要点
公共卫生相关性——本研究如何与公共卫生问题相关？
- 轮班工作是一种普遍的职业暴露，与昼夜节律紊乱和慢性代谢疾病风险增加相关。
- 肠道微生物群多样性变化可能代表连接夜班工作、饮食质量与长期健康结果的生物学途径。
公共卫生意义——本研究对公共卫生为何具有重要意义？
- 采用个体内设计，本研究表明整体肠道微生物群组成在不同班次间基本保持稳定，而夜班可能暂时降低微生物多样性。
- 更健康的饮食模式始终与更高的肠道微生物群多样性相关，核桃补充似乎能缓解夜班期间的多样性损失。
公共卫生启示——本研究对公共卫生从业者、政策制定者和研究人员的关键启示是什么？
- 专注于整体饮食质量的针对性营养策略可能有助于维持轮班工作人群的肠道微生物群多样性。
- 这些发现支持进一步开展针对饮食和基于时间的干预措施的公共卫生研究，以减轻轮班工人昼夜节律紊乱的健康影响。
摘要
轮班工人因昼夜节律紊乱、次优生活方式行为以及可能改变的肠道微生物群(GM)而面临慢性疾病风险增加。本研究调查了旋转轮班工人在三种周班次中的GM多样性和组成变化，以及核桃补充后的影响。采用个体内设计，比较了13名轮班工人在早班、下午班和夜班期间的GM多样性和组成。在为期三周的观察期后，参与者在日常饮食中添加了为期三周的每日一份核桃补充。通过16S rRNA测序分析GM，评估不同班次类型以及观察期和干预期之间的多样性和细菌组成。总体GM组成在班次开始和结束之间、按班次类型或核桃补充后没有差异。细菌多样性保持稳定，除了在观察期间夜班结束时显著下降(p = 0.03)，而在核桃补充期间未观察到这种下降。GM强烈按受试者聚类，更健康的饮食与更大的平均GM多样性相关(r = 0.64, p = 0.02)。尽管GM总体稳定，但夜班期间多样性下降表明，有针对性的营养策略，如核桃补充，可能有助于维持轮班工人的肠道健康。
关键词：轮班工人；肠道健康；昼夜节律；坚果；饮食
1. 引言
轮班工人是一个不断增长的人群。在瑞士，约五分之一的工人有轮班工作安排[1]。众所周知，轮班工人面临发展慢性疾病的风险增加，如肥胖、2型糖尿病、心血管疾病和某些类型的癌症[2,3,4]。然而，潜在机制尚不清楚，各种因素如内部昼夜节律失调、不健康的生活方式行为和睡眠不足以复杂方式相互作用。人类昼夜节律系统已发展为预期清醒和食物摄入期与休息和禁食期之间的节律交替[5]。昼夜节律影响许多生理过程，包括胃肠和代谢功能[6]。在轮班工人中，改变的饮食和睡眠模式往往损害位于下丘脑的中央时钟与位于所有主要组织中的独立外周时钟之间的同步[7]。
肠道微生物群(GM)也可能在轮班工人慢性疾病风险增加中发挥重要作用[8]。GM被定义为定植于宿主胃肠道的多样化微生物群落[9]，通过提供代谢和免疫功能极大地促进宿主生理[10]。GM失调与代谢性疾病如肥胖、2型糖尿病和心血管疾病相关[11,12,13]。食物摄入时间似乎也影响GM组成。事实上，证据表明，GM与其宿主一样，遵循主要由食物时间调节的昼夜节律[14]。这些昼夜波动导致特定时间的分类配置和功能能力，对宿主免疫和代谢产生重大影响[15,16]。GM的昼夜振荡可影响宿主昼夜节律[17]，但也取决于宿主的功能性昼夜节律钟[16]。因此，正常睡眠模式的破坏，如轮班工作或慢性时差，会损害GM中的昼夜节律性[17]。此外，与轮班工作相关的昼夜节律失调会影响关键激素的分泌，包括皮质醇、饥饿素和瘦素，这些激素调节应激反应和能量平衡[18]。这些激素变化可能通过肠脑轴导致GM改变。特别是，皮质醇已被证明直接影响肠道功能，包括肠道通透性[19]。
GM组成的特点是显著的个体间变异性，同时在个体内部随时间保持相对稳定[20]。长期饮食模式与不同的GM谱强烈相关[21]。然而，一些干预研究表明，对剧烈的饮食变化（如从动物性饮食转变为植物性饮食[22]或显著改变饮食的宏量营养素组成[23]）会有GM变化。几项干预研究还突出了几种坚果的益生元特性和改善GM组成和功能的潜力[24]。事实上，GM发酵坚果中发现的膳食纤维和聚合多酚形成假定有益的生物活性分子，如丁酸盐，这与向更健康的GM转变相关[25]。
