引言
胃肠道（GI）从口腔到直肠的微生物组对宿主生理至关重要，早期定植与宿主代谢和免疫功能的发展平行。肠道定植模式异常与早期发病的非传染性疾病发展相关，从而强调了生命早期定植的重要性和长期影响。值得注意的是，新兴研究表明口腔微生物编程与全身性疾病相关。胃肠道微生物组在生命最初几年中经历组成和功能的变化，最终形成相对稳定的微生物群落，这一过程由环境暴露、早期饮食、微生物相关和宿主相关因素之间的相互作用驱动。
分娩方式对口腔和肠道微生物组的建立有相当大的影响。阴道分娩（VD）婴儿的首次微生物暴露来自阴道和肛周微生物组。因此，VD婴儿最初由来自阴道、肠道和皮肤的微生物定植，而剖腹产（CS）分娩的婴儿通常获取环境和皮肤微生物。此外，CS分娩婴儿的肠道微生物组逐渐获得更复杂的微生物组的过程比VD婴儿慢。VD足月婴儿肠道的非常早期定植主要由需氧菌和兼性细菌主导。随着氧气消耗，条件变得有利于厌氧细菌的生长，这一过程与饮食无关。一旦建立母乳喂养，它将导致富含双歧杆菌的肠道微生物组，因为人乳富含生物活性成分，如人乳寡糖，这些成分特别适合促进健康的肠道定植。
尽管人乳和阴道及粪便微生物组影响婴儿GI微生物组的建立，但估计婴儿GI道中很大一部分细菌群落来源于未知来源。直到最近，来自父亲的微生物暴露的贡献在很大程度上被忽视。
我们假设除了母亲外，伴侣也对后代早期生命GI微生物组的建立有所贡献。我们重点关注母体和父体（或共同父母）暴露，包括人乳，对婴儿口腔和粪便微生物组在两个早期时间点（即出生后48小时内和1个月大时）建立的影响。
方法
研究参与者
FLORA研究是北瑞典出生队列研究（NorthPop）的一个子研究，NorthPop是瑞典北部Västerbotten县正在进行的前瞻性基于人群的研究。父母在妊娠14-24周的常规超声检查时被邀请参与。纳入标准为：年龄≥18岁的孕妇，理解瑞典语，妊娠14至24周的可行妊娠，有意在接下来的几年中分娩并居住在服务区域内。从2018年10月到2021年2月，已同意参与NorthPop的孕妇及其在Umeå地区更大的伴侣（n = 2112），被邀请参与FLORA研究，该研究包括孕妇的额外口腔、粪便和阴道采样，以及伴侣的口腔和粪便采样。
数据收集
数据使用基于网络的自报告问卷收集，包括妊娠14-24周、26周、34周和35周时父母的人口统计学和背景特征。关于孕周、分娩方式、婴儿性别、出生体重和身长以及新生儿护理的信息，从瑞典新生儿质量登记册、瑞典妊娠登记册和医疗记录中获得。
生物样本收集
孕妇及其伴侣在Umeå大学医院入院分娩当天，在分娩前自行采集样本：孕妇的阴道、直肠和口腔拭子，以及伴侣的直肠和口腔拭子。父母在出生后0-48小时内，在接受指导并在工作人员监督下收集新生儿胎粪样本；由于胎粪排出和临床常规各不相同，此窗口期内的收集时间在婴儿之间有所不同。新生儿口腔拭子在新生儿血液斑点筛查时收集（约出生后48小时）。在1个月大时，父母在家中收集婴儿粪便样本和口腔拭子，并提供人乳样本。
Floqswabs®用于阴道和直肠拭子。拭子分别插入阴道或直肠约4-5厘米，并旋转约10-30秒。采样后，Floqswab放入含有保存和稳定微生物核酸的培养基的eNAT®管中。无菌棉签用于父母和婴儿的口腔拭子。要求母亲在采样前一小时内不要喂养婴儿。拭子擦拭舌头和脸颊内侧，采样后将棉签在含有TE缓冲液的管中搅拌。用新的棉签重复该程序一次，将棉签在同一个管中搅拌。收集约2克的胎粪或粪便到带有螺旋盖附带勺子的无菌粪便管中。人乳在家中的早晨第一次喂食时采样，当婴儿1个月大时。人乳手动或用母乳泵挤出，并收集到无菌50 mL管中。所有样本在-20°C保存，直到送到北瑞典生物库，在那里保存在-80°C直到分析。
细菌DNA提取
DNA提取使用不同商业试剂盒，取决于样本类型，旨在优化不同生物质和抑制含量基质的产量和纯度。低生物质婴儿口腔拭子使用为此类材料优化的试剂盒处理，而高生物质基质如粪便和胎粪则使用基于珠击的方案处理，以确保有效裂解。
16S rRNA基因文库制备、测序、生物信息学和统计分析
