机和盲法的实验研究，以评估植物源性外泌体对兔激光诱导的舌部伤口中血管生成的影响。研究方案遵循ARRIVE（Animals in Research: Reporting In Vivo Experiments）2.0指南进行临床前研究。所有程序都经过设计，以确保可重复性，最小化混杂因素，并防止观察者偏见。

动物和饲养：共纳入108只雄性新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus），体重2.5至3.0公斤，以避免影响伤口愈合的激素变异。动物在标准化条件下单独饲养：温度22±2°C，湿度55%±10%，12小时光照/黑暗周期，可自由获取标准化食物和水。实验前动物适应7天。每天评估健康状况，仅纳入临床上健康的动物。

实验组：兔子通过计算机生成的序列随机分配到3个实验组（每组n=36）：

1. 对照组：激光切口，无治疗
2. ExoLine组：激光切口加ExoLine（Abiomaterials）植物外泌体皮下注射
3. Glow组：激光切口加Glow（Louis Derma）植物外泌体皮下注射

每组进一步分为3个牺牲时间点（基线、第3天、第7天；每亚组n=12）。分配通过密封不透明信封隐藏。

麻醉和伤口诱导：通过肌内注射氯胺酮（35 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）诱导全身麻醉。舌表面用0.12%氯己定葡萄糖酸盐消毒。使用450纳米二极管激光（Woodpecker LX16 Plus）以2 W连续模式在中线舌尖进行标准化4×4×2毫米全层切口。严格控制激光参数、光纤方向和应用持续时间。一名操作者执行所有切口，以消除操作者间变异。所有程序，包括激光切口和皮下外泌体注射，均由对组分配不知情的外科医生执行。组织学染色和定量分析也由2名独立的、盲法的病理学家进行，以确保无偏见的评估。

外泌体给药：切口后立即在伤口床和边缘皮下注射0.1 mL指定的外泌体制剂，使用胰岛素注射器。对照组未接受注射。选择皮下递送以维持局部囊泡保留，并最大限度减少唾液或机械活动导致的位移。EXOLINE和GLOW的确切分子组成、尺寸分布和浓度是制造商的专有信息，未公开，这限制了机制解释。

组织学和免疫组织化学分析：在激光切口和外泌体给药后立即收集基线样本，代表治疗前的残留微血管活动，这些样本用作参考。为评估血管生成活性，将舌伤口的组织标本立即固定在10%中性缓冲甲醛中24小时，随后进行常规脱水并包埋在石蜡中。每个标本纵向定向，保留上皮、黏膜下层和潜在肌肉的结构。使用校准的切片机获得5微米厚的连续切片，收集每第五个切片以确保整个伤口区域的代表性采样。切片安装在带正电荷的载玻片上，并在37°C下干燥过夜，以增强组织附着。为捕捉血管生成反应的空间异质性，从每个伤口的不同水平获得多个连续切片（3-5个），确保中央和外周区域的代表性。标本预先标记以保持一致的纵向定向，允许所有样本中上皮、黏膜下层和肌肉的可重复对齐。

免疫组织化学染色专门用于评估CD31（PECAM-1）表达作为内皮细胞和血管生成的标记。使用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）在95°C下进行20分钟的热诱导抗原修复。然后将切片与单克隆抗CD31抗体在标准化稀释下孵育，随后使用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶检测系统和3,3'-二氨基联苯胺显色剂来可视化内皮结构。短暂应用苏木精复染以提供核对比，而阴性对照切片省略了主要抗体以确认染色特异性。

血管生成的定量评估系统进行。使用配备数字图像采集的明场显微镜，每切片分析5个随机选择、不重叠的高倍视野（400×）。通过计数离散的CD31+内皮结构确定微血管密度（MVD），并通过测量CD31染色占据的组织面积比例计算血管面积分数。此外，使用半定量量表评估血管的组织和成熟度，捕捉分支模式和管腔形成。所有分析均由2名对治疗分配不知情的病理学家独立进行。使用连续变量的组内相关系数和分类评分的Cohen's κ验证观察者间一致性，以确保可重复性。

为保持方法学严谨性，所有染色、成像和分析程序在各组间标准化。保持试剂、孵育时间和成像参数相同，并随机化载玻片顺序以最小化观察偏见。排除不符合预先定义质量标准的切片，并应用校准标准以确保所有样本间一致的形态测量。