这些证据为使用基于食物的益生元作为缓解昼夜节律失调和相关代谢疾病的潜在方法铺平了道路，最终帮助预防轮班工人慢性疾病的发展[17]。然而，仍存在几个研究空白，例如澄清仅由轮班工作引起的失调程度以及理解饮食与GM之间的相互作用。因此，本研究旨在调查轮班工人的GM多样性和组成是否以及如何在不同班次间变化，以及核桃补充是否影响这些模式。
2. 材料与方法
本研究包括两个阶段。在第一个为期3周的观察阶段，我们采用个体内设计比较了轮班工人在三种周班次(早班=AM、下午班=PM和夜班)中的GM多样性和组成。在第二个为期3周的干预阶段，使用相同的参与者和班次类型，我们分析了在日常饮食中添加每日一份核桃的影响。
2.1. 参与者
我们纳入了具有周轮换(通常为周一至周五)的轮班工人，他们在(1)清晨、(2)下午和(3)夜班之间以任何顺序轮换。班次持续时间在8至9小时之间。对大多数参与者而言，早班通常在04:00至05:00开始，在12:00至14:00结束；下午班在12:00至14:00开始，在20:00至22:00结束；夜班在20:00至22:00开始，在04:00至06:00结束。参与者年龄在18至65岁之间，在入组前至少三个月从事轮班工作。我们从瑞士法语区的食品、制药、机械和能源行业的轮班工人公司招募了便利样本。如果参与者在过去三个月内或研究期间使用过抗生素或免疫调节剂、正在服用益生元或益生菌补充剂、被诊断为炎症性肠病、接受过主要胃肠道手术或对坚果过敏，则被排除在外。鉴于GM组成明显的个体间变异性[20]，每位参与者都作为自己的对照。因此，我们没有根据年龄或体型等其他潜在决定因素限制招募。数据收集始于2021年5月，结束于2022年2月。由于新冠疫情，一些参与者的轮班工作计划发生了意外变化。对于这些个体，数据收集被分为几个周阶段，而不是计划的六周连续周，将总参与时间从六周延长至18周。此外，一些参与者的工作日为4天而非5天。在研究中招募的15名男性轮班工人中，一名仅完成观察阶段的参与者和另一名工作计划异常的参与者被排除在分析之外。
2.2. 研究程序
在验证资格标准并签署知情同意书后，研究合作者拜访每位参与者，提供研究材料并测量体重和身高。在观察阶段(第1、2和3周)，参与者在每班次(早班、下午班、夜班)开始(通常为周一)和结束(通常为周五)时收集粪便样本。他们使用提供的Feces Catcher(Zymo Research，美国加利福尼亚州尔湾)和专用套件(OMNIgene·GUT，DNA Genotek，加拿大安大略省渥太华)。样本在24小时内邮寄给研究团队，储存在冰箱中，并按周批量送往实验室。此外，参与者使用智能手机拍摄每天(周一至周日)消耗的所有食物和饮料照片。
在干预阶段(第4、5和6周)，参与者继续相同的程序，并在日常饮食中(周一至周日)添加每日30克普通核桃(无盐、未烘烤)。份量基于瑞士饮食指南[26]。核桃预先分装并包装在小型、每日标签袋中。参与者被指示在整个周内保持日常饮食，包括周末。
图1展示了研究设计，观察阶段(第1-3周)和干预阶段(第4-6周)各包括三个工作班次，在参与者之间按可变序列排列。本研究获得了日内瓦州人类研究伦理委员会批准(项目ID 2020-02730，2021年3月15日批准)，并在瑞士国家临床试验门户网站(SNCTP000004312，2021年3月15日)和ClinicalTrials.gov(NCT04918537，2021年4月12日)注册。
2.3. 肠道微生物群分析
收到后，粪便样本在-80°C冷冻并储存直至处理。从150个粪便悬液样本(250μL)中提取DNA，并使用ZymoBIOMICS DNA Miniprep试剂盒(Zymo Research)进行三个阴性对照(OMNIgene·GUT缓冲液)的提取，采用20分钟珠磨步骤。使用Qubit dsDNA BR检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)对纯化DNA进行定量，并在-20°C储存。
