纳豆激酶在大脑中动脉闭塞大鼠模型中减轻急性脑梗死Nattokinase Attenuates Acute Cerebral Infarction in a Rat Model of Middle Cerebral Artery Occlusion | In Vivo

纳豆激酶在大脑中动脉闭塞大鼠模型中减轻急性脑梗死

作者：TAKASHI TANIKAWA, JAMES YU, KATE HSU, SHINDER CHEN, AYAKO ISHII, MASASHI KITAMURA

摘要

背景/目的：纳豆激酶（NK）是一种具有溶栓、抗炎和抗氧化等多种药理活性的强效丝氨酸蛋白酶。本研究旨在探讨NK在短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）所致脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用，并阐明其作用机制。

材料与方法：大鼠在MCAO手术前连续7天每日口服NK（65和130 mg/kg体重）。评估MCAO模型大鼠的梗死体积、行为学测试、凝血时间及抗氧化标志物。检查多种细胞通路在NK作用中的参与情况。

结果：NK治疗剂量依赖性地减少MCAO模型大鼠的梗死体积并延长凝血时间。转录因子活性分析显示，NK参与核因子红系2相关因子2（Nrf2）活性的增强，并促进MCAO后抗氧化酶的表达。

结论：口服纳豆激酶通过Nrf2相关的抗氧化调节和温和的短暂抗凝作用，在实验性脑缺血后提供早期神经保护，支持其作为缺血性卒中口服辅助治疗的潜力。

关键词：纳豆激酶；Nrf2；大脑中动脉闭塞（MCAO）；抗氧化

引言

血管疾病是全球死亡和残疾的主要原因。脑梗死的发病率很高，且会显著降低患者的生活质量（1）。大脑中动脉闭塞（MCAO）是一种常见且严重的脑梗死形式，其中脑血流受阻，导致神经元坏死和明显的神经功能缺损（2）。血管疾病给社会和经济带来沉重负担，因为患者通常需要长期康复和护理。

目前MCAO的治疗方法，如溶栓治疗和机械取栓术，能有效恢复血流，但这些方法的局限性在于治疗时间窗窄（3,4）以及严重出血并发症的风险（5,6）。因此，迫切需要更安全、更有效的MCAO治疗方案。

纳豆是一种传统的日本发酵食品，含有一种称为纳豆激酶（NK）的酶。NK是由枯草芽孢杆菌纳豆变种在发酵过程中产生的一种蛋白酶（7）。NK的溶栓活性最先被确定，它通过激活纤溶酶原和促进纤维蛋白溶解来实现（8）。口服NK在大鼠模型中显著抑制血栓形成（9）。NK通过肠道吸收并产生全身性溶栓作用，支持其作为口服治疗剂的应用（10）。

NK除了溶栓作用外，还具有抗炎、抗氧化和神经保护作用。例如，NK通过抑制NOX2和TLR4激活，抑制脂多糖诱导的炎症和氧化应激，从而减少ROS产生和NF-κB激活（11）。在脑梗死模型中发现了纳豆激酶的神经保护作用（12）。这些发现表明NK是预防和治疗缺血性中风的多功能候选治疗药物。

MCAO相关死亡率高，若未及时接受治疗，后遗症严重。鉴于人口老龄化导致脑血管疾病患病率增加，需要开发安全、可持续且可口服的治疗方法。关于NK溶栓和神经保护特性的基础研究已取得进展，但NK临床应用的证据尚不充分。

本研究旨在通过关注NK的疗效、安全性和作用机制，确定NK在MCAO中的治疗潜力。这些发现有助于为脑梗死及相关血栓性疾病开发实用的治疗方案，从而提高患者的生活质量。

材料与方法

动物与分组。雌性Long Evans大鼠（体重212.6-331.1 g）购自国家实验动物中心。所有动物均在受控条件下饲养（相对湿度50-70%，温度20-24°C），可自由获取食物，并采用12小时光照/黑暗周期。大鼠随机分为四组，每组5只：假手术组、MCAO组和两个治疗剂量组。大鼠在手术前连续7天每天口服一次去离子水（对照组）或两种剂量的NK（65 mg/kg和130 mg/kg体重）。建立MCAO大鼠模型以诱导脑缺血。MCAO建立后，持续给药直至处死。

伦理批准。所有动物实验均经动物实验批准规定（IACUC-2017-SH-007）批准，并按照Trineo生物技术有限公司的动物实验规定和动物实验委员会规定（批准号：IACUC-2017-SH-007）进行。研究设施经台湾认证基金会认可，并认证为符合良好实验室实践规范的临床前检测实验室（证书号：GLP-0031）。

