摘要
成体干细胞被认为驱动子宫内膜的再生潜能并促进子宫内膜异位症的发病机制，然而，它们的身份和特征定义仍有待明确。本研究采用体内和体外方法证明，高醛脱氢酶1活性(ALDH^HI细胞)的细胞是子宫内膜上皮中的长寿命祖细胞，具有更高的类器官形成能力、长期传代潜力和干细胞特征基因表达谱。利用Aldh1a1^cre/ERT2; ROSA26^tdTomato报告小鼠进行谱系追踪，发现Aldh1a1^+细胞在出生后发育、动情周期和产后修复过程中扩展。在卵巢切除或外源性雌二醇刺激下，ALDH1A1^+细胞分别定位于子宫内膜腺体隐窝或整个腔上皮，表明其空间定位对激素敏感。功能性地，我们发现选择性消除Aldh1a1^cre/ERT2; ROSA26-DTR^flox/flox小鼠中的ALDH1A1^+细胞减少了子宫内膜腺体数量和FOXA2表达。在人类子宫内膜中也观察到类似现象，高ALDH活性的子宫内膜上皮类器官(ALDH^HI细胞)比ALDH^LO细胞表现出更高的类器官形成能力，并显示独特的转录组特征，含有更少的腔样纤毛细胞。总体而言，我们的研究表明ALDH1A1^+细胞是子宫内膜中具有再生潜力的激素敏感性成体干细胞，对子宫内膜的发育和功能至关重要。
引言
子宫内膜是子宫腔的内衬，其独特的再生潜能由干细胞驱动(Cousins et al., 2021)。由于子宫内膜异位症、子宫腺肌症和其他与月经相关的疾病患病率高，这些成体干细胞的位置和身份是活跃的研究领域，这些疾病源于子宫内膜组织。近期研究使用经典干细胞检测方法鉴定了在子宫内膜基底层富集且定位于子宫内膜血管周围区域的CDH2^+、SSEA1^+和SUSD2^+祖细胞(Masuda et al., 2012; Nguyen et al., 2017; Valentijn et al., 2013)。利用这些标记物，多个研究组在患有子宫内膜异位症女性的月经液和腹膜液中检测到CDH2^+、SSEA1^+、SOX9^+和SUSD2^+干细胞(Hapangama et al., 2019; Masuda et al., 2021)。这些研究支持这样的假设：存在于月经液中的干细胞在逆行月经期间进入腹膜腔，是子宫内膜异位症建立的关键因素(Bulun, 2022; Sampson, 1927)。因此，定义原位子宫内膜中的干细胞身份和信号网络是开发针对子宫内膜异位病灶及其相关疼痛、炎症和不孕症的新型靶向治疗方法的关键。
小鼠已被用于鉴定驱动子宫内膜再生潜能的干细胞标记物。具体而言，谱系追踪研究确定了一个假定的干细胞生态位，该生态位在子宫内膜的腔上皮和腺上皮之间的连接区富集(Jin, 2019)。通过追踪、消除和增殖能力研究Lgr5^+细胞在子宫中的命运，研究确定了一个在子宫内膜腺体隐窝中富集的Lgr5^+生态位，促进子宫内膜再生(Seishima et al., 2019)。类似地，通过谱系追踪、消除和类器官模型研究，发现Axin2^+细胞定位于小鼠子宫内膜的腺体隐窝中，驱动子宫内膜的正常稳态和致癌转化(Syed et al., 2020)。
在动情周期和产后时期，子宫内膜结构重塑涉及干细胞的协调扩展和分化。我们发现TGFβ受体ALK5的条件性失活会损害产后子宫内膜重塑，导致结构缺陷、肿瘤和肺转移(Monsivais et al., 2019)。我们还表明，TGFβ下游效应因子SMAD2和SMAD3转录因子的条件性失活导致侵袭性和转移性子宫内膜肿瘤(Kriseman et al., 2019; Kriseman et al., 2023)。当在体外培养时，来自SMAD2/3条件性失活小鼠的类器官，以及用A83-01（ALK4/5/7抑制剂）处理的对照类器官，呈现出改变的形态和视黄酸信号分子的表达升高，包括醛脱氢酶1a1(Aldh1a1)的表达升高(Kriseman et al., 2023; Tojo et al., 2005)。此外，缺乏TGFBR2的小鼠子宫内膜上皮类器官变得分层并异常表达角蛋白5和p63，突出显示其在上皮细胞类型特化中的关键作用(Parks et al., 2025)。因此，TGFβ信号传导的破坏通过改变视黄酸通路而损害类器官和子宫内膜稳态。