对于细菌16S rRNA基因V3–4区域的PCR扩增，使用3 ng提取的DNA(或1μL阴性对照提取物)，如先前所述[27]。随后，按照Lazarevic等人的程序[28]进行MiSeq(Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥)2×300扩增子测序。
使用PEAR29合并的测序读数(ENA登录号PRJEB98629)，通过Mothur[30]评估的平均Q分数≥30，使用USEARCH v. 11.0.667管道中的UNOISE3[31,32]聚类为零半径操作分类单元(zOTUs)。
为获得过滤数据集，我们移除了满足以下任一标准的zOTUs：(1)通过USEARCH34显示与参考EzBioCloud 16S数据库[33]序列的同一性<90%，以及(2)在所有样本中计算的平均丰度<0.01%。使用Mothur通过EzBioCloud 16S数据库对zOTUs进行分类(方法= wang，阈值= 80)。由于两个主要污染物，未分类的Cutibacterium和Microbacterium zOTUs在0.01%平均丰度阈值下被识别，因此未包含在分析中，因此不需要对数据集进行去污。
2.4. 饮食摄入和其他变量
由于GM组成与饮食密切相关，我们在研究的六周内(30天)分析了参与者从周一至周五的食物摄入量。基于参与者提交的照片，经验丰富的营养师记录了食物和饮料消耗的日期、时间、类型和估计数量。使用经过验证的电子食物记录"e-CA"[35]，营养师将图片中的数据手动输入软件，同时验证不完整的信息(例如沙拉上的调味料类型以及添加的油和脂肪)。从这些记录中，我们计算了(1)遵循瑞士饮食指南[26]的食物组摄入量(以份计)，以及(2)使用瑞士食物成分数据库[36]的能量以及宏量和微量营养素摄入量。为评估整体饮食习惯，我们使用了"国家营养与健康指南评分"(PNNS-GS)[37]，这是对法国饮食指南(与瑞士建议基本一致)依从性的经过验证的评分，因为没有基于瑞士饮食指南的经过验证的评分。
此外，我们记录了年龄、药物使用、吸烟状况和自我报告的身体活动(每种班次类型和空闲时间期间的轻度或剧烈身体活动小时数)。参与者穿着轻便衣服(空口袋)且不穿鞋，使用秤(SECA 877)称重至0.1 kg。使用便携式测高仪(SECA 217)站立测量身高至0.1 cm。根据世界卫生组织定义[38]计算身体质量指数(BMI)(体重除以身高平方(kg/m2))并进行分类。
2.5. 统计分析
通过比较班次结束(周五)样本与(i)同一研究阶段(观察/干预)内同一班次开始(周一)的样本，以及(ii)同一研究阶段(观察/干预)内不同类型班次(早班、下午班、夜班)收集的班次结束(周五)样本，评估假设的GM多样性及组成的GM变化。
使用Shannon指数检查α多样性，该指数反映了分类丰富度和均匀度。使用R vegan v2.7-1包[39]的rrarefy函数，在对每个样本稀释至26,400条读数后计算该指数。为评估β多样性，我们通过主坐标分析(PCoA)和置换方差分析(PERMANOVA)比较样本间的细菌群落组成。这些基于Bray–Curtis相似性[40]的分析使用zOTUs平方根转换的相对丰度，在PRIMER v7(PRIMER-e，新西兰奥克兰)中执行。
使用DESeq2 v1.44.0[41]测试单个分类群相对丰度的差异是否具有统计学意义，过滤掉在比较样本中少于25%发现的分类群，并在必要时对参与者进行调整。DESeq2输出的Benjamini–Hochberg校正p值<0.05被认为具有显著性。
我们首先使用线性混合模型比较不同类型班次和研究期间的食物组和营养素摄入量，受试者ID作为随机效应。自变量是班次类型(早班、下午班、夜班)与研究期间(观察、核桃补充)的交互作用。我们进一步分析了GM的多样性和组成，取决于已知影响GM的食物组和营养素摄入量。使用Spearman相关性评估整体饮食(PNNS-GS)与GM多样性(Shannon指数)之间的关联。最后，使用中位值作为截断点，我们使用Wilcoxon秩和检验比较了高或低消费水果和蔬菜、坚果、普通和全谷物、含糖饮料以及肉类，以及纤维、总脂肪、酒精和PNNS-GS的参与者的GM多样性(Shannon指数)。
