摘要
背景 本研究旨在调查同质健康老年人群中早期的免疫学和分子变化，首先通过筛查将他们分为有或无亚临床颈动脉斑块的组别。随后评估了免疫学和分子特征、血管健康参数以及生活方式因素，并进行综合生物信息学分析以确定预测亚临床动脉粥样硬化的生物标志物。
方法 本研究在79名健康参与者中进行（男性：n = 50；年龄 = 63.6 ± 3.7岁；体重指数 = 24.9 ± 3.1 kg/m²；均值 ± 标准差）。参与者根据颈动脉超声检查结果按亚临床动脉粥样硬化斑块（SAP）状态进行分类。随后使用T细胞表型分析、血清蛋白特征和基因表达分析、血管评估、身体活动和能力分析以及食物摄入分析进行综合分析。
结果 CD4⁺初始T细胞百分比是与斑块组呈最强负相关的变量。在前10个变量中，CD4−CD8−淋巴细胞也与SAP呈负相关。相反，CD8+中央记忆T细胞与SAP呈正相关。LaminB1、肿瘤蛋白53、收缩压、中心收缩压、血管年龄、骨桥蛋白和CD4⁺中央记忆T细胞也与SAP呈正相关。
结论 尽管参与者的老年人群相对同质且心肺功能良好，但我们已将各种细胞和分子特征与SAP的存在相关联。已知的免疫衰老标志物显示出与SAP的显著关联。这些结果强调了免疫生物标志物在检测亚临床动脉粥样硬化中的相关性。
试验注册 不适用。
引言
血管老化是心血管疾病（CVD）发展的重要风险因素。随着动脉随年龄发生结构和功能变化，发生内皮功能障碍和动脉粥样硬化的风险增加。动脉粥样硬化的早期阶段通常因缺乏临床相关症状而未被发现。然而，在此无症状阶段可能已经存在亚临床器官损伤。了解亚临床动脉粥样硬化发展中的这些早期变化对于改善早期检测和设计更便捷的诊断工具至关重要。通过使用血管超声，可以识别心血管疾病风险增加的患者；然而，在症状出现之前通常不会进行此项检查。因此，仍需研究其他评估亚临床动脉粥样硬化存在的生物标志物。这将有助于早期识别受影响者并启动预防措施。正是在这一点上，基于生活方式的建议可以保护那些仍然基本健康且未受疾病进一步困扰的人群。
动脉粥样硬化的发展以局部和全身性炎症过程为标志，即使在早期阶段也是如此。早期免疫过程可以增进对预防措施的了解。同时，免疫标志物可作为亚临床动脉粥样硬化进展的早期指标。实验研究已阐明参与炎症的分子和细胞通路，这些通路有助于动脉粥样硬化的发展。细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18和TNF-α代表炎症信使，可影响动脉生物学，创造有利于动脉血栓事件的全身环境。炎症本身可以驱动动脉增生，并在缺乏传统风险因素的情况下调控斑块生物学的某些方面。T细胞在亚临床动脉粥样硬化基础的慢性炎症过程中起着关键作用，使其成为疾病进展的关键介质。它们的特定亚群提供了对驱动早期动脉粥样硬化变化的适应性免疫反应的精确见解。促炎性CD4+ T细胞亚型在这一过程中起着至关重要的作用。特别是，具有效应记忆功能的细胞似乎直接参与动脉粥样硬化斑块的形成，因为它们与富含胆固醇的脂蛋白抗原相关。除了分化CD4+ T细胞的促动脉粥样硬化特性外，CD8+细胞也在动脉粥样硬化过程中被证实有作用。几种血清蛋白（如生长分化因子15（GDF-15）或骨桥蛋白（OPN））在动脉粥样硬化形成中的作用正在被广泛讨论。
迄今为止，尚无研究彻底调查健康老年人中与亚临床动脉粥样硬化相关的早期分子和免疫学变化，这凸显了研究中的一个空白。因此，本研究旨在探索同质健康老年人群中这些早期分子，特别是免疫学变化，以确定可能与亚临床动脉粥样硬化发展相关的生物标志物。为此，参与者接受了初始颈动脉超声筛查，这使他们能够被分为两组：有亚临床动脉粥样硬化斑块（SAP）和无斑块。随后，我们分析了基于血液的免疫学标志物以及血管健康和生活方式因素的评估。来自这些不同生物领域的数据通过综合生物信息学方法进行整合，以识别预测亚临床动脉粥样硬化的关键生物标志物，最终有助于改善早期检测和预防策略。