视黄酸代谢中一个重要的酶是醛脱氢酶1a1(ALDH1A1)，它催化视黄醛转化为视黄酸(Haselbeck et al., 1999)。先前研究表明，ALDH1A1的高表达和活性是人类和小鼠子宫内膜中潜在的干细胞标记物(Wu et al., 2017)。在出生后小鼠子宫内膜中，ALDH1A1在整个上皮中丰富表达，表明其在发育性子宫成熟中的作用(Spencer et al., 2023)。在人类中，ALDH1A1在子宫内膜基底层上皮中富集，与子宫内膜干细胞标记物CDH2共定位，并在卵巢上的子宫内膜异位病灶中表达(Ma et al., 2020)。本研究使用谱系追踪、类器官形成实验和转录组分析来表征ALDH1A1^+干细胞在子宫内膜中的贡献。
结果
小鼠ALDH^HI细胞比ALDH^LO细胞具有更高的类器官形成能力和干细胞样特征
为了定义具有高醛脱氢酶活性的小鼠子宫内膜上皮细胞的干细胞样特性，我们使用了ALDEFLUOR检测法(Storms et al., 1999)，该方法根据细胞代谢BODIPY标记的ALDH底物的能力来分离细胞(图1A-B)。我们在动情期收集成年雌性野生型(WT)小鼠，并解离其子宫内膜上皮细胞，通过FACS分为ALDH^HI和ALDH^LO群体，使用ALDEFLUOR检测法(图1A-C)。由于类器官形成能力表明干细胞特性，我们将细胞扩增后对ALDH^HI和ALDH^LO细胞进行类器官形成实验和RNAseq转录组分析。与ALDH^LO类器官相比，ALDH^HI类器官具有更高的类器官形成率(0.01% vs. 2.69%，n=3和n=5，p<0.05)、周长(664±119 vs. 936±117 μm，p<0.05)和面积(33,017±10,580 vs. 65,068±17,014 μm^2，p<0.05)(图1D-H)。
通过RNAseq，我们发现ALDH^HI与ALDH^LO类器官相比，有346个转录本增加和674个转录本减少(>1，<-1 log2FC，调整后的p值<0.005)(图1I)。差异表达(DE)基因的基因本体分析表明，与ALDH^LO细胞相比，ALDH^HI细胞中"极光B信号"和"E2F转录因子网络"相关基因的表达降低，包括Ccnb2、Ccna2、Ccne1、Aurka、Mki67和Bub1等基因在ALDH^HI与ALDH^LO细胞中的表达显著降低(图1I-J，补充图1A，补充表S1)。与干细胞活性相关的类别如"BMP受体信号"相关基因在ALDH^HI与ALDH^LO细胞中表达增加，包括Bmp4、Bmp5、Bmp6、Fst、Cdh2、Lgr5、Wnt9a和Fzd3等基因表达更高。为了确定与其他小鼠子宫内膜中干细胞活性的相似性，我们将ALDH^HI与ALDH^LO列表中的差异表达基因与Axin2^HI与Axin2^LO小鼠子宫内膜上皮细胞的差异表达基因进行比较(Syed et al., 2020)。我们发现19个基因在ALDH^HI和AXIN2^HI细胞群中均增加，19个基因均减少(补充图1B，补充表S1)。具体而言，Lgr5、Calb1和Msx2均被确定为在两种细胞类型中表达增加(图1K)。
角蛋白基因编码中间丝蛋白，用于分类上皮亚型(即基底与单层柱状上皮)，但也可能表示祖细胞状态、分化状态或伤口愈合反应(Cohen et al., 2022)。我们发现ALDH^HI和ALDH^LO细胞之间存在角蛋白基因表达差异(补充图1C，补充表S1)，ALDH^HI细胞显示Krt17表达更高，该基因与细胞分化、伤口愈合反应相关，并在人类子宫内膜中与SOX9^+/LGR5^+祖细胞共定位(Cohen et al., 2024; Garcia-Alonso et al., 2021)。与ALDH^HI细胞相比，ALDH^LO细胞表达更高的几种其他角蛋白相关基因(即Krt15、Krt4、Krt12)，表明两种细胞类型之间存在独特的分化潜能。由于类固醇激素对上皮细胞增殖的关键作用，我们还分析了雌激素(Esr1)和孕激素受体(Pgr)的表达水平，并观察到ALDH^LO和ALDH^HI细胞之间的水平相当(补充表S1)。总体而言，这些研究表明ALDH^HI细胞在类器官实验中表现出增强的克隆形成和再生能力，符合成体干细胞状态。
子宫内膜Aldh1a1^+细胞显示与干细胞状态一致的基因表达特征
