亚甲蓝保护毛囊干细胞免受氧化和代谢压力以增强毛发再生Methylene blue protects hair follicle stem cells from oxidative and metabolic stress to enhance hair regeneration | Aging

摘要

毛囊干细胞(HFSCs)对于维持毛发生长和再生至关重要。它们的功能障碍，通常由氧化压力或代谢失衡引起，会导致脱发和头皮老化。β-连环蛋白是Wnt信号通路中的关键蛋白，其活性对HFSC的维持和再生至关重要。在本研究中，我们发现亚甲蓝(MB)，一种线粒体靶向抗氧化剂，通过减少活性氧(ROS)和激活β-连环蛋白信号通路来促进HFSC的增殖和存活。功能性测试表明，MB显著加快了HFSC培养物中的伤口愈合，表明其再生能力增强。尽管与维生素A和C等抗氧化剂联合治疗改善了ROS清除，但出人意料的是，它降低了MB诱导的β-连环蛋白激活。相反，临床上批准的毛发生长刺激剂米诺地尔与MB协同作用，进一步激活β-连环蛋白信号并增强HFSC的存活率。最后，暴露于胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1 RAs)导致HFSC存活率呈剂量依赖性下降，这与新兴的治疗相关脱发报告一致。值得注意的是，MB预处理保护HFSC免受GLP-1 RA诱导的代谢压力和过早细胞死亡。总体而言，这些发现将亚甲蓝确定为一种多功能治疗候选物，它能够减少氧化和代谢压力，同时支持HFSC介导的毛发再生。

Introduction

亚甲蓝(MB)是一种已有百年历史的药物，以其强大的抗氧化特性而闻名[1, 2]。MB容易渗透细胞隔室内的生物膜，因为它既溶于水又溶于有机溶剂[3, 4]。它有很长的医学应用历史，曾用于治疗多种人类疾病，包括高铁血红蛋白血症、疟疾、血管麻痹、败血性休克、癌症化疗诱导的毒性以及神经退行性疾病[5-7]。MB的有益作用部分与由NF-E2相关因子2(Nrf2)和抗氧化反应元件(ARE)调控的基因表达增加有关[1]。先前的研究表明，MB可能延长细胞寿命，增强细胞增殖，并降低衰老生物标志物p16的表达[3, 5, 8]。此外，MB吸收UVA/B辐射，并保护原代人角质形成细胞免受UVA/B诱导的DNA损伤[9]。此外，Xiong等人证明，MB对Hutchinson-Gilford早衰综合征患者的皮肤成纤维细胞具有促细胞增殖和抗衰老特性，突显了其在早衰细胞中恢复线粒体和细胞核功能的潜力[10]。

头皮是一个独特的解剖区域，由面部和颈部界定，其特征是终毛毛囊密度高且皮脂腺丰富[11]。毛囊在发育过程中的形成依赖于上皮细胞和间充质细胞之间分子信号的动态交换，建立了一生的毛发生长和更新周期[12]。这种再生过程由毛囊干细胞(HFSCs)驱动，这是一群位于毛囊隆起区域的多能成体干细胞[13, 14]。HFSCs表达标志性的干细胞标记物，尤其是CD34和K15[15]，它们与真皮乳头细胞的相互作用对于维持干细胞活性和引导新毛发生长至关重要[16, 17]。然而，由环境压力因素如紫外线照射和细菌感染引起的活性氧(ROS)过量产生所导致的氧化压力，可能会破坏这些微妙的细胞相互作用。随着时间的推移，这种压力导致头皮皮肤老化、毛囊退化和过早脱发[11]。

HFSC的维持以及毛囊发育、循环和再生过程依赖于复杂的细胞信号网络。其中，Wnt/β-连环蛋白通路作为关键调节因子，驱动HFSC激活并启动毛发再生[18]。氧化压力影响β-连环蛋白的功能。在非常低水平的氧化压力下，β-连环蛋白与FOXO转录因子的相互作用会创建保护性细胞反应以对抗氧化损伤[19]。相反，较高水平的ROS也可以刺激细胞增殖、凋亡、细胞衰老和转化[20, 21]。此外，雄激素性脱发的特征也是HFSC的耗竭或休眠，并涉及关键信号通路（如Wnt/β-连环蛋白通路）的失调。