统计分析：使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。双向方差分析评估治疗和时间对CD31-微血管密度和面积分数的影响，采用Tukey事后检验进行两两比较。对非正态数据使用Kruskal-Wallis检验和Dunn事后校正。结果以平均值(SD)表示。显著性设定为P<0.05。

结果

动物耐受性和伤口愈合：所有108只兔子都完成了研究方案，没有并发症。在任何组中均未观察到感染迹象、超出预期手术反应的炎症或全身不良反应。伤口的大体检查表明正常愈合进展，在评估时各组之间上皮闭合没有宏观差异。基线样本在激光切口和外泌体注射后立即收集。虽然组间早期存在统计学显著差异，但这些可能反映了轻微的组织变异性、手术操作或初始PDNV分布，而不是有意义的血管生成效应，因为CD31介导的血管生成需要数小时到数天才能发展。

CD31表达和微血管密度：CD31的免疫组织化学评估显示实验组间内皮细胞增殖和血管生成的显著差异。所有伤口中都观察到CD31阳性结构，表明活跃的血管生成。微血管密度（MVD）的定量评估表明，与GLOW和对照组相比，EXOLINE处理的伤口在所有时间点均具有显著更高的MVD（P<0.05）。GLOW组表现出中等MVD，显著高于对照组但低于EXOLINE。对照伤口始终表现出稀疏的CD31阳性结构和有限的血管生成，反映了激光诱导伤口中的基础血管生成活性。

血管面积分数：通过血管面积分数评估的CD31+血管占据的组织比例遵循类似模式。EXOLINE处理在每个时间点产生最大的面积分数，表明伤口床内更广泛的血管化。与对照组相比，GLOW处理的伤口表现出中等增加，但血管面积分数显著低于EXOLINE处理的伤口（P<0.05）。这种模式在伤口的中央和外周区域一致，证实了EXOLINE的均匀血管生成增强。

血管成熟和组织：血管组织的半定量分析显示血管形态的差异。EXOLINE处理的伤口显示出形成良好、具有管腔的血管，具有分支网络和组织良好的内皮排列，表明血管成熟增强。GLOW处理的伤口显示出中等血管组织，管腔较小，分支较少。对照伤口表现出不成熟、稀疏分布的血管，结构组织有限。这些发现表明，EXOLINE不仅增加了血管数量，还促进了新生血管架构的质量改进。

可重复性和观察者一致性：2名盲法病理学家的独立分析证实了高可重复性。MVD和血管面积分数的组内相关系数超过0.90，而血管成熟评分的κ为0.85，表明观察者间可靠性极佳。

讨论

本研究调查了2种植物源性外泌体配方EXOLINE和GLOW在兔舌伤口中的血管生成潜力，使用CD31免疫组织化学作为主要终点来量化内皮增殖和血管生成。选择CD31是因为它对内皮细胞的高特异性和在实验和临床组织学研究中作为评估微血管密度和组织的可靠标记的广泛使用。通过专门关注CD31，我们旨在提供客观、可重复和可量化的血管生成测量，避免其他非特异性染色方法的混淆解释。我们的发现表明，EXOLINE在伤口愈合的关键早期阶段始终促进比GLOW和未处理对照组更高的微血管密度和血管面积分数，证明其卓越的血管生成功效。这些结果支持植物源性外泌体作为血管生成调节剂的潜力，促进受损组织中早期内皮激活、增殖和有组织的血管形成。CD31因其对内皮细胞的高特异性和微血管密度和组织的可重复量化而被选择。未包括互补标记（例如，α-平滑肌肌动蛋白、血管内皮生长因子、灌注检测）；在解释血管成熟时应考虑这一限制。

EXOLINE和GLOW之间观察到的差异功效可能归因于它们外泌体含量的差异，包括已知影响内皮细胞行为的不同生长因子、microRNAs和信号分子的谱。EXOLINE可能含有更高浓度的促血管生成microRNAs或蛋白质，可加速内皮增殖和血管出芽，而GLOW可能因效力较低的货物而引发更温和的反应。选择早期评估（第3天和第7天）专门用于捕获血管生成的启动和早期成熟，反映急性组织损伤中血管生成激活的动力学。使用标准化的植物源性损伤模型确保了伤口大小和深度的均匀性，而外泌体的皮下给药允许靶向递送，最小化口腔中扩散或机械位移导致的变异性。