3. 结果
3.1. 参与者特征
我们的最终样本包括13名参与者，平均(±SD)年龄为42.6±11.1岁。平均BMI为27.1±5.5 kg/m2。四名参与者的BMI在正常范围内，七名在超重范围内，两名在肥胖范围内。参与者从事轮班工作平均持续时间为7.6±7.2年，范围从1年至25年。详细的参与者级别信息见补充表S1。
3.2. 肠道微生物群的细菌多样性
过滤后的16S rRNA扩增子序列数据集由9,548,802条读数组成，每份粪便样本中位数为63,092条读数(范围26,484–104,197)。读数聚类为676个操作zOTUs，属于13个门。
作为Shannon多样性指数测量的细菌多样性在研究期间保持一致，无论班次类型、星期几(周一或周五)或研究阶段(观察、核桃补充)(图2)。12组样本的中位值范围为4.371至4.542。在相同班次和研究阶段内周五与周一的个体内比较中未观察到统计学显著差异，除了观察阶段(无核桃)的夜班。在此班次期间，细菌多样性呈下降趋势(p = 0.03，Wilcoxon符号秩检验)，而补充核桃的夜班未显示显著变化。当比较相同干预方案下早班、下午班和夜班的周五样本时，未发现显著差异，表明GM多样性不随班次类型变化。
主坐标分析(PCoA)的Bray–Curtis相似性显示了GM谱的特定受试者聚类(图3)，这通过PERMANOVA(全局检验，p = 0.0001)得到确认。PERMANOVA结果表明，当在其他两个因素的特定水平内单独测试时，三个因素中的任何一个(班次开始vs.结束、早班/下午班/夜班类型或观察vs.核桃干预)均未在整体微生物群落组成中产生显著差异。
3.3. 肠道微生物群的组成
优势门Firmicutes(同义词Bacillota[42])、Bacteroidetes(同义词Bacteroidota)、Proteobacteria(现在对应Pseudomonadota、Bdellovibrionota、Thermodesulfobacteriota、Campylobacterota和Myxococcota)和Actinobacteria(同义词Actinomycetota)在所有样本中共同代表81.2–99.9%的序列读数。Tenericutes(同义词Mycoplasmatota)、Verrucomicrobia(同义词Verrucomicrobiota)和Fusobacteria(同义词Fusobacteriota)在某些样本或个体中缺失。图4显示了参与者在门水平上显著的个体间和相对较低的个体内分类谱变异。
尽管微生物群结构和复杂性的全局分析显示班次开始vs.结束、班次类型或核桃消费没有显著差异，但几种细菌分类群在这些条件下丰度不同。包括其相关低级分类群的门Lentisphaerae，以及来自目Clostridiales(门Firmicutes)的属，特别是Oscillibacter、PAC001609_g和Eubacterium_g23，在工作班次结束时(周五)当比较较晚班次与较早班次时(下午班vs.早班、夜班vs.早班、夜班vs.下午班)更为丰富(补充图S1)。相比之下，家族Sutterellaceae的丰度在这些比较中显著降低。在班次内周五与周一的比较中观察到类似模式，Lentisphaerae、Oscillibacter和Eubacterium_g23在周结束时增加，而Sutterellaceae在同一时期减少(补充图S2)。
3.4. 食物摄入