先前研究使用scRNAseq分析出生后子宫，鉴定出一个潜在的子宫内膜干细胞生态位，该生态位在一生中再生子宫内膜(Spencer et al., 2023; Wu et al., 2017)。其他研究分析了成年周期性小鼠的子宫内膜上皮细胞，但仅捕获少数上皮细胞，阻碍了对具有干细胞/祖细胞特征的细胞进行深入分析(Winkler et al., 2024)。我们从成年周期性野生型(WT)小鼠中富集子宫内膜上皮细胞，并使用10X Genomics平台对动情期小鼠的约5,984个总细胞和动情后期小鼠的3,995个细胞进行scRNAseq分析(图2)。我们获得了每细胞55,000-98,000次读取，并检测到每细胞18,000-24,000个基因。使用Seurat 5.2.0版本在均匀流形近似和投影(UMAP)上对细胞进行聚类。然后，我们通过识别簇之间差异表达(DE)基因并使用先前描述的标记物来分类细胞类型(Wang et al., 2023; Wang et al., 2020; Winkler et al., 2024)。这种分类方法在我们的样本中鉴定了八种不同的细胞类型(上皮、基质、巨噬细胞、间皮、自然杀伤细胞(NK)、嗜酸性粒细胞、内皮和T细胞)(图2A-B)。这些细胞中，约7,569个(4,488个来自动情期，3,081个来自动情后期)被分类为上皮细胞，表明我们有效地富集了上皮细胞群。
我们通过使用先前注释的腔上皮(Ifi203、Pla2g2e、Itgam、Cdc42ep2、Lrrc26、Irag2、Cyp21a1、Adrg7)和腺上皮(Sult1d1、Napsa、Gpx3、Klk1、Foxa2)标记物对上皮细胞进行亚聚类，进一步分析上皮细胞(Padilla-Banks et al., 2023)(图2C，补充图S2D-E)。为了确定在每个阶段是否存在上皮干细胞(EpSC)生态位，我们分析了Aldh1a1、Axin2、Lgr5、Gstm7、En2和Wnt7a在上皮细胞中的表达，发现在簇4、25和13中富集Aldh1a1、Axin2和Lgr5(图2D-E，补充图S2A-B)。在动情期小鼠上皮细胞亚簇的双特征图中可以观察到这些细胞中Aldh1a1、Lgr5和Axin2的共表达(图2J-L)。位于簇4和25中的EpSC与其它簇相比，对增殖标记物Top2a和Mki67的表达较低，表明它们处于静止状态(图2D-E，补充表S2)。除了表达Aldh1a1、Axin2和Lgr5外，簇13还表达Top2a和Mki67，表明这些细胞静止程度较低(图2D-E)。其他显著差异包括在动情后期上皮中腔细胞簇14表达Aldh1a1(图2E)，这一变化我们也通过ALDH1A1 IHC观察到(图2P-Q')。
为进一步表征静止EpSC的转录组，我们分析了在动情期和动情后期分析的小鼠中簇4和25与我们数据集中的其他上皮细胞之间差异表达(DE)基因(补充表S2)，显示在两种阶段分析的小鼠的EpSC中，约170个保守基因增加(>1 log2FC，调整后的p值<0.01)，52个减少(<-1 log2FC，调整后的p值<0.01)。差异表达基因包括Calb1、Lpar3、Cited4和Tgfbi，它们的表达在出生后子宫成熟过程中在上皮中增加(Spencer et al., 2023)。Susd2，一种子宫内膜干细胞标记物(Masuda et al., 2012)，在EpSC簇中也增加，以及Cyp26a1(视黄酸信号通路的成员)(Isoherranen and Zhong, 2019)和Tgfbi(由转化生长因子β信号通路诱导，刺激NOTCH信号，维持胶质瘤干细胞特性)(Chen et al., 2024; Corona and Blobe, 2021; Lee et al., 2023)。与先前发表的scRNAseq数据集比较(Padilla-Banks et al., 2023)也显示，簇4和25与他们分析中鉴定的EpSC簇共享转录组特征(补充图S2C)。