MCAO手术。所有手术均在腹腔注射450 mg/kg水合氯醛麻醉下进行。手术期间使用加热垫维持大鼠体温恒定。在颈部正中切开，将颈动脉与迷走神经分离并游离。然后从暴露的脑区暴露大脑中动脉（MCA）。使用10-0手术缝线结扎MCA直至完全闭塞。双侧颈总动脉用微血管夹暂时阻断60分钟，然后松开颈总动脉夹以恢复血流。所有切口均用4-0手术缝线缝合。假手术组大鼠接受与其他组相同的麻醉和手术操作，但不进行闭塞。

梗死体积分析。大鼠在MCAO术后第4天或第8天处死。立即取出大脑测量梗死体积。从额极开始将大脑切成2 mm厚的冠状切片。将切片在2%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液中于37°C孵育30分钟，然后用10%甲醛固定。使用Image J v1.50软件（NIH）测量梗死面积，并将面积乘以切片厚度以计算梗死体积百分比，公式如下：（总脑体积 - 梗死脑体积）/ 总脑体积 × 100。

步态分析。使用CatWalk XT（Noldus信息技术公司，荷兰瓦赫宁根）分析大鼠非强迫运动时的步态。CatWalk XT可量化动物足迹。量化的步态参数包括最大接触平均强度[任意单位（a.u.）；一只爪子与地板接触时在最大接触点施加的平均压力]、站立时间（s；爪子与玻璃板接触的持续时间）和步频（步数/秒；试验中步数的频率）。步频通过CatWalk XT软件计算，公式为步数除以（最后一步的初始接触时间减去第一步的初始接触时间）。

血液凝固试验。为确定NK剂量对凝血的影响（不进行MCAO），将大鼠随机分为两组，分别为13 mg/kg和65 mg/kg，每组3只。大鼠连续5天每天口服一次NK。在第0天和第5天收集大鼠血液。血液样本从尾静脉采集，分离血浆。血浆保存至进行血液凝固试验，测定凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）。

对于MCAO实验，在术后第4天和第8天收集大鼠血液样本。测量凝血时间、PT、APTT和血浆组织型纤溶酶原激活剂（tPA）水平，以评估NK对缺血后凝血的影响。凝血时间测试通过将毛细血管血样收集到微量血细胞比容玻璃毛细管中进行。当血液接触玻璃毛细管时开始计时。通过将毛细管交替倾斜至相对于水平面+60°和-60°，使血液在重力作用下在管上相距45 mm的两个标记之间流动，直至血液停止流动，此时视为反应终点。PT和APTT测试使用无血小板血浆样本，在自动血液凝固分析仪（Sysmex CA-600系列）上进行。

生化分析。使用tPA ELISA试剂盒（Abcam，英国剑桥）测量血浆组织型纤溶酶原激活剂（tPA）水平，按照说明书操作。使用自动临床化学分析仪（东芝TBA-25FR，日本东京）测量血清和脑组织匀浆中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。

转录因子活性分析。使用试剂盒（Cayman化学品公司，美国密歇根州安娜堡）进行各组脑组织匀浆中Nrf2的转录因子-DNA结合活性分析，按照说明书操作。

简要来说，将10 μg核蛋白加入含有特定dsDNA序列的孔中，在4°C下孵育过夜。将抗Nrf2的一抗加入各孔，室温孵育1小时。每孔用稀释的洗涤缓冲液冲洗两次，每次30分钟。然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1小时。通过向每孔中加入含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的显色液，并在室温下孵育45分钟，来定量转录因子结合活性。使用分光光度法在450 nm处测量吸光度，使用酶标仪（FLUOStar，BMG，德国奥滕贝格）进行。

基因表达分析。通过收集各组脑组织匀浆，提取RNA（Illustra RNAspin Mini Kit，GE Healthcare，美国芝加哥），并合成cDNA。使用StepOne Plus实时PCR系统（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）分析四种不同抗氧化酶：血红素加氧酶-1（HO-1）、NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTP1）和超氧化物歧化酶3（SOD3）的基因表达，按照制造商提供的方案进行。

统计分析。实验数据以平均值和标准差（mean ± S.D.）表示。组间数据比较采用非参数单侧Mann-Whitney检验。统计学显著性设定为p<0.05。

结果

NK保护缺血诱导的脑损伤。使用MCAO大鼠作为脑缺血模型，评估NK对缺血性脑损伤的影响。已有报道，NK给药后健康男性患者的APTT延长（13）。通过给正常大鼠连续5天服用NK，确定合适的NK剂量。在第0天和第5天收集大鼠血液，测量血液参数。给予65 mg/kg NK改变了APTT，但该剂量不影响PT（图1）。