基于30天的食物记录，参与者平均总能量摄入为2413±452 kcal/天，在班次类型之间没有显著差异。平均健康饮食评分(PNNS-GS评分)为7.2±1.2(范围5.3–9.0)。平均纤维摄入量为21.8±5.6 g/天，低于推荐的30 g/天[26]。如预期，在为期三周的干预期间，核桃和脂质摄入量更高，但纤维摄入量在观察阶段和干预阶段之间没有显著差异。在核桃补充的干预阶段，与观察阶段相比，每日能量摄入增加了152±73 kcal(p = 0.04，表1)。
在整个研究期间，对饮食指南的依从性(PNNS-GS评分)与GMα多样性呈正相关，由Shannon指数测量(r = 0.64，p = 0.02)。事实上，与在所有12种研究条件下PNNS-GS评分较低的参与者相比，PNNS-GS评分较高的参与者多样性更高，在其中六种条件下存在显著差异(Wilcoxon秩和检验，p < 0.05)(图5)。相比之下，Shannon指数在纤维、总脂肪、酒精摄入或任何测试的食物组方面没有显著差异。高和低PNNS-GS评分的研究参与者之间几种细菌分类群的丰度存在差异(补充图S3)。当在多个时间点观察到给定分类群的差异时，它们始终遵循相同的方向。
4. 讨论
在本研究中，我们比较了不同班次类型的GM多样性和组成，并评估了轮班工人核桃补充的效果。我们发现与班次类型或核桃补充相关的GM多样性或组成总体变化不显著。然而，在观察阶段的夜班结束时观察到多样性下降，而在核桃补充后未观察到这种下降。在研究过程中，坚持更健康的饮食与更大的GM多样性呈正相关。
我们的发现与关于轮班工作和GM的有限文献一致，后者通常报告对整体微生物多样性的影响最小。Mortas等人[43]跟踪了10名保安人员，并在四周日间工作(07:00–15:00)或两周夜班(23:00–07:00)后分析GM组成，发现α或β多样性没有显著变化。有趣的是，他们观察到一些参与者对轮班工作引起的昼夜节律紊乱表现出更强的个体反应，尽管未检测到显著的组水平差异。同样，Benedict等人(2016)研究了暴露于两晚部分睡眠剥夺(PSD)的九名健康男性，这是轮班工作的常见特征，发现β多样性没有显著差异[44]。在我们的研究中，我们发现α多样性在更严格遵守健康饮食指南的参与者中显著更高，这与一项长期多民族队列的结果一致，在该队列中，增加的α多样性与更健康的饮食显著相关，即使在长期内也是如此[45]。
关于GM组成，Mortas等人报告称夜班后Bacteroidetes的相对丰度减少，Actinobacteria和Firmicutes水平增加[43]。在他们的研究中，Faecalibacterium作为日班的生物标志物出现，而Dorea longicatena和Dorea formicigenerans在夜班期间更为丰富。Benedict等人观察到PSD增加了Firmicutes:Bacteroidetes比例，增加了家族Coriobacteriaceae和Erysipelotrichaceae的相对丰度，并降低了Tenericutes的相对丰度[44]。在我们的研究中，几种分类群，特别是Lentisphaerae、Oscillibacter、Eubacterium_g23和Sutterellaceae，似乎是工作班次的潜在标志物。有趣的是，每个班次周内的进展(周一至周五)反映了班次类型(早班、下午班、夜班)之间的一些差异，表明对微生物组成有共同的潜在影响，这可能包括累积疲劳等因素。
解释GM组成的变化仍然具有挑战性，因为区分健康与不健康的谱并不简单。事实上，"健康微生物组"的概念存在争议，一些专家主张转而关注微生物群对宿主执行的功能[46]。此外，"理想"的微生物组可能会根据年龄、饮食习惯或生理状态等因素动态演变[46]。除了组成外，GM节律性本身可能是独立的风险因素，如2型糖尿病所示[47]。这突显了在研究暴露于昼夜节律紊乱的人群(如轮班工人)时考虑GM的功能和时间方面的重要性。