测序文库根据地球微生物组计划协议制备，进行了以下修改：融合引物被修改为在正向（341F）和反向（805R）引物上包含条形码序列，并选择靶向V3-V4区域而非V4区域。PCR反应条件为：90°C 15秒和94°C 3分钟，随后进行35个循环的94°C 45秒、50°C 1分钟和72°C 1.5分钟，最后在72°C延伸10分钟。每块PCR板包括阴性对照（无模板水）和阳性对照（模拟微生物群落）。
序列读取数据使用deML进行解复用，随后使用q2-demux进行质量过滤和DADA2插件进行去噪，均在QIIME2环境中进行。测序包括阴性和阳性对照，与研究样本一起处理。初始数据集包括13,441个扩增子测序变体（ASV）和1,945个样本中的35,833,734个解复用序列读取。
ASV使用DADA2的assignTaxonomy函数对GTDB数据库进行分类。在R v4.4.2中使用phyloseq、MicrobiotaProcess、microViz、vegan和ggplot2等R包进行所有下游统计和可视化分析。
结果
研究队列
我们招募了264名孕妇、261名伴侣和266名婴儿。纳入时的平均年龄，即孕妇常规超声检查时的年龄为32（±4.3）岁，其伴侣的相应年龄为34（±5.5）岁。大多数父母出生于瑞典。对于阴道分娩，分娩时的孕周为39.8±1.1周，对于CS分娩则为39.5±1.3周。
队列主要包括健康的孕妇，妊娠糖尿病和尿路感染的病例很少。在孕妇中，88%提供了阴道拭子，93%提供了直肠拭子，90.5%提供了口腔拭子。61.4%在婴儿满1个月时提供了人乳样本。在伴侣中，86.5%提供了直肠拭子，90%提供了口腔拭子。所有266名婴儿都是足月出生，大多数（82%）是阴道分娩。24名新生儿（9.0%）被送入新生儿病房，其中8名（3%）因感染接受了抗生素治疗。虽然大多数婴儿（98%）在1个月大时进行母乳喂养，但198名（74%）是纯母乳喂养。出生后48小时内，收集了91%新生儿的胎粪样本和83%的口腔拭子。在1个月大时，在家中收集了81%婴儿的粪便样本和口腔拭子。
跨家庭和生态位的微生物群落结构
成人肠道和口腔样本中的α多样性显著高于新生儿和婴儿样本。基于中心对数比（CLR）转换的属水平数据的主成分分析（PCA）图显示肠道、口腔和阴道微生物组之间有明显的分离，人乳和口腔样本之间有一些重叠。
β多样性在所有成对比较中显示出显著差异，除了母亲和伴侣口腔拭子之间。母亲和伴侣的直肠拭子有显著差异，β离散分析显示组内变异性有显著差异。母亲和伴侣之间的微生物相似性在补充图中进一步说明。基于Bray-Curtis差异的共现网络强调了生态特异性，在口腔拭子、胎粪样本和阴道拭子中观察到明显且连接紧密的子网络。
细菌组成以比例相对丰度表示，显示孕妇及其伴侣的直肠和口腔拭子的微生物相似性。相比之下，婴儿的微生物组与成人不同，无论是在共享优势分类群的相对丰度上，还是在位点和时间特异性分类群的存在上。胎粪样本富含大肠杆菌和葡萄球菌，而1个月大时的粪便样本显示双歧杆菌的丰度增加。在口腔微生物组中，与成人相比，产后48小时和1个月大时链球菌更为丰富。
分娩方式与出生至一月龄的肠道微生物组多样性
α多样性在VD和CS分娩婴儿之间在任一时间点均无显著差异。VD婴儿从出生到一月龄的α多样性显著增加，而CS分娩婴儿则未观察到这种变化。β多样性分析显示VD和CS分娩婴儿在胎粪（PERMANOVA：p = 0.038）和一月龄粪便样本（PERMANOVA：p = 0.057）的微生物组成存在显著差异。
相对丰度分析显示，两组在出生后约48小时的主要门比例相似。与医院相关的属如Sphingomonas和Staphylococcus在胎粪中更为突出，并在两组中随时间减少，与分娩方式无关。差异丰度分析揭示了与分娩方式相关的特定微生物特征。在胎粪中，VD婴儿中L. crispatus和Finegoldia magna富集，而CS分娩婴儿中Methylobacterium sp.更为丰富。在一月龄时，VD婴儿粪便中双歧杆菌、拟杆菌和副拟杆菌富集，而CS分娩婴儿中链球菌和产气荚膜梭菌更为常见。
