急性心肌梗死后免疫反应的单细胞解析
摘要
背景： 免疫系统在ST段抬高型心肌梗死（STEMI）中的作用尚不明确，但它是复发性心血管事件的重要驱动因素。虽然抗炎药物在降低复发风险方面显示出前景，但其对免疫系统的广泛抑制可能导致严重副作用。为克服这些挑战，需要对STEMI的免疫反应有细致入微的理解。
方法： 为此，我们比较了38名STEMI患者（入院时、24小时后及STEMI后6–8周）和38名对照者的外周血单个核细胞单细胞RNA测序（scRNA-seq）及血浆蛋白表达随时间的动态变化（共95,995个疾病细胞和33,878个对照细胞）。
结果： 与对照组相比，STEMI患者在入院时经典单核细胞增加，CD56dim自然杀伤细胞减少，并持续至STEMI后24小时。最大的基因表达变化出现在单核细胞中，与Toll样受体、干扰素和白细胞介素信号通路活性改变相关。最后，一个靶向心血管生物标志物面板显示，STEMI后33/92的蛋白表达发生改变。有趣的是，IL-6R、MMP9和LDLR受到冠心病相关遗传风险变异、疾病状态和STEMI后时间的影响，表明在定义未来潜在疗法时考虑这些方面的重要性。
结论： 我们的分析揭示了STEMI所扰乱的免疫学通路，明确了受影响的细胞类型和疾病阶段。此外，通过识别在疾病不同阶段影响这些（药物靶向）通路结局的遗传变异，我们为哪些患者最可能从抗炎治疗中获益提供了见解。这些发现增进了我们对STEMI后免疫反应的认识，并为未来的治疗研究提供了指导。
正文
参见Yarahmadi & Nguyen的社论
ST段抬高型心肌梗死是死亡和发病的主要原因。免疫系统在动脉粥样硬化斑块形成、破裂以及随后的炎症反应中都至关重要。靶向这种反应一直具有挑战性，因为其复杂性和严重副作用，正如CANTOS和ASSAIL-MI试验中所见。为克服这些挑战，需要在更深入的分子和细胞水平上研究STEMI后的病理生理机制。
以往研究细胞类型依赖于使用预定义标志基因的批量分析。单细胞RNA测序目前能够对数十万个单个细胞同时进行无偏的全转录组分析。该技术通过同时描绘细胞类型组成、基因表达水平和下游通路在不同细胞分辨率下的变化，揭示了STEMI后炎症反应的新见解。
心脏、血液的正常生理过程以及动脉粥样硬化和新生血管形成的病理生理过程已在单细胞水平上得到研究。一项STEMI后心脏的空间多组学图谱显示，与健康对照相比，缺血样本中淋巴样细胞和髓样细胞之间的依赖性增强，表明它们在心脏修复期间的通讯。虽然STEMI的许多方面已被探索，但关于循环免疫细胞在急性和慢性期如何受到影响，仍缺乏详细的单细胞视角。
在本研究中，我们比较了来自38名STEMI患者（入院时、24小时后、STEMI后6–8周）的95,995个外周血单个核细胞的scRNA-seq数据与来自38名年龄和性别平衡的一般人群对照者的33,878个外周血单个核细胞。这揭示了细胞类型组成、基因和血浆蛋白表达水平以及细胞间通讯方面的巨大变化，无论是在与对照者比较时还是在STEMI后自身比较。此外，我们发现关键血浆蛋白受到遗传学、疾病状态或疾病阶段的综合影响。总之，本研究提出了STEMI期间循环免疫系统的首个单细胞视图，并强调了考虑个体和疾病相关特征以充分理解潜在分子变化的重要性。
方法
方法见补充材料。本研究已获格罗宁根大学医学中心伦理委员会批准。所有患者均提供书面知情同意。
结果
患者特征
为解析STEMI后的免疫反应，在入院时、STEMI后24小时和6–8周时收集了38名首次STEMI患者的外周血单个核细胞和血浆。STEMI患者主要为男性（84%），年龄60±11岁，中位体质指数26.4±3.5 kg/m²。大多数患者表现为单支血管狭窄（55%），39%出现完全血管闭塞。这些患者与LifeLines DEEP队列中38名年龄和性别平衡的对照者的已发表scRNA-seq数据进行了比较。
STEMI患者和对照者的免疫细胞单细胞分析