已研究了几种小分子药物样物质刺激毛发生长和预防秃发的能力，其中米诺地尔是最知名且广泛使用的[22]。它通过刺激毛囊细胞和减少脱发来增强毛发生长，但许多用户在停止治疗后会经历逐渐脱落[23]。尽管米诺地尔很受欢迎，但其精确的药理机制仍未完全明确[24]。研究表明，米诺地尔在人真皮乳头细胞中激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，为其延长毛囊生长期(anagen)的能力提供分子解释[25]。有趣的是，新兴的临床观察显示，GLP-1受体激动剂(GLP-1 RAs)，尽管在减重和代谢控制方面非常有效，但可能与某些个体早发性脱发或毛发稀疏有关[26]。这些发现突显了代谢和毛囊信号通路之间的复杂相互作用，并强调了识别能够对抗治疗诱导的毛囊压力的保护性或修复性药物的重要性。

基于MB对人类皮肤细胞增殖和再生的益处的先前发现，我们假设MB可能通过β-连环蛋白信号通路促进HFSC的增殖和维持。在此，我们还旨在确定MB与米诺地尔联合使用是否能协同刺激β-连环蛋白信号通路，保护HFSC免受GLP-1诱导的氧化压力，并维持毛囊健康。

Results

亚甲蓝处理不会改变关键HFSC干性标记物的表达

为了评估MB对HFSC的影响，我们首先检查了MB处理是否改变关键干性标记物CD34和K15的表达。HSFCs用或不用100 nM MB处理0至15天，然后通过免疫荧光分析CD34和K15的表达。100nM的MB浓度是基于先前的研究[3, 5, 8, 9]确定的。与载体处理的对照HSFC相比，即使经过长期暴露，MB处理也没有改变CD34或K15的表达（图1A）。与这些结果一致，15天后的Western blot分析证实MB对CD34和K15水平没有显著影响（图1B，1C）。此外，长期MB处理（15天）对细胞周期进程没有可检测到的影响（图1D）。

MB处理通过减少ROS和增加β-连环蛋白激活来诱导HFSC的增殖和存活

接下来，我们检查了MB对HFSC增殖、存活率、ROS水平和β-连环蛋白激活的影响。MB处理显著增强了HFSC的增殖和存活率（图2A，2B）。在生理条件下，低水平的内源性ROS暂时激活HFSC微环境并促进伤口愈合；然而，过量的ROS积累导致氧化压力，造成干细胞损伤[27]。MB处理12-15天后的流式细胞术分析显示，与载体处理的对照相比，内源性ROS显著减少（图2C）。由于β-连环蛋白已知可调节HFSC的增殖和分化[28]，我们进一步评估了MB处理后HFSC中β-连环蛋白的激活状态。MB增加了HFSC中β-连环蛋白的激活，表现为即使在15天处理后，核内β-连环蛋白水平升高和信号增强（图2D，2E）。总体而言，这些结果表明MB可能通过减少氧化压力和激活β-连环蛋白介导的信号来促进HFSC的增殖和存活。

MB处理加快HFSC中的伤口愈合

Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活通过促进细胞增殖、迁移、组织重塑以及激活干细胞和生长因子表达，在伤口愈合中起着关键作用[29]。鉴于MB增加了HFSC中β-连环蛋白的激活，我们使用划痕实验评估了其对细胞伤口修复的影响，这是一种简化的体外伤口愈合系统，模拟集体细胞迁移和间隙闭合。与PBS处理的对照相比，MB处理显著加速了伤口闭合，在36-48小时内实现了近乎完全的闭合（图3A，3B）。这些发现表明MB通过β-连环蛋白介导的再生通路激活，增强了HFSC中的细胞迁移和恢复。

与维生素A和C联合治疗减弱了MB诱导的HFSC中β-连环蛋白激活

维生素A和C是众所周知的抗氧化剂，通过减少ROS诱导的氧化压力来保护细胞免受氧化损伤[30]。虽然它们的抗氧化作用已得到充分证实，但它们对β-连环蛋白激活的影响仍不清楚。令人惊讶的是，无论是单独还是与100 nM的MB联合使用，维生素A(100nM)或维生素C(100μM)在10天治疗后都没有增加β-连环蛋白激活，超过单独使用MB处理所观察到的效果（图4A，4B）。这些结果表明，虽然与抗氧化剂维生素A或C联合治疗可能会增强抗氧化能力，如先前所示，但它可能矛盾地抑制β-连环蛋白介导的HFSC增殖和功能激活。