尽管如何定义健康微生物组存在不确定性，但饮食仍然是塑造GM组成和多样性的核心调节器。未消化的膳食成分如纤维、脂肪、蛋白质和复合碳水化合物是特定细菌群的底物。主要来自水果、蔬菜和全谷物的高纤维饮食与微生物多样性增加相关[48]。纤维作为益生元，促进有益细菌的生长，有助于整体肠道健康。迄今为止，许多干预研究使用了纤维补充剂，如低聚果糖或低聚半乳糖，而不是全食物。然而，植物性全食物，如坚果，除了纤维外，还含有多种维生素、矿物质和植物化学物质(例如类黄酮、异黄酮、木质素、芪类、单宁和多酚)，这些物质也可能影响GM组成[48]。越来越多的证据表明，坚果消费可以对氧化应激、炎症和血管反应性产生有益影响[49]。九项随机临床试验的荟萃分析报告称，坚果消费增加了Clostridium、Dialister、Lachnospira和Roseburia的丰度，同时减少了Parabacteroides[24]。在我们的研究中，几种分类群在核桃补充和观察阶段的工作班次期间显示出显著变化；当相同分类群在两个阶段中发生变化时，变化方向一致。例如，三个分类群(Oscillibacter、Alistipes senegalensis和Victivallis PAC001213_s)在补充核桃的两个工作班次中显著变化，但在无补充的一个或两个班次中也是如此。同样，门Lentisphaerae和类Lentisphaeria的丰度在两个核桃补充班次中增加，在观察阶段也呈现出类似但不显著的趋势。此外，没有一种分类群在同一干预类型内的所有三个工作班次中显示出显著变化(补充图S2)，表明潜在的生物趋势但一致性可变。在我们的研究中，核桃补充与总能量摄入和饮食中脂质比例的显著增加相关，这可能会引起对体重增加潜在风险的担忧。当前文献不支持这一担忧，两项系统评价得出结论，坚果消费与增加的脂肪量无关[50,51]。然而，未来的研究应在基于坚果补充的干预期间监测体重动态。
GM组成已被证明与肥胖双向相关，肥胖个体表现出不同的微生物谱[52]，实验研究表明肠道微生物群的改变可能导致体重增加[53]。在本研究中，参与者表现出广泛的BMI值(19.3–34.2 kg/m2)，这可能部分解释了观察到的GM组成个体间变异性。然而，由于研究采用了个体内设计，每位参与者都作为自己的对照，BMI不太可能影响班次类型之间的比较或观察到的核桃补充效果。
我们观察到在观察阶段的夜班最后一天细菌多样性有轻微但显著的下降，但在坚果补充下未观察到这种下降。这很有趣，因为较高的细菌多样性通常与更健康的饮食模式相关，而维持这些习惯对夜班工人来说特别具有挑战性。轮班工人面临多重营养障碍，包括不规则的饮食习惯、睡眠债务、昼夜节律紊乱以及健康食品获取减少。这些因素相互作用，增加了饥饿感，减少了饱腹感，并在健康食品选择有限的环境中改变了食物偏好[54]。在这种情况下，支持轮班工人改善饮食质量应该是降低慢性疾病风险的中心目标。策略包括促进富含纤维和全食物的饮食，并将进餐时间调节作为额外的预防方法。
本研究具有几种方法学和实践优势。纵向设计与每位参与者的重复取样能够监测随时间的个体内变化。通过关注跨行业常见的轮班模式并使用全食物干预，该研究增强了研究结果的实际相关性。在方法学层面，使用多种多样性指标(如推荐[55])增加了稳健性。最后，对研究期间饮食摄入的全面评估允许对食物消费模式进行详细表征。
然而，也应承认几个局限性。由于新冠疫情背景下的招募挑战，小样本量可能限制了检测微妙效应(包括与核桃补充相关的效应)的统计能力。尽管个体内设计有助于控制某些变异性，但非连续研究周和轮班计划的异质性可能引入了额外的变异性。此外，不能排除季节对肠道微生物群组成的影响[56]。
5. 结论
在本研究中，我们发现早班、下午班或夜班对整体GM多样性或组成没有一致的影响。同样，核桃补充也没有重大影响，尽管它似乎在夜班结束时维持了微生物多样性，而在观察阶段通常会观察到下降。
几种分类群在班次和研究阶段之间显示出不同的丰度，表明至少一些变化可能反映了真实的生物趋势而非随机变异。重要的是，坚持更健康的饮食模式始终与更大的微生物多样性相关。
未来的研究应探索针对饮食质量和进餐时间的干预措施，使用更大更多样化的样本，以进一步阐明饮食、昼夜节律和肠道微生物群之间复杂的双向关系。
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