收集的外周血单个核细胞用于10X Genomics scRNA-seq分析（使用v2和v3化学试剂）。在质量控除后，我们每个STEMI患者个体/条件平均捕获842个细胞（v2: 831基因/细胞，v3: 1548基因/细胞），每个对照者捕获891个细胞（v2: 1012基因/细胞，v3: 1931基因/细胞）。为将供体匹配到细胞并识别双峰，进行了基因型依赖的解复用，发现1个错误遗漏的供体时间点组合和平均10.0%的双峰。由于技术差异，按化学试剂分别进行质控。质控后，最终数据集保留了129,873个细胞（95,995个疾病细胞和33,878个对照细胞）。对归一化、整合的计数数据进行K近邻聚类，从而识别细胞类型。
STEMI后单核细胞和自然杀伤细胞出现组成变化
我们在STEMI患者和对照者的外周血单个核细胞中识别出10种主要细胞类型，包括B细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、树突状细胞、造血干细胞和祖细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、浆母细胞、血小板和其他T细胞。这些主要细胞类型可进一步分为29种次要细胞群体。
为进行稳健的细胞类型组成分析，我们最初集中于6种最丰富的细胞类型，之后针对显著变化的亚型进行深入分析。与对照相比，STEMI患者入院时单核细胞比例增加，NK细胞比例减少。这些变化主要源于经典单核细胞和NKdim亚型内的组成变化。同样，在病程中，我们观察到单核细胞和NK细胞的组成变化，也源于经典单核细胞和NKdim的变化。此外，CD4T细胞在STEMI后6–8周时增加，此变化不能归因于特定细胞亚型。这些分析表明，以更高分辨率分析组成变化的重要性。
最大的基因表达变化发生在单核细胞
为分配STEMI入院时与对照相比的基因表达差异，我们使用Limma Dream对6种主要细胞类型进行了伪批量差异表达分析。CD4T细胞（690个基因）和单核细胞（681个基因）变化最大，而B细胞变化最小（62个基因）。总体而言，更多基因下调，且大多数在单核细胞中唯一识别。随后，我们将差异表达基因分为上调和下调两组，并分别进行通路富集分析。最大的富集通路类别是免疫反应。因此，我们聚焦于该类别，观察到单核细胞中上调的差异表达基因富集最强；促炎和抗炎白细胞介素、趋化因子以及CLEC7A炎症小体通路均被富集。
随后对STEMI后的差异表达进行比较，显示从24小时到6–8周，差异表达基因数量普遍减少。再次，单核细胞（而非CD4T细胞）在STEMI后具有最大数量和最多的独特差异表达基因。同样，这些在单核细胞中上调的基因主要富集于免疫反应通路。在疾病过程中，抗炎通路的富集保持稳定或进一步增加，而参与单核细胞趋化的基因在24小时达到峰值。这些结果独立于已观察到的细胞类型组成变化，表明单核细胞在STEMI后免疫变化中贡献显著。
STEMI后单核细胞显示出最多的潜在差异细胞间通讯
由于许多富集通路与细胞间通讯相关，我们接下来定义了免疫细胞类型之间的相互作用如何可能解释STEMI后观察到的基因表达变化。为此，我们使用了一种细胞间通讯工具，通过假设基于一种细胞类型中配体表达和另一种细胞类型中已知配体-受体相互作用的下游基因表达变化来预测潜在相互作用。在STEMI急性期，传出通讯在各细胞类型间大致平衡，而传入通讯在CD8T细胞和单核细胞中最大。在慢性期，树突状细胞和B细胞是最大的发送者，而NK细胞和单核细胞是最大的接收者。这些配体-受体对大多数仅由一种细胞类型参与；与差异表达分析相似，单核细胞表现出最多的独特相互作用。虽然这种生物信息学推断的通讯仅为预测，需要额外的实验验证，但分析是以比较方式进行的。因此，任何方法引起的偏差在每个比较中将是可比的，不会影响已识别的结果。
STEMI后心血管疾病相关蛋白发生变化