米诺地尔提高HFSC存活率并与MB处理协同激活β-连环蛋白

米诺地尔是一种广泛使用的毛发生长刺激剂，通过激活人真皮乳头细胞中的Wnt/β-连环蛋白信号通路来促进毛囊再生[25]。为了研究其对HFSC的影响，我们用1、2.5和5 μM的米诺地尔处理HFSC 5天[24]。与载体处理的对照相比，只有1 μM的米诺地尔在5天后增加了HFSC的存活率（图5A）。此外，100 nM的MB和1 μM的米诺地尔联合处理协同增强了HFSC中β-连环蛋白的激活，表现为活性β-连环蛋白蛋白的表达显著升高（图5B，5C）。这些发现表明，米诺地尔促进毛发生长的活性至少部分是通过β-连环蛋白激活介导的，并且与MB联合处理可以进一步放大这种再生效果。

亚甲蓝保护HFSC免受GLP-1 RA诱导的代谢压力

最近的临床观察表明，尽管胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1 RAs)对体重管理有效，但它们也可能导致某些个体过早脱发，可能是由于毛囊压力或干细胞信号传导的中断[31]。为了在体外探索这一机制，我们首先检查了各种细胞类型中GLP-1受体(GLP-1R)的表达，并确认其在HFSC中的存在（图6A）。这表明HFSC对GLP-1 RAs可能有反应性。用增加的GLP-1 RA浓度(250-1000 nM)处理HFSC 5天[32]导致细胞存活率呈剂量依赖性下降（图6B，黄色条），这与代谢压力诱导的细胞毒性一致。值得注意的是，用100 nM的MB预处理一周，然后与MB共同处理，在GLP-1 RA暴露下显著保持了HFSC的存活率，即使在1000 nM下也是如此（图6B，蓝色条，和图6C）。这些结果表明，MB通过维持线粒体完整性和持续β-连环蛋白介导的再生信号，保护HFSC免受GLP-1 RA诱导的代谢压力。

Discussion

头皮和毛囊不断暴露于紫外线(UV)辐射下，这可能导致氧化压力、DNA损伤和毛囊干细胞的过早老化[11]。传统防晒霜主要使用氧化锌和二氧化钛等无机过滤器或氧苯酮等化学吸收剂，它们在角质层反射或吸收UV光，但一旦UV光子穿过表皮，就无法提供保护[9, 33]。因此，人们越来越有兴趣识别能够中和皮肤内UV诱导的氧化损伤的生物活性化合物，而不仅仅是外部反射辐射。MB是一种最初于1876年合成并获得FDA批准用于医疗的试剂[9, 34]。它作为一种线粒体靶向抗氧化剂，具有充分记录的有效性，可逆转早衰和正常人类皮肤细胞中的老化特征。我们和他人的先前研究表明，MB可保护真皮成纤维细胞免受UVB诱导的DNA损伤，增强线粒体功能，并增加胶原蛋白产生[2, 10, 35]。这些特性，加上MB在550-700 nm范围内吸收UV光的自然能力，使其成为一种新的细胞内UV阻断化合物。在头发稀疏的情况下，头皮直接暴露在阳光下，MB提供了一层生物保护层，通过减少氧化压力、保护干细胞健康和支持头皮的再生能力，与传统防晒霜协同工作。总体而言，这些特性使MB成为促进头皮健康的极佳活性成分。

除了保护头皮外，我们还进一步证明了MB在HFSC中减少ROS诱导的细胞损伤的能力。我们还表明MB增强了HFSC的增殖，并可能具有支持伤口愈合过程的潜力，可能是通过激活β-连环蛋白（图2，3）。为了评估MB的联合抗氧化效果，我们将它与维生素A和C配对，这是两种众所周知的ROS清除剂。然而，只有MB独特地激活了Wnt/β-连环蛋白信号通路，这对于HFSC的增殖、维持和毛发再生至关重要（图4）。相比之下，在相同条件下，维生素A或维生素C对Wnt/β-连环蛋白信号通路没有任何积极影响。令人惊讶的是，与维生素A或C联合处理减弱了MB诱导的HFSC中β-连环蛋白激活（图4）。事实上，维生素A衍生物（类视黄醇）已知通过与视黄酸受体相互作用促进其磷酸化和降解来抑制β-连环蛋白通路[36]。同时，维生素C具有复杂的、依赖于上下文的效果，根据细胞类型和条件，可能抑制或激活Wnt/β-连环蛋白通路。与此同时，MB诱导了持续的β-连环蛋白激活，伴随着HFSC增殖和伤口愈合能力的增加。这突显了MB的独特双重功能；它不仅像传统抗氧化剂一样减少氧化压力，还刺激促再生的β-连环蛋白信号，而类视黄醇（维生素A）和维生素C要么缺乏这一特性，要么与其相悖。