图1. 纳豆激酶给药对各组大鼠凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）的影响。大鼠连续5天每天口服13或65 mg/kg纳豆激酶。PT（A）和APTT（B）血液凝固试验结果。*p<0.05。所有值均表示为mean±S.D.（n=3）。

在体内给予65和130 mg/kg的NK以研究其疗效和潜在作用机制。在MCAO前给药期（7天）内，所有大鼠在65或130 mg/kg NK剂量下均未出现任何不良临床效应（数据未显示）。每个对照组（术后第4天和第8天）中各有一只大鼠在MCAO后预定处死前死亡。其余大鼠在MCAO后未出现严重不良效应。

组织病理学分析显示，MCAO组白色梗死面积明显大于假手术组（图2）。相反，NK治疗组的梗死面积明显小于MCAO对照组。与基线相比，给予65和130 mg/kg NK在MCAO后第4天和第8天显著减少了梗死体积。通过使用CatWalk XT测试大鼠步态行为评估神经功能，在术后第8天处死前进行。65 mg/kg组左后肢最大接触平均强度显著高于对照组（图3）；但其他参数在各组间无显著差异（数据未显示）。

图2. 各组大鼠脑梗死体积的变化。（A、B）使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色观察大鼠卒中后第4天（A）或第8天（B）的梗死体积。（C、D）大鼠卒中后第4天（C）或第8天（D）的梗死区域体积。*p<0.05。所有值均表示为mean±S.D.（n=4-5）。

图3. 纳豆激酶治疗对步态特征的影响。大脑中动脉闭塞后第8天，四肢最大接触平均强度的变化，（A）右前肢和右后肢，（B）左前肢和左后肢。所有值均表示为mean±S.D.（n=4-5）。

这些结果表明，口服NK可减少缺血性损伤后的脑梗死体积，并部分改善运动功能，提示其对MCAO大鼠具有轻微但显著的神经保护作用。

NK延长MCAO模型大鼠的凝血时间。通过测量MCAO后第4天和第8天的凝血时间、PT、APTT和血浆tPA水平，评估NK对大鼠凝血系统的影响。与对照组相比，术后第4天，65 mg/kg和130 mg/kg组的凝血时间显著延长（p<0.05），表明NK具有短暂的抗凝作用（图4）。在此时间点，130 mg/kg组的APTT也更长，而所有组的PT和血浆tPA水平均保持不变。在术后第8天，各组之间的任何参数均未观察到显著差异（图4）。这些结果表明，NK发挥温和、短暂的抗凝作用，主要表现为凝血时间延长，而非经典凝血因子或tPA介导的纤维蛋白溶解的改变。

图4. 纳豆激酶治疗对血液凝固的影响。大脑中动脉闭塞后第4天（A）和第8天（B）的凝血时间、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）和组织型纤溶酶原激活剂（tPA）。*p<0.05。所有值均表示为mean ± S.D.（n=4-5）。

NK降低MCAO模型大鼠的LDH释放。通过测量MCAO大鼠血清中的LDH水平来评估神经元损伤的程度。与对照组相比，术后第4天，130 mg/kg NK治疗组的LDH活性较低。65 mg/kg NK治疗组的LDH活性与对照组相比无明显差异（图5）。这些发现表明，NK对缺血诱导的细胞毒性发挥了部分保护作用，表现为高剂量组LDH释放减少。

图5. 纳豆激酶治疗对每组LDH活性的影响。大脑中动脉闭塞后第4天（A）和第8天（B）的血清LDH水平。*p<0.05。所有值均表示为mean±S.D.（n=4-5）。

NK促进MCAO模型大鼠的Nrf2活性。Nrf2是在氧化应激下激活的关键转录因子（14）。使用ELISA分析NK治疗对脑内Nrf2 DNA结合活性的影响。在第8天，65 mg/kg NK组的Nrf2活性显著高于对照组（图6）。

图6. 纳豆激酶治疗对每组转录因子Nrf2活性的影响。大脑中动脉闭塞后第4天（A）和第8天（B）的转录因子Nrf2活性。*p<0.05。所有值均表示为mean±S.D.（n=4-5）。

NK调节MCAO模型大鼠的抗氧化酶表达。在MCAO后第4天和第8天，检测了NK治疗对四种不同抗氧化酶（包括HO-1、NQO1、GSTP1和SOD3）基因表达的影响。在术后第4天，两个NK治疗组（65 mg/kg和130 mg/kg）的SOD3表达水平均显著高于对照组（图7）。130 mg/kg NK组的GSTP1表达水平显著高于对照组和65 mg/kg NK组。然而，在术后第8天，各组间HO-1、NQO1、GSTP1和SOD3的表达水平均无显著差异（图7）。结果表明，NK调节Nrf2通路激活，并剂量依赖性地影响MCAO诱导的缺血性脑损伤大鼠中SOD3和GSTP1的表达水平。