由于血浆蛋白的变化提供了对全身后果的额外见解，并且在临床随访中易于监测，我们随后分析了疾病过程中92种已知或探索性人类心血管和炎症标志物的血浆水平。这揭示了在第一24小时内14/92的蛋白变化，在STEMI后前8周内28/92的蛋白变化。急性期上调最显著的前三种蛋白是NT-proBNP、IL1RL1和CHI3L1。NT-proBNP和可溶性IL1RL1都是已知在STEMI期间对壁应力增加作出反应而上调的蛋白。此外，两者都是心力衰竭和心血管死亡的独立预测因子。CHI3L1是一种参与动脉粥样硬化和斑块破裂的细胞外基质蛋白。这表明CHI3L1上调可能导致STEMI，而NT-proBNP和IL1RL1反映了STEMI诱导的心肌细胞机械应力。急性期下调最显著的前三种蛋白是SPON1、AZU1和IGFBP1。这些蛋白先前均与STEMI前的过程相关，或因STEMI治疗失败而导致。因此，它们的持续下调可能表明有效治疗，从而导致血运恢复并最终保护心脏功能。
在慢性期，上调最显著的前三种蛋白是NT-proBNP、PCSK9和MMP2。NT-proBNP水平的增加可能反映了进一步增加的壁应力。PCSK9参与低密度脂蛋白受体（LDLR）的降解，因此可能反映了高脂血症或患者的他汀类药物治疗。MMP2在纤维化通路中起作用并参与心脏重构。SPON1和AZU1在8周时继续下调。此外，髓过氧化物酶（MPO）被发现下调，这是一种通过局部氧化组织损伤导致斑块不稳定的蛋白。总之，这些变化提示心脏功能和血流的持续恢复。
当试图使用scRNA-seq数据分配这些差异蛋白的潜在细胞来源时，我们只能在相同条件比较中的至少一种细胞类型中复现4/34的差异表达蛋白。这种低mRNA-蛋白可复现性可能反映了捕获内容的固有差异：批量血浆蛋白与单细胞来源的mRNA。
在48名STEMI患者组成的相似队列中，相同的血浆蛋白在入院时和STEMI后3个月进行比较，显示29/92的差异表达蛋白。其中12个在我们的研究中得到复现，且主要涉及STEMI相关过程，如免疫反应和组织重塑，表明稳健性。
基因和蛋白表达谱与生化定义的心梗面积无关
STEMI患者在发病时呈现不同症状。尽管我们的研究标准缩小了临床变异，但供体间变异仍然存在，受年龄、性别、心梗面积和遗传学等因素影响。为评估心梗面积与分子测量之间的关联，我们使用血浆峰值CK-MB水平作为替代指标。该生物标志物在24小时内达到峰值并可预测左心室功能障碍。在任何时间点，细胞类型比例或单核细胞基因表达均未显示出与峰值CK-MB的显著关联。然而，NT-proBNP与峰值CK-MB呈正相关。这种心肌壁应力标志物常用于评估左心室功能障碍，因此在CK-MB达到峰值的时间段内两者预期相关。
冠心病相关遗传风险变异对已知药物靶点的血浆蛋白表现出疾病和条件依赖性效应
除心梗面积外，遗传变异也影响患者的分子反应。在评估患者病程和制定个体化治疗时认识到这一点至关重要。由于血浆蛋白提供了潜在治疗靶点的库，我们评估了遗传变异对这些蛋白的影响。为提供直接的临床联系，我们聚焦于冠心病相关变异。在92种蛋白中，有3种在STEMI后的至少一个时间点检测到蛋白数量性状位点。对于这3种，我们通过与来自一般人群的1142名个体的对照队列比较，评估了其疾病特异性。一个蛋白数量性状位点在所有条件下均显著，并在患者和对照中表现出相似效应大小：SNP rs6686750影响IL6R。另外两个蛋白数量性状位点具有疾病甚至条件特异性：SNP rs8124182影响MMP9，仅在STEMI患者中发现；SNP rs10422256影响LDLR，仅在STEMI患者24小时时发现。这些结果表明，在研究STEMI与分子表型之间的关系时，考虑遗传学的重要性。
讨论
在此，我们提供了STEMI患者与对照者之间单细胞免疫反应的无偏、纵向概述。我们观察到经典单核细胞、CD4T细胞和NKdim细胞在STEMI后的重要作用，无论是在细胞类型组成还是基因表达变化方面。在循环中，我们观察到单核细胞比例增加和NK细胞比例减少，分别在STEMI后24小时达到峰值或谷值。这些变化与既往STEMI和心绞痛研究一致。此外，既往研究揭示了STEMI后单核细胞组成的双相变化；在早期缺血期（STEMI后3天），经典单核细胞达到峰值，而后期（STEMI后5天），非经典单核细胞达到峰值。循环中的这些变化与心脏中的特定变化同时发生，提示初始募集经典单核细胞以清除坏死心肌组织，随后非经典单核细胞结束炎症反应并促进组织修复。总之，观察到的变化不仅仅是STEMI的后果，还可能对其有所贡献。因此，研究STEMI期间循环免疫细胞和血液蛋白水平的变化可能为新的治疗策略提供线索。