除了其内在生物活性外，MB还增强了现有毛发生长刺激剂的性能。米诺地尔是一种抗高血压药物，后来因其意外与多毛症的关联而被重新配制用于局部使用，长期以来一直用于治疗雄激素性脱发并促进毛发再生[22, 37, 38]。最近的研究表明，米诺地尔在真皮乳头细胞中激活Wnt/β-连环蛋白通路，这与我们观察到的米诺地尔增加HFSC中β-连环蛋白激活的结果一致（图5）。重要的是，与MB联合处理显著放大了这种效果，表明存在协同相互作用，可以在较低药物剂量下增强干细胞增殖和信号传导，从而可能减少米诺地尔的常见副作用，如头皮刺激、头皮屑或不希望的体毛生长[23, 39]，同时减少药物暴露。

除了环境压力外，代谢因素和治疗药物如GLP-1 RAs也可能损害毛囊完整性，导致过早脱发。我们的研究进一步揭示MB可能保护HFSC免受GLP-1 RA诱导的代谢压力（图6），表明了一种可能有助于减轻脱发的潜在机制，这需要在体内模型中进行验证。

本研究中使用的浓度在体外实验的已建立范围内，旨在模拟细胞反应，而非反映直接的临床剂量[32]。需要注意的是，体外剂量并不直接转化为体内的生理暴露水平。因此，在考虑临床应用之前，需要进行未来研究以确定药代动力学，优化剂量策略，并在相关体内模型中定义治疗窗口。

健康的头皮为毛发生长提供了必要的"土壤"，而HFSC则充当能够实现毛囊更新和再生的再生"种子"。通过保护头皮微环境和支持HFSC功能，MB强化了健康毛发生态系统的两个关键方面。此外，MB广泛的抗菌特性可能有助于恢复平衡的头皮微生物组，这越来越被视为头皮屑、脂溢性皮炎和特应性皮炎等头皮状况的因素[40-42]。这些发现将MB定位为一种多功能分子，它能保护头皮和毛囊，补充米诺地尔等传统治疗方法，并使HFSC免受代谢和药理挑战，促进有韧性的健康头皮环境。

Materials and Methods

细胞培养和抗氧化处理

从毛囊隆起提取的人类前额头皮区域HFSC购自Celprogen Inc. (36007-08)。HFSC在Celprogen的人类毛囊干细胞完全生长培养基(M36007-08S)中培养，并在涂有"人类毛囊干细胞细胞外基质"的平板上每48至72小时传代一次。亚甲蓝(MB; #NDC 54288-147-01)溶于PBS，并以最终浓度100 nM添加到HFSC培养基中。维生素A以100 nM应用，维生素C以100 μM应用。

细胞增殖

将所需数量的细胞（0.1百万）接种到ECM涂覆的6孔板上，第0天开始。每3天使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(#25200056)进行传代，记录对照组和MB处理（100 nM）两周内的细胞计数。

免疫荧光

对于免疫荧光，将细胞接种到ECM涂覆的4孔腔室载玻片上24小时后，用PBS洗涤两次，并用4%甲醛(PFA)在室温下固定20分钟。然后用PBS中的0.5% Triton通透5分钟。将细胞用1X TBS缓冲液洗涤两次，并在TBS中用4% BSA在室温下封闭1小时。接下来，将细胞在4°C下与TBS中4% BSA中的初级抗体孵育过夜。次日，用TBS洗涤五次后，将细胞与稀释在TBS中4% BSA中的次级抗体在室温下孵育1小时。然后用1X TBS洗涤五次，并用含DAPI的抗褪色封固剂(Vectashield #H-1200)封固。免疫荧光使用的初级抗体包括：CD34（1:500，Santa Cruz-7324 IgG1 κ小鼠单克隆）和K15（1:500，Santa Cruz-47697 IgG1 κ小鼠单克隆）。使用的次级抗体是Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG（1:1000，Invitrogen）。

氧化压力测定

使用细胞ROS测定试剂盒（Abcam, ab113851）评估氧化压力。细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA解离，计数（用于染色的2×10^5个细胞），并用1× PBS洗涤。在1× PBS缓冲液中配制12.5 μM DCFDA溶液，将细胞重悬于300 μL该溶液中。包括一个仅缓冲液的对照样品，并在37°C下避光孵育30分钟，同时间歇摇动。使用FACS Canto（BD）进行流式细胞术，并用FlowJo软件分析数据。