图7. 纳豆激酶治疗对每组抗氧化酶基因表达水平的影响。大脑中动脉闭塞后第4天（A）和第8天（B）大鼠脑中HO-1、GSTP1、NQO1和SOD3相对表达水平的定量分析。*p<0.05。所有值均表示为mean±S.D.（n=4-5）。

讨论

与先前显示NK在溶栓卒中模型中具有神经保护功效的发现（12）一致，本研究进一步证实了其减轻缺血性损伤的潜力，可能通过互补的血管和抗氧化机制实现。在先前的研究中，NK在MCAO再灌注后4小时和1-2天给予Wistar大鼠，通过降低自由基水平和增强Janus激酶1和一氧化氮的表达来减轻卒中后脑损伤（12）。

在我们的研究中，与对照组相比，口服NK预处理显著减少了MCAO大鼠的梗死体积，证实了NK给药的抗缺血效应（图2）。NK治疗还导致步态参数的有限改善，在术后第4天短暂延长凝血时间，且未改变PT或血浆tPA，在高剂量组术后第4天降低LDH水平，并增加大鼠的Nrf2 DNA结合活性。这些结果共同表明，NK治疗发挥部分和有时间依赖性的神经保护作用。

这些发现提示，NK主要通过内源性调节抗氧化酶表达发挥效应，而非通过直接溶栓。激活Nrf2（细胞对氧化应激反应的主要调节因子）意味着NK增强急性缺血期后的氧化还原稳态，从而限制继发性神经元损伤。

Nrf2/HO-1通路在体外和体内细胞防御氧化应激中起着关键作用（14）。核Nrf2是一种转录因子，可诱导多种抗氧化酶（如HO-1、NQO1和GST）的表达。与此激活一致，下游抗氧化酶的mRNA表达分析显示，在术后第4天，SOD3和GSTP1的表达水平显著且剂量依赖性地上调，而HO-1和NQO1的表达水平保持不变。Elbakry等人（15）也报道了类似发现，他们证明NK通过激活大鼠的Nrf2/HO-1通路并抑制炎症介质，减轻了肝脏和神经毒性。这一发现表明，NK部分或阶段依赖性地激活Nrf2通路，反映了缺血性损伤后的早期抗氧化适应。

在术后第4天观察到大鼠凝血时间短暂增加，而PT或tPA无变化，表明存在一种温和的抗凝转变，可增加微循环再灌注，而不增加全身出血风险。这种暂时效应与先前描述NK通过降解纤维蛋白和激活纤溶酶介导的纤维蛋白溶解活性的报告一致。然而，我们的发现表明，NK对凝血的生理影响是温和且可逆的。

总之，NK是一种多功能但温和的神经保护剂，在早期再灌注阶段发挥作用。未来的研究应使用药理学抑制或基因沉默方法验证NK激活Nrf2的因果作用，确定口服NK的药代动力学-药效学关系，并评估NK治疗的长期结局，如行为恢复和血管重塑。

结论

口服NK主要通过Nrf2介导的抗氧化调节和短暂的抗凝作用，在脑缺血后提供早期阶段的神经保护。这些结果支持NK作为安全、可口服的辅助手段，用于预防或减轻缺血性卒中损伤的潜力。

脚注

作者贡献：概念构思，T.T., J.Y., 和 M.K.；方法学，J.Y., K.H., 和 S.C.；正式分析，T.T. 和 M.K.；监督指导，T.T. 和 M.K.；初稿撰写，T.T. 和 M.K.；审阅与编辑，T.T., J.Y., K.H., S.C., A.I., 和 M.K.。所有作者均已阅读并同意文章的发表版本。

利益冲突：作者声明与本研究无利益冲突。

资助：不适用。

人工智能（AI）披露：在准备本手稿期间，大型语言模型（ChatGPT，OpenAI）仅用于部分段落的语言编辑和风格改进。没有涉及研究数据生成、分析或解释的章节由生成式AI产生。所有科学内容均由作者创建和验证。此外，没有使用生成式AI或基于机器学习的图像增强工具生成或修改任何图形或视觉数据。

收稿日期：2025年11月19日。

修回日期：2025年11月30日。

录用日期：2025年12月1日。

版权声明：© 2026 作者。由国际抗癌研究学会出版。

许可协议：本文为开放获取文章，根据知识共享署名-非商业性使用-禁止演绎（CC BY-NC-ND）4.0国际许可协议的条款和条件分发。

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