我们的研究表明，在评估STEMI的分子后果时，考虑遗传变异和疾病阶段的重要性，因为几种血浆蛋白受到这两个参数的综合影响。对于所有已识别的蛋白数量性状位点，A等位基因是冠心病相关的风险等位基因，表明较低的血浆IL-6R水平以及较高的MMP9和LDLR水平增加冠心病风险。这与既往全表型组关联研究一致，显示这些蛋白数量性状位点的风险等位基因与较低IL6和IL6R血浆水平及较高LDL胆固醇水平相关。
我们观察到rs8124182对MMP9的疾病特异性蛋白数量性状位点，与先前描述的全血MMP9 eQTL一致。我们假设这种疾病特异性是由于该SNP直接影响磷脂转移蛋白（PLTP）基因表达，从而调节MMP9水平。来自Pltp/ApoE双敲除小鼠的证据支持这一点，显示降低的MMP9蛋白水平可通过PLTP过表达逆转。值得注意的是，这种PLTP对MMP9蛋白水平的影响仅在ApoE敲除诱导的动脉粥样硬化条件下观察到，这解释了为何MMP9蛋白数量性状位点仅在STEMI患者中明显，而在对照中不明显。
我们观察到LDLR的疾病状态和疾病阶段特异性蛋白数量性状位点。通常，膜结合的LDLR主要存在于肝脏，促进LDL从循环中摄取。当ADAM17将LDLR从膜上脱落进入循环时，预计膜结合LDLR的可用性降低，导致LDL摄取减少。ADAM17的活性受炎症刺激，这可能解释了为何这种可溶性LDLR的蛋白数量性状位点仅在STEMI后的急性炎症阶段出现。
最后，我们的分析为IL-6信号通路提供了新见解，该通路目前是多种临床试验药物的靶点。IL-6信号可通过三种模式激活，每种都有其自身后果：经典信号传导（抗炎）、反式信号传导（促炎）和反式呈递（Th17细胞促进）。通过细胞间通讯分析，我们发现STEMI后经典和反式呈递通路的差异激活。而我们的蛋白数量性状位点分析表明，反式信号传导受到SNP rs6689206的影响，该SNP在STEMI患者和对照者中均调节可溶性IL6R水平。总之，这表明经典和反示递信号传导可能是合适的靶点（如抗IL-6或抗IL-6R），而携带SNP rs6689206 GG基因型的患者可能从靶向反式信号传导通路的治疗（如可溶性gp130）中获益。
遗憾的是，当聚焦于每个分子层面如何可能促成或导致生化测量心梗面积时，除了血浆NT-proBNP水平外，未发现这种关联——NT-proBNP是已知的心力衰竭标志物。这种关联的缺失可能源于单独评估每个分子参数，或未在模型中考虑所有潜在相关的临床和供体变量。而一个考虑所有这些参数的模型需要更大的样本量。我们预计未来通过统一处理的（疾病）人群单细胞数据集的荟萃分析，如单细胞eQTLGen联盟的努力，将使其成为可能。
总之，本研究强调了以细胞类型特异性分辨率研究STEMI的重要性，同时需考虑遗传变异、疾病状态和疾病阶段。我们预计这种整合方法将有助于更好地理解STEMI的分子过程，并对开发未来有效且副作用更少的疗法至关重要。
文章信息
补充材料
补充方法
图S1–S6
表S1–S11
参考文献
致谢
图片来自 Servier Medical Art，作者感谢其提供免费在线图片。
脚注
非标准缩写和首字母缩略词
CK-MB：肌酸激酶心肌带
DE：表达差异
e/pQTL：表达/蛋白数量性状位点
LDLR：低密度脂蛋白受体
MMP9：基质金属蛋白酶-9
NT-proBNP：N末端B型利钠肽原
PBMC：外周血单个核细胞
PCSK9：前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型
scRNA-seq：单细胞RNA测序
SNP：单核苷酸多态性
STEMI：ST段抬高型心肌梗死
【全文结束】