方法
研究设计与参与者
本研究设计为横断面病例对照研究。总共79名参与者（男性：n = 50，女性：n = 29；年龄：63.6 ± 3.7；BMI：24.9 ± 3.1 kg/m²）作为吉森免疫衰老研究的一部分被纳入。所有参与者均健康，无任何急慢性疾病，包括感染、损伤，且不服用任何药物。有关队列的详细描述和完整的纳入排除标准，请参见Böttrich等人。人体测量、免疫学评估和心肺功能测试在吉森尤斯图斯-李比希大学运动生理学和运动治疗系进行。血管筛查在位于吉森的吉森和马尔堡大学医院进行。根据颈动脉内膜的超声检查，参与者被分为两组：有和无亚临床动脉粥样硬化斑块（SAP）。研究的方法学工作流程如图1所示。按组分类的人体测量数据和关键临床参数概述见表1。吉森尤斯图斯-李比希大学医学伦理委员会批准了本研究（AZ 100/20）。所有实验程序均按照赫尔辛基宣言进行，所有参与者在入组前均提供书面知情同意。临床试验编号：不适用。
基线特征
在08:00至10:00之间从每位参与者收集静脉空腹血液样本以进行进一步分析。这些样本用于获得标准实验室参数、分离外周血单核细胞（PBMCs）以及收集血清进行蛋白特征分析。使用SYNLAB医疗护理中心（德国巴特瑙海姆）的标准临床实验室方法测定血清中的空腹葡萄糖和胰岛素浓度，以及总胆固醇、LDL、高密度脂蛋白（HDL）、甘油三酯和皮质醇水平。使用BIACORPUS RX 4004 M和BodyComposition – Professional Version: 9.0.20413软件（MEDI CAL HealthCare GmbH）通过生物电阻抗分析（BIA）评估体脂百分比（%）和内脏脂肪组织（VAT%）。为评估肺功能，使用Vitalograph® alpha Model 6000（Vitalograph GmbH，德国）测量以下参数：用力肺活量（FVC）、一秒用力呼气量（FEV1）和FEV1:FVC比值。所有测量均按照美国胸科学会/欧洲呼吸学会的指南进行。
颈动脉超声、外周和中心血压及脉搏压力波形的无创评估
颈动脉超声使用配备3-12兆赫兹（MHz）频率线性换能器的飞利浦cx50设备（飞利浦，荷兰埃因霍温）进行。颈动脉从锁骨下动脉出口开始至内、外颈动脉分叉处进行双侧横截面B模式检查。目的是确定是否存在亚临床动脉粥样硬化斑块（SAP）。获取了左右颈总动脉的多幅图像。使用半自动边缘检测软件测量位于颈动脉分叉1-1.5厘米处的颈总动脉远壁的内膜-中膜厚度（IMT）。检测框分析10毫米长度，并放置在位于颈动脉球1-1.5厘米处的颈总动脉段远壁上。确定内膜-中膜边缘，并计算舒张末期的IMT，以毫米表示。斑块定义为IMT ≥ 1.5 mm。每侧分析三个帧，由单盲读取器离线进行，记录每位患者所有六个IMT测量值的平均值并用于分析。为通过示波法获取脉搏压力波形，我们使用了非侵入性vascassist2®设备（isymed GmbH，巴特巴赫，德国）。获取的脉搏压力波形随后使用经过验证的动脉树电子模型分析血管功能参数。计算了诸如肱动脉和桡动脉收缩压（SBP）和舒张压（DBP）、中心收缩压和舒张压（cSBP/cDBP）、主动脉脉搏波速度（PWV）、增强指数（Aix）、心率75 bpm时的增强指数（Aix@75）、阻力指数（R）、总血管阻力和射血持续时间等参数。中心血压使用基于外周动脉波形的经过验证的转换函数确定，而Aix@75的计算依赖于脉搏波形分析。