然后，我们使用Slingshot伪时间分析对上皮亚簇进行轨迹分析，确定EpSC的动态连续性(图2F-I，补充图S2F-L)。该分析显示，来自动情期阶段的EpSC簇从簇4和25中表达Aldh1a1、Lgr5、Axin2的静止细胞，转变为表达Aldh1a1、Lgr5、Axin2-的增殖性簇13，后者表达增殖性Mki67和Top2a标记物(图2F-G)。随后轨迹向腺上皮细胞发展，并以腔上皮中的细胞结束(图2F-G)，补充图S2F-G中显示了额外的预测轨迹。动情后期上皮细胞的轨迹比动情期细胞有更多分支点(图2H-I，补充图S2H-L)，表明Aldh1a1-表达细胞受动情周期中性激素的动态水平控制(Nilsson et al., 2015)。相应地，上皮簇的基因富集分析显示，EpSC簇中"腺上皮发育"和"BMP信号"类别的基因表达特征评分较高，而腔细胞中"Stereocilium"类别基因评分较高(图1M-O)。我们对成年周期性子宫内膜上皮的分析表明，ALDH1A1^+细胞在具有干细胞特征的细胞类型中富集。
成年周期性子宫中ALDH1A1的表达和定位受雌激素和孕激素控制
我们使用WT子宫中动情期和动情后期成年小鼠的IHC验证了通过scRNAseq鉴定的Aldh1a1-表达细胞的动态定位(图2P-T)。在动情后期，ALDH1A1在腔上皮和腺上皮中均被检测到(图2P-P')，但在动情期定位于腺体隐窝(图2Q-Q')。我们还在mRNA水平上观察到这种激素依赖性Aldh1a1表达，其中Aldh1a1在动情后期的表达高于动情前期和动情期(图2T)。卵巢切除导致ALDH1A1在整个腔上皮和腺上皮中扩散表达，而长期E2治疗将ALDH1A1表达限制在腺体隐窝(图2R-S')。这些结果证实了成年子宫中ALDH1A1-表达细胞的定位受类固醇激素控制。
为进一步研究ALDH1A1的激素依赖性表达模式，我们用一系列激素处理卵巢切除小鼠(图S3A)。卵巢切除，即内源性雌激素(E2)和孕激素(P4)的耗竭，导致ALDH1A1在腔上皮和腺上皮中表达(图S3B-B')。相比之下，P4、E2或P4+E2组合处理增加了向腺体隐窝的定位(图S3C-E')。单独P4处理与卵巢切除或E2处理的小鼠子宫组织相比，降低了Aldh1a1的基因表达水平(图S3F)。因此，在缺乏激素的情况下，ALDH1A1在整个腔上皮和腺上皮中扩散表达。另一方面，E2和P4直接影响上皮中ALDH1A1^+细胞的定位。
出生后时期Aldh1a1^+细胞的谱系追踪揭示它们是子宫内膜的长寿命细胞
ALDH1A1在出生后子宫内膜中表现出动态表达模式，在出生后第7天(PND7)在整个上皮中表达显著(图3A-A')，随着子宫内膜腺体发育在PND14时逐渐积累(图3B-B')，并在PND21时限制在更成熟腺体的腺体隐窝中(图3C-C')。这种表达模式类似于WNT相关信号分子，如AXIN2和LGR5，它们是先前表征的子宫内膜再生驱动因子(Seishima et al., 2019; Syed et al., 2020)。为了定义ALDH1A1^+细胞在子宫内膜中的长期贡献，我们通过将Aldh1a1^cre/ERT2/+小鼠与ROSA26^tdTomato/TdTomato cre报告基因小鼠杂交，生成了ALDH1A1^tdTomato报告小鼠，这将在诱导时用红色荧光蛋白(RFP)标记ALDH1A1^+细胞及其后续子代(图3D)(Madisen et al., 2010; Poulin et al., 2018)。
通过使用低剂量4-OHT(0.5μg/g)，我们获得了单标记细胞，并在追踪1天后(PND7→PND8)验证了(图3E-E')。6天后(PND8→PND14)检测到更多腔和腺细胞(图3F-F')，在长期标记(PND8→PND56)后，腔和腺上皮中的扩展增加(图3G-G')。这种RFP标记上皮细胞的逐渐增加被量化，显示ALDH1A1^+细胞扩展并保持为腔和腺子宫内膜上皮的长期驻留细胞(图3H)。当在PND14开始追踪时，此时子宫内膜腺体开始侵入下方基质(图3I-L)，在短期追踪(PND14→PND15)后检测到单标记RFP^+细胞(图3I-I')。在PND14→PND28和PND14→PND56追踪的小鼠中观察到越来越多的细胞，显示此时ALDH1A1^+细胞对子宫内膜腔和腺细胞均有贡献(图3J-J'，K-K'，L)。当在PND21标记ALDH1A1^+细胞时，单个腺上皮细胞为RFP^+(图3M-M')，这些细胞在PND21→PND56追踪时在较大区域的腺和腔上皮细胞中被检测到(图3N-N'，O)。跨基质和上皮区室的每视野总RFP^+细胞显示，在我们分析的每个时间点，基质细胞都被标记，ALDH1A1^+基质细胞数量随时间无明显增加(图3H，L，O)。因此，我们的谱系追踪研究表明，ALDH1A1^+细胞可在子宫内膜的腺、腔和基质区室中被检测到，涵盖短和长期标记期。