严格的组织学和免疫组织化学方法进一步加强了我们发现的有效性。一致定向的连续切片、从伤口中央和外周区域收集多个切片，以及2名独立病理学家的盲法定量分析减少了取样偏见并确保了可重复性。微血管密度和血管面积分数的定量形态测量评估，加上血管组织的半定量评估，提供了对每种外泌体配方诱导的血管生成程度和质量的全面理解。这些方法反映了临床前组织学研究的最佳实践，并增强了研究结果的转化价值。

本研究结果对再生医学和美容临床应用具有重要意义。增强血管生成是伤口愈合、组织重塑和移植物整合的关键步骤，这与皮肤病学、口腔外科和整形外科相关。EXOLINE的优越血管生成活性表明其在加速组织修复、减少愈合时间以及改善手术或创伤性损伤结果方面的潜在用途。然而，将这些发现转化为人类临床应用将需要全面的安全性评估、剂量优化和机制途径确认。未来研究应调查植物源性外泌体的分子货物，探索与其他再生疗法的协同效应，并评估长期血管功能和组织整合。

本研究有几个局限性。首先，依赖CD31染色提供血管存在和密度的信息，但不提供功能参数，如灌注、周细胞覆盖或长期血管稳定性。其次，仅使用早期评估（第3天和第7天），无法评估血管重塑、回归或耐久性。第三，虽然兔舌模型提供可重复性，但它并未完全复制人类口腔或皮肤伤口愈合，就血管架构、组织厚度、免疫相互作用和机械力而言。第四，未表征EXOLINE和GLOW的分子组成，使它们不同血管生成效应的机制基础变得推测性；需要详细的蛋白质组学、脂质组学或microRNA分析来阐明它们的生物活性货物。第五，缺乏假注射对照意味着皮下注射的机械效应可能促成了血管生成变化。基线差异可能反映轻微的生物变异性或程序因素，而不是真实的治疗效果。最后，未评估功能愈合结果，如灌注、上皮闭合和胶原沉积，限制了转化解释。总的来说，这些局限性突显了未来研究的必要性，这些研究应纳入假对照、功能血管检测、更长的随访、分子表征，并在更接近人类组织的模型中进行验证，然后再进行临床转化。

结论

EXOLINE植物源性外泌体显著增强兔舌伤口中的血管生成，表现为增加的CD31+微血管密度和血管面积分数，优于GLOW。这些发现突显了植物源性外泌体促进早期内皮增殖和有组织的血管形成的潜力，支持其在组织修复和再生医学中的应用。需要进一步研究以评估长期血管功能、分子机制和临床可转化性。

伦理声明

所有实验程序均按照ARRIVE 2.0指南进行临床前研究。动物处理、饲养、麻醉和手术程序均按照国际公认的动物研究伦理标准进行，以最大限度减少疼痛、痛苦和使用的动物数量。