分娩方式与早期生命口腔微生物组多样性
在比较每个时间点的分娩方式之间的α多样性时，未观察到显著差异。β多样性分析显示在出生后约48小时存在显著的组成差异（PERMANOVA，p = 0.003），但在一月龄时无显著差异（p = 0.16）。
相对丰度分析表明，随着时间推移和分娩组别，分类组成有细微变化。差异丰度分析确定Blautia_A在VD婴儿出生后48小时内的口腔拭子中显著富集。为了提供背景，我们在系统发育树布局中可视化了VD新生儿口腔和父母直肠拭子之间的共享Blautia_A ASV。在新生儿口腔拭子中，Blautia_A在57/219（26%）VD婴儿和6/47（13%）CS婴儿中被检测到。
讨论
在这一基于人群出生队列的探索性研究中，我们分析了母亲-伴侣-婴儿三元组的肠道和口腔微生物组，以绘制群落结构并探索跨生态位和时间点的生态重叠。正如先前研究预期的那样，婴儿的GI微生物组不仅在优势分类群的相对丰度上与成人不同，而且在位点和时间特异性分类群的存在上也不同，突显了生命早期微生物定植的动态性质。虽然孕妇及其伴侣在直肠和口腔样本中共享总体微生物组结构，但存在细微但一致的差异。明显的位点分离与从出生开始由身体部位强生态结构一致。
重要的是，本研究被设计为描述性调查，以绘制微生物群落结构并探索跨生态位和时间点的潜在生态重叠。鉴于16S rRNA基因测序的局限性——特别是其无法解析菌株水平变异——我们的发现应解释为指示共享微生物模式，而不是垂直传播或因果关系的确凿证据。
生命早期的胎粪样本富含大肠杆菌和葡萄球菌，L. crispatus成为VD新生儿中与分娩相关的特征分类群。L. crispatus是健康妊娠中阴道中的主要共生菌，一直与出生时的母婴微生物连续性相关联。我们专注于这个位点受限的、特征明确的物种，因为它提供了与分娩相关暴露的保守标记。在VD胎粪中的检测，以及在相应母体阴道拭子中的存在，与母体来源和出生期间的生态转移一致。到一个月大时，L. crispatus的丰度下降，其他分类群根据分娩方式变得差异丰富。VD婴儿的粪便样本显示双歧杆菌、拟杆菌和副拟杆菌的水平较高，而CS分娩婴儿中链球菌和产气荚膜梭菌更为常见。
大多数关于生命早期微生物定植的研究主要集中在肠道，而口腔微生物组相比之下研究较少。然而，口腔是出生后最早定植的黏膜表面之一，可能反映母体和环境暴露。在这项研究中，我们包括了早期口腔拭子以及胎粪和粪便样本，以提供更广泛的微生物获取生态视图。Blautia_A，一个通常与肠道微生物组相关的属，在VD新生儿的口腔微生物组中比CS新生儿在生命最初48小时内更丰富。Blautia ASV也在胎粪和父母直肠拭子中被检测到，表明可能在出生期间引入的跨位点发生。
在这项研究中，我们独特地包括了母亲和伴侣的微生物组样本，使我们有机会探索更广泛的家族微生物环境。我们假设伴侣可能对新生儿微生物组有独特贡献，特别是在CS分娩婴儿中。在我们的环境中，CS分娩的婴儿在母亲仍在手术中时与伴侣进行早期皮肤接触是常见的临床实践。然而，由于母亲和伴侣在肠道和口腔生态位中微生物组的高度相似性，我们无法识别伴侣特定的微生物特征。这表明，虽然伴侣可能影响早期微生物暴露，但用当前测序分辨率区分其贡献仍然具有挑战性。
结论
总体而言，我们的研究结果表明，分娩方式和父母微生物组影响肠道和口腔微生物组的非常早期组成。尽管预期伴侣可能对新生儿微生物组有独特贡献，但在本队列中，伴侣和母体微生物组图谱高度相似，使得使用16S rRNA基因扩增子测序难以识别独特的伴侣特定影响。这些发现来自一项基于人群的前瞻性研究，使用16S rRNA基因扩增子测序，为生命早期微生物组图谱提供了有价值的见解。虽然这种方法提供了广泛的分类覆盖，但未来研究中的更高分辨率测序和扩展的协变量分析将有助于解析家庭内的微妙微生物贡献，并进一步阐明其对婴儿健康的潜在影响。
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