ALDH1A1^+细胞在成年周期性小鼠子宫内膜中动态表达
为了确定ALDH1A1^+细胞在成年周期性子宫内膜中的命运，我们在周期的动情期开始追踪ALDH1A1^+细胞(图4A-B)，此时ALDH1A1细胞在腺体隐窝中富集(图2Q)。我们在子宫内膜中追踪1天后验证了被标记的上皮和基质细胞数量(图4C，F-G)。追踪7天和28天后，几个腺、腔和亚上皮基质细胞被标记(图4D-E')。当在成年小鼠中进行谱系追踪时，与追踪1天相比，追踪28天后ALDH1A1^+基质细胞的数量扩展，而上皮标记细胞数量没有扩展(图4F-G)。因此，当在成年小鼠中进行谱系追踪研究时，ALDH1A1^+基质细胞的扩展比ALDH1A1^+上皮细胞的扩展更容易观察到。这表明ALDH1A1^+细胞在成年子宫内膜基质细胞扩展中起关键作用。
ALDH1A1^+细胞在产后子宫内膜中被检测到
我们追踪产后子宫内膜中ALDH1A1^+细胞的命运，以观察其在子宫内膜再生过程中的命运(图5)。我们给小鼠注射他莫昔芬以在交配前两个月启动追踪，然后收集产后1、3和5天(PPD1、PPD3和PPD5)的子宫组织(图5A-B)。通过分析靠近胎盘脱离位点的子宫组织，我们观察到RFP阳性细胞存在于子宫内膜的上皮皱褶中，有一些基质细胞表达(图5C-E')。在PPD5，与PPD1和PPD3相比，RFP^+上皮细胞的比例已扩展(图5E-E')。当我们对CK8(上皮细胞标记物)、VIM(基质细胞标记物)和RFP进行免疫荧光成像时，我们观察到PPD3子宫内膜中VIM^+CK8^+过渡性基质/上皮细胞总数与PPD5相比显著更高(19.4±7.48 vs. 3.5±0.5，p<0.05)，表明PPD3时过渡性VIM^+CK8^+细胞丰富，其中一部分过渡细胞也是RFP^+(图5F-K)。我们的结果显示ALDH1A1^+细胞参与产后子宫内膜再生，其中一些还显示过渡性CK8^+和VIM^+细胞标记物的表达。
ALDH1A1^+细胞的消除在体外和体内破坏子宫内膜上皮扩展
为了研究消除ALDH1A1^+细胞群如何影响上皮扩展，我们使用白喉毒素(DT)介导的消除在体外和体内消除ALDH1A1^+细胞，方法是将携带条件性表达白喉毒素受体(DTR)的ROSA26^DTR/DTR小鼠与Aldh1a1^cre/ERT2/+小鼠杂交(图6A-C)。然后我们从成年雌性ROSA26^DTR/DTR;Aldh1a1^cre/ERT2/+小鼠建立子宫内膜上皮类器官。一旦获得成熟类器官，通过用4-OHT处理两天诱导Cre活性，随后进行DT处理(图6A)。来自对照(ROSA26^DTR/DTR)和实验小鼠(ROSA26^DTR/DTR;Aldh1a1^cre/ERT2/+)的类器官在DT处理前在相差显微镜下保持完整(图6D-E)。DT处理后，对照ROSA26^DTR/DTR小鼠的类器官保持完整，而实验组ROSA26^DTR/DTR;Aldh1a1^cre/ERT2/+小鼠的类器官开始解体，变暗，并对裂解caspase-3呈阳性(图6F-I)。
为了在体内检查ALDH1A1消除的影响，我们用他莫昔芬处理对照和实验小鼠，在PND7诱导ALDH1A1^+细胞中的Cre活性，随后在PND10用DT处理。当我们在P56分析小鼠时，我们观察到实验小鼠中ALDH1A1表达降低(图6J-K')。然后我们用CK8和FOXA2对子宫横截面进行免疫染色，结果显示与对照相比，实验小鼠的腺体更少(11.75±8.2 vs. 22±3.4，p<0.05)，FOXA2强度每腺体降低(10,434±2,136 vs. 15,079±3,006，p<0.001)(图6L-O)。这些结果表明ALDH1A1细胞的消除降低了体外上皮类器官扩展和体内FOXA2表达。
人类子宫内膜中ALDH^HI上皮细胞显示成体干细胞的特性和特征