参考文献

1. Chuhuaicura P, Rodríguez-Niklitschek C, Oporto GH, Salazar LA. 口腔黏膜伤口愈合中的不同分子机制：转化见解和未来方向. 国际分子科学杂志. 2025;26(21):10660.
2. Yuan H, Chlipala GE, Bangash HI, et al. 人类腭部伤口愈合的动态及其相关微生物组. 牙科研究杂志. 2025;104(1):97-105.
3. Azmy E, El-Zehary RRA, Ibrahim FMM, Denewar M. 金纳米颗粒和骨髓干细胞在舌缺损再生中的协同潜力（大鼠实验研究）. 口腔颌面外科杂志. 2025;29(1):147.
4. Zhang T, Yuan M, Hao X, et al. 促进口腔内伤口愈合的创新生物材料：机制、应用和挑战. Materials Today Bio. 2025;35:102470.
5. Okuyama K, Debnath KC, Islam S, Yanamoto S. 从伤口覆盖到功能愈合：头颈部黏膜缺损中生物材料应用的叙述性综述. 头颈部. 2025;47(11):3201–3208.
6. Santamaria MP, Mathias-Santamaria IF, Ferreira Bonafé AC, et al. 与腭部伤口愈合相关的微生物组和炎症生物标志物. 牙周研究杂志. 2025;60(7):664-675.
7. Tong W, Ren J, Yao X, et al. 促进腭部伤口愈合的生物材料策略. Front Bioeng Biotechnol. 2025;13:1646629.
8. de Pauli Paglioni M, Pedroso CM, Faustino ISP, et al. 二极管激光手术与传统手术刀手术在口腔白斑手术治疗中的伤口愈合和疼痛评估：随机对照试验. Front Oral Health. 2025;6:1568425.
9. Hovav OV, Read T, David M, Sparks DS. 带神经的游离皮瓣进行舌重建的治疗结果的系统评价和荟萃分析. Microsurgery. 2025;45(7):e70120.
10. Kawasaki K, Harada K, Ferdous T, et al. 老化大蒜提取物对乙酸和5-氟尿嘧啶诱导的小鼠口腔黏膜炎的愈合作用. J Clin Med Res. 2025;17(10):582-594.
11. Alani NA, Abdullah BH. 正常和炎症牙髓中血管生成、淋巴管生成和神经组织的差异调控：免疫组织化学分析. Diagnostics (Basel). 2025;15(14):1819.
12. Wu R, Guo J, Liu Y, Huang S, Wu P, Liu W. 人羊膜间充质干细胞通过Ang-1/Tie-2信号通路促进阿尔茨海默病模型中的血管生成. J Alzheimers Dis. 2025;106(2):646-652.
13. Chillà A, Anceschi C, Scavone F, et al. 通过脉冲激光驱动CO2还原反应获得富含一氧化碳的金纳米颗粒促进血管生成. J Nanobiotechnology. 2025;23(1):590.
14. Haykal D, Wyles S, Garibyan L, Cartier H, Gold M. 外泌体在美容皮肤病学中的应用：益处和挑战综述. J Drugs Dermatol. 2025;24(1):12-18.
15. Nahm WJ, Nikas C, Goldust M, et al. 外泌体在皮肤病学中的应用：当前应用、临床证据和未来方向的综合综述. Int J Dermatol. 2025;64(11):1995-2010.
16. Aryal S. 皮肤病学中的外泌体疗法. Aesthetic Plast Surg. 2025;49(21):6168-6179.
17. Rahman E, Webb WR, Rao P, et al. 外泌体曝光：关于美学和再生医学中证据与期望的系统综述. Aesthetic Plast Surg. 2025;49(2):557-568.
18. Lee YS. 通过基于外泌体的疗法实现再生皮肤重塑：一项展示21个月持续效果的病例研究，包括毛孔大小、红斑和色素沉着. Dermatol Ther (Heidelb). 2025;15(10):3055-3064.
19. Mahmoud RH, Peterson E, Badiavas EV, Kaminer M, Eber AE. 外泌体：执业皮肤病学家的综合综述. J Clin Aesthet Dermatol. 2025;18(4):33-40.
20. Rahman E, Sayed K, Rao P, et al. 外泌体革命还是营销幻觉？基于AI的多领域评估：主张、科学证据、透明度、公众情绪和媒体报道. Aesthetic Plast Surg. 2025;49(12):3454-3479.
21. Azizi A, Mousavi Zadeh SE, Shokouhi Mostafavi SK, Vahedi M. 比较光动力疗法与660和450纳米激光以及冷大气等离子体对白色念珠菌的效果：体外研究. J Lasers Med Sci. 2025;16:e29.
22. Altayeb W, Luk K, Arnabat-Dominguez J, Abdullah A, Darkazali R, Hamadah O. "使用450纳米二极管激光进行激光辅助牙龈黑色素脱色：消融与非消融技术的随机临床试验". Lasers Med Sci. 2025;40(1):509.
23. Al-Jaberi M, Atshan SS, Zouiten S. 不同二极管激光波长在根管治疗中靶向粪肠球菌生物膜的有效性. Rev Recent Clin Trials. 2025年10月7日在线发表.
24. Mohan Falah J, Taher HJ, Jasim Ali A. 650纳米和450纳米二极管激光在拔牙后伤口愈合的光生物调节中的比较分析. Lasers Med Sci. 2025;40(1):391.
25. Rezaei F, Shakoori S, Fazlyab M, Esnaashari E, Savadkouhi ST. 低强度激光对人牙髓干细胞增殖、血管生成和牙本质分化的影响. BMC Oral Health. 2025;25(1):441.
26. Ganapathy A, Chen Y, Bakthavachalam V, George A. DMP1介导DPSCs转化为CD31+/CD144+细胞证明了体外和体内内皮表型. Front Cell Dev Biol. 2025;13:1630129.
27. Jin MY, Lin XY, Wang Y, et al. 一种新的血管生成相关生物标志物神经纤毛蛋白-1在瘢痕疙瘩中的意义. Mol Biotechnol. 2025年7月19日在线发表.
28. Teufelsbauer M, Stickler S, Eggerstorfer MT, Hammond DC, Lang C, Hamilton G. 脂肪移植物血管生成潜力的标志物. Wien Klin Wochenschr. 2025;137(21-22):684-692.

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