蛋白质印迹分析

用于免疫印迹的全细胞裂解液通过在冰上孵育10分钟制备，使用1X细胞裂解缓冲液（10X储备浓度，Cell Signaling # 9803S），包含磷酸酶抑制剂混合物2（Millipore Sigma # P5726）和PMSF（100 mM储备液，工作浓度1 mM）（Cell Signaling）。添加含有3X蓝色上样缓冲液（Cell Signaling #56036S）和还原剂1.25M DTT（Cell Signaling #14265S）的样品缓冲液。在冰上孵育10分钟后，使用细胞刮刀收集细胞并以15000g离心10分钟。仅将含有蛋白质的上清液转移到新管中，并使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度。然后，将20 μg蛋白质样品在95°C下煮沸5分钟，加载到10%聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上，随后使用Turbo blot（Bio-Rad）转移到0.45 μm孔径的硝酸纤维素膜（Bio-Rad）上。膜在5%脱脂奶中于室温下封闭1小时。在4°C下与初级抗体孵育过夜，然后在室温下用次级抗体探针1小时，接着进行ECL显影和成像（Bio-Rad）。用于免疫印迹的初级抗体包括：活性β-连环蛋白（Cell Signaling，1:1000）；总β-连环蛋白（Cell Signaling，1:1000）；和β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich，1:5000）。

细胞周期分析

细胞用0.25%胰蛋白酶收获并用PBS洗涤一次。细胞沉淀重悬于每1-2×10^6个细胞100 μL的1× PBS中，然后剧烈涡旋。然后边轻轻涡旋边逐滴加入冰冻70%乙醇（1 mL），样品在4°C下孵育1小时。PBS洗涤一次后，用RNase A（1 μg/μL在1× PBS中）处理细胞，并在37°C下孵育30分钟。然后加入碘化丙啶（5 μg；Invitrogen），样品在37°C下再孵育30分钟。使用BD FACSCanto II进行流式细胞术，并使用FlowJo软件分析数据。

XTT测定（细胞存活率测定）

使用四唑盐XTT，即3'-[1-[(苯氨基)-羰基]-3,4-四唑基]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸盐水合物，进行细胞存活率测定。将对照和预处理的HFSC以每孔100 μL接种到96孔板中。24小时后，向每孔加入70 μL XTT工作试剂，并将板在CO2培养箱中于37°C孵育4小时。然后在590 nm处读取吸光度。

划痕实验

将对照和预处理的HFSC细胞接种到预涂覆的12孔板中，并孵育至单层达到75-80%汇合度。使用200 μL移液器尖端在单层上划出划痕。用新鲜培养基轻轻洗涤单层以去除脱落的细胞，然后加入新鲜培养基。在开始时和定期间隔拍摄划痕图像，并测量细胞迁移速率。

米诺地尔处理

在第0天将所需数量的细胞（0.1百万）接种到ECM涂覆的板上。细胞用MB或对照处理7天，并以不同浓度的米诺地尔（#J61803.03，Thermo Scientific）与或不与MB共同处理长达5天。使用XTT评估细胞存活率。制备细胞裂解液以测量活性和总β-连环蛋白的表达。

GLP-1 RA处理

在第0天将所需数量的细胞（0.1百万个细胞）接种到ECM涂覆的6孔板上。细胞用MB或对照处理7天，然后以各种浓度的GLP-1 RA（#G8048，Sigma-Aldrich）与或不与MB共同培养长达5天。记录处理和未处理细胞的细胞计数。

作者贡献

K.S.和K.C.构思并设计了研究。K.S.进行了实验并收集了数据。H.X.协助实验程序和数据分析。K.S.和K.C.分析和解释了数据。K.C.监督了项目。K.S.和K.C.撰写了手稿。所有作者审阅并批准了最终手稿。

致谢

感谢Cao实验室所有成员在整个研究过程中提供的宝贵讨论、技术支持和建设性建议。我们还感谢细胞生物学和分子遗传学系成像核心设施的支持。

利益冲突

K.C.是Mblue Labs的创始人。其他作者声明没有竞争利益。该公司在研究设计、数据收集、数据分析、手稿准备或发表决定中没有任何作用。

资金

本工作部分得到马里兰州产业合作伙伴关系(MIPS)计划的支持。资金来源在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

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