先前研究表明ALDH1A1在人类子宫内膜基底层的腺上皮细胞中富集，这是一个被认为富含成体干细胞的部位(Ma et al., 2020)。为了确定人类子宫内膜中ALDH^HI细胞的再生潜能，我们从供体的原位子宫内膜建立了类器官。我们使用ALDEFLUOR检测法分离ALDH^HI和ALDH^LO细胞，并在体外扩增它们(图7A)。类器官形成实验确定ALDH^HI细胞形成类器官的能力高于ALDH^LO细胞(1.98±0.38 vs 0.58±0.055，p=0.022；9.04±0.72 vs 1.7±0.38，p=0.0008)(图7B-F，补充图S4A-C)。ALDH^HI细胞也在培养中维持了更长的传代，尽管差异在统计学上不显著(23±3 vs. 14±2传代，p=0.0576，n=3名供体)(图7G-J)。
为了确定两种细胞类型之间的基因表达差异，我们对来自三名供体原位子宫内膜的ALDH^HI和ALDH^LO类器官进行了转录组分析。差异表达基因分析显示，与ALDH^LO相比，ALDH^HI类器官中有50个基因增加(>0.5 log2FC，调整后的p值<0.05)和98个基因减少(<-0.5 log2FC，调整后的p值<0.05)(图7K，补充表S3)。基因本体分析显示，ALDH^LO细胞中纤毛细胞富集的基因表达更高，如RSPH4A、CFAP73、DNAI1、SPAG17和其他几个基因，而ALDH^HI细胞中上皮细胞增殖和腺体发育相关基因表达更高，如GATA2、VEGFA和IGFBP3(图7K-M，补充图S5和补充表S3)。在ALDH^HI细胞中增加的基因还包括参与干性的基因，如BMP3、ADH1C、KCP和PLA2R1(图7K，补充表S3)。我们未在各组之间发现ESR1、PGR或其他核激素表达的任何差异(补充表S3)。对原位类器官的ALDH^HI和ALDH^LO类器官进行免疫染色确认，与ALDH^HI原位类器官相比，ALDH^LO类器官中存在显著更多的纤毛细胞(7.2±1.56 vs. 0.77±0.42，p<0.001)(图7N)。因此，在人类子宫内膜上皮细胞中，ALDH^HI细胞表现出更高的类器官形成率，表达更少的纤毛细胞相关基因，干性基因水平增加，符合人类子宫内膜基底层成体干细胞的特征。
讨论
关键研究通过分析绝经后女性的子宫内膜组织来鉴定和表征子宫内膜干细胞，这是一种富含基底层细胞的组织。通过绝经后基底层的研究，AXIN2、SOX9、SSEA1和CDH2阳性细胞现在被广泛接受为定位于人类子宫内膜基底层的上皮细胞祖细胞(Nguyen et al., 2012; Nguyen et al., 2017; Valentijn et al., 2013)。此外，定位于血管周围区域的SUSD2^+基质细胞比SUSD2^-细胞具有更多的集落形成能力。这一细胞群也表达CD140b(PDGFRb)和CD146，被认为是子宫内膜间充质干细胞样细胞(Masuda et al., 2012)。由于其在子宫内膜基底层的富集位置和与CDH2的共定位，ALDH1A1也被提出作为子宫内膜中的干细胞标记物(Ma et al., 2020)。
近期对人类子宫内膜的scRNAseq和空间转录组分析证实了许多提出的子宫内膜干细胞标记物，SOX9^+细胞在子宫内膜基底层中富集，产生SOX9^+/LGR5^+细胞(Garcia-Alonso et al., 2021; Wang et al., 2020)。WNT和NOTCH也被确定为控制子宫内膜干细胞分化的关键生长因子，WNT激活信号控制腔上皮细胞发育，NOTCH维持基底层的干细胞特性(Garcia-Alonso et al., 2021)。在人类子宫内膜的高分辨率单细胞参考图谱中，通过空间转录组学在子宫内膜基底层中鉴定了一个CDH2^+/SOX9^+/AXIN2^+/ALDH1A1^+细胞群体，进一步表明干性ALDH1A1^+细胞的身份(Mareckova et al., 2024)。我们对ALDH^HI与ALDH^LO人类原位子宫内膜细胞的分析与先前发现一致，因为ALDH^LO细胞表现出更多腔样基因表达模式，纤毛相关基因表达显著。相比之下，ALDH^HI细胞比ALDH^LO细胞表现出更高的类器官形成能力。
子宫内膜干细胞被认为与子宫内膜异位症发病机制有关，因为先前研究已在子宫内膜异位症女性的月经液中鉴定出异常。这些包括在子宫内膜异位症女性的月经液中存在更多基底层样组织，含有子宫肌层组织标记物(Leyendecker et al., 2002)。最近研究显示，子宫内膜异位症患者的月经细胞表达更高的SSEA^+/SOX9^+干性标记物(Hapangama et al., 2019)。此外，外显子组测序研究确定匹配的DNA突变存在于原位和异位子宫内膜中，表明子宫内膜异位症女性的子宫内膜固有具有选择性生长优势(Suda et al., 2018)。我们的研究表明，原位ALDH^HI上皮类器官比从ALDH^LO细胞建立的上皮类器官具有更高的类器官形成能力和形成率，支持子宫内膜干细胞存在于月经液中的假设，这些细胞与子宫内膜异位症有关。虽然需要进一步研究以明确ALDH^HI细胞群在子宫内膜异位症中的作用，但我们的研究表明子宫内膜细胞或月经液中ALDH1A1+细胞的存在可能是预测子宫内膜异位症倾向的生物标志物。
很少有小鼠模型被用于进一步定义和表征成年子宫内膜中的干细胞和祖细胞。腔上皮、腺结构和基质细胞受E2的有丝分裂潜力诱导增殖，而P4诱导分化为妊娠做准备。在4-5天动情周期结束时，腺体皱褶通过涉及凋亡或自噬的过程被吸收(Dharma et al., 2001; Popli et al., 2022; Wood et al., 2007; Popli et al., 2023)。出生后子宫的单细胞分析确定了关键的假定干性基因，对子宫内膜的模式形成至关重要(Fu et al., 2020; Spencer et al., 2023; Wu et al., 2017)。此外，谱系追踪研究表明Lgr5^+和Axin2^+是子宫内膜中的长寿命祖细胞，在子宫内膜腺体隐窝中富集并显示干性特征(Seishima et al., 2019; Syed et al., 2020)。最近，Nestin^+血管周围细胞被证明有助于成年小鼠子宫的子宫内膜再上皮化(Li et al., 2025)。
先前缺乏功能测定和谱系追踪研究来进一步表征和确认ALDH1A1^+子宫内膜干细胞群。使用诱导型荧光ALDH1A1报告小鼠，我们表征了ALDH1A1^+细胞在子宫内膜腺体发育、小鼠激素周期和产后再生过程中的存在和贡献。通过对不同发育和成年时间点的ALDH1A1^+细胞进行谱系追踪，我们的结果表明它们产生长期存在于腺和腔上皮中的细胞。小鼠中的子宫内膜腺体发育是一个出生后过程，从约出生后第5天(PND5)开始，到PND21完成(Hayashi et al., 2011; Vue et al., 2018)。出生后时期的腺体模式形成归因于涉及WNT/β-catenin、雌激素受体(ESR1)信号、BMPs和其他复杂网络的信号通路(Rizo et al., 2023; Mericskay et al., 2004; Miller and Sassoon, 1998; Nanjappa et al., 2015)。发育中子宫的转录组分析显示，参与视黄酸(RA)代谢的基因在PND0到PND14达到峰值，然后在PND28开始逐渐下降，表明这一过程在出生后时期腺体模式形成中至关重要(Wu et al., 2017)。与这些发现一致，我们的研究表明ALDH1A1在PND7时在整个子宫腔上皮中高表达，随着腺体发育进展，在PND14时逐渐转移到腺体隐窝。
为进一步解决ALDH1A1^+细胞对腺体发育的影响，我们使用了一个诱导型DT消除模型，其中DTR在ALDH1A1-表达细胞中条件性表达。在PND7进行ALDH1A1^+细胞的DT介导消除，基于消除ALDH1A1^+细胞会损害成年小鼠腺体发育的假设。我们在DT给药56天后分析小鼠子宫组织，确实发现DT介导消除ALDH1A1^+细胞的小鼠腺体更少，FOXA2强度降低。体外实验也获得类似结果，其中ALDH1A1^+细胞的DT介导消除导致类器官死亡。我们在体内发现的腺体部分消除与ALDH1A1敲除小鼠的表型一致，这些小鼠存活且具有生育能力，表明额外ALDH同工酶的补偿可以挽救腺体发育和功能(Matt et al., 2005)。
有趣的是，我们还发现ALDH1A1表达在成年小鼠子宫中是动态的，在动情期局限于隐窝，在动情后期阶段在整个腔和腺区室中扩散染色。我们通过使用用外源激素处理的卵巢切除模型确认这种动态ALDH1A1表达是由激素驱动的。在此模型中，无激素的卵巢切除导致ALDH1A1在整个子宫腔上皮中表达，而E2和P4处理导致表达在腺体隐窝和腔上皮之间动态转移。另一方面，用90天E2丸处理的卵巢切除小鼠显示ALDH1A1完全限制在腺体隐窝，而卵巢切除对照在腔和腺上皮中表达ALDH1A1。因此，可能在缺乏激素的情况下，子宫上皮采取更具可塑性的状态，腔和腺细胞均显示干性特征。相反，在E2的有丝分裂作用下，当上皮细胞周转较高时，ALDH1A1^+细胞被限制在腺体隐窝中，作为后续增殖周期的储备。
视黄醛转化为视黄酸由ALDH1A酶驱动，这些酶在发育和成年子宫内膜中以时空限制的模式表达(Vermot et al., 2000; Wu et al., 2017)。在成年中，我们观察到ALDH1A1定位于动情期小鼠子宫内膜腺体的隐窝和补充了雌二醇丸的卵巢切除小鼠中(补充图S1)。视黄酸受体(RAR)局部合成和活性可能对维持成年子宫内膜上皮细胞的干性至关重要，允许在周期关键阶段暴露于雌二醇时进行细胞增殖和分化。这一观点得到研究表明雌激素诱导阴道和宫颈上皮细胞分层并增加基底上皮细胞中RAR(及其异二聚体伙伴RXR)表达的支持，表明雌激素和视黄酸信号通路汇聚(Celli et al., 1996; Tannous-Khuri and Talmage, 1997)。此外，最近使用子宫条件性消除RARA/RARB/RARG与孕激素受体cre的研究表明，这些小鼠在RAR消除后子宫腔上皮出现过度分层(Yin et al., 2025)。因为不适当的上皮细胞分层通过Fulvestrant(一种有效的雌激素受体拮抗剂)给药被抵消，作者得出结论：RA/RAR信号拮抗E2/ER作用，对成年上皮细胞命运维持至关重要。因此，ALDH1A1活性通过其对RA/RAR活性和E2/ER信号的影响，驱动子宫内膜细胞分化并在子宫内膜上皮中维持静止干样细胞储备是可能的。
此外，我们先前研究表明，子宫中转化生长因子β(TGFβ)信号通路下游效应因子的条件性消除，SMAD2和SMAD3，破坏上皮细胞稳态，导致过度的雌激素依赖性细胞增殖、子宫内膜肿瘤和视黄酸代谢紊乱(Kriseman et al., 2019; Kriseman et al., 2023; Monsivais et al., 2019)。因此，TGFβ/SMAD2/3对于将RA/RAR依赖性拮抗E2作用整合到上皮中，从而指导成年子宫内膜中的增殖和分化程序也很可能是关键的。然而，控制这种拮抗作用的确切机制尚不清楚，可能涉及子宫内膜基质和上皮之间的旁分泌信号网络。ALDH1A1和其他ALDH同工酶是否控制基质中类似的增殖和干性程序仍有待评估。
我们还发现，当追踪在成年小鼠中开始时，ALDH1A1^+基质细胞更为普遍。其他研究表明，间充质细胞通过MET过程在产后阶段或诱导月经后有助于子宫内膜再生(Cousins et al., 2014; Kirkwood et al., 2022; Li et al., 2025)。这促使我们确定ALDH1A1^+基质细胞是否有助于产后阶段的上皮再生。在周期性小鼠中，我们在ALDHA1^+细胞中发现散在表达上皮和基质标记物的细胞。然而，PPD3再生子宫内膜的分析显示，与PPD5子宫内膜相比，表达VIM/CK8/RFP的细胞数量更多，表明这些过渡细胞在PPD3更频繁。我们注意到并非所有Vim^+/CK8^+细胞都表达ALDH1A1^+，表明由所有三种标记物标记的细胞代表在产后阶段贡献于MET的细胞亚群。然而，因为在标记时上皮和基质细胞均表达ALDH1A1，这不排除我们观察到的过渡性VIM/CK8/RFP细胞正在进行EMT而非MET。
总体而言，我们的谱系追踪、消除和再生模型表明ALDH1A1^+子宫内膜细胞表现出成体干细胞的特征。在人类和小鼠中，ALDH^HI与ALDH^LO子宫内膜细胞的类器官形成实验支持这些发现，并将ALDH1酶的活性置于子宫内膜再生潜能的中心调节者位置。这在成年周期性小鼠子宫的scRNAseq分析中也观察到，其中缺乏增殖标记物的ALDH1A1^+细胞与Lgr5和Axin2-表达细胞聚类，显示EpSC的轨迹产生腺和腔细胞。通过与先前研究中表征的EpSC的scRNA谱整合(Padilla-Banks et al., 2023; Winkler et al., 2024)，这一细胞群和数据集可用于识别和表征成年子宫内膜上皮中的额外干细胞。此外，我们在人类子宫内膜中的研究扩展了我们对ALDH1A1作为成年子宫内膜干细胞标记物的表征，并强调了ALDH1A1^+在子宫内膜再生潜能中的重要性。
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