外周血单核细胞的分离
为分离外周血单核细胞（PBMCs），新鲜外周血用PBS（磷酸盐缓冲盐水）1:1稀释，并使用SepMate 50 mL管上的EasySept进行分层。在1200×g下离心10分钟后，小心倒掉上层。然后洗涤分离的细胞并在300×g下离心8分钟。随后，通过将PBMCs重悬于称为Bambanker®的冷冻培养基中进行冷冻。冷冻细胞储存在−80 °C以供未来分析。
通过流式细胞术进行T细胞表型分析
PBMCs解冻、洗涤并在预热RPMI/5% AB血清中静置2小时。根据使用的不同面板，将细胞数量分成两个样本。对于Panel 1（IL17-Panel），静置时间后用PMA（50 ng ml−1）/Ionomycin（1 µg ml−1）再刺激14小时，并在两小时后添加brefeldin A（5 µg ml−1）。Panel 2（Immuneaging-panel）的染色直接在静置时间后进行。对于IL-17面板：Zombie NIR可固定活力试剂盒（活/死标记物）、CD4（APC）、CD8（BV510）、CD161（BV421）、TCRVα7.2（PerCP）均来自Biolegend，TCRγδ（PE/Cy7 BD）。对于免疫衰老面板：Zombie NIR可固定活力试剂盒、CD4（AF700）、CD8（BV510）、CD27（PE）、CD28（BV421）、CCR7（PE/Cy7）、CD45RA（PerCP）、CD95（FITC）、PD1（APC），均来自Biolegend。根据IL17-Panel进行细胞内细胞因子染色，细胞用2%甲醛固定后，用IL-17（PE）、IL-2（PETxRed）、IFN-γ、CD4（APC）、CD8（BV510）染色。使用FACS Aria III和Diva软件分析样本。在Il17面板中，对门控CD4+和CD8+ T细胞以及Vα7.2+CD161+和T细胞受体（TCR）γδ+细胞分析IL-17。对于免疫衰老面板，在确定活细胞（Zombie NIR可固定活力试剂盒）后，对CD4+和CD8+ T细胞进行门控，使用CCR7-CD45RA分析初始T细胞（CD45RA+CCR7+）、效应记忆（EM）T细胞（CD45RA−CCR7−）、中央记忆（CM）T细胞（CD45RA−CCR7+）和重新表达CD45RA的效应记忆细胞（TEMRA）（CD45RA+CCR7−）的丰度。干细胞记忆（SCM）T细胞使用CD27−CD95−CD28+进行门控。
血清蛋白特征和巨细胞病毒（CMV）血清状态
血清储存在−80 °C直至分析。使用人磁性Luminex检测（Bio-Techne，英国阿宾顿）和Magpix Luminex仪器（Luminex Corp，美国奥斯汀）按照制造商说明确定蛋白质。总共确定了38种不同炎症或动脉粥样硬化形成的蛋白质以进行蛋白特征分析。完整蛋白质列表及其检测范围见补充材料表S1。使用半定量夹心酶联免疫吸附试验（ELISA-Viditest anti-CMV IgG，VIDIA，捷克共和国）检测血清抗CMV免疫球蛋白G（IgG）抗体。程序遵循制造商说明。使用ELISA读数器SPECTROstar ® Nano（BMG Labtech，德国）测量终点光密度。
RNA提取和qPCR分析
使用TRIzol试剂（Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄）按照制造商方案从分离的PBMC提取总RNA。随后，使用配备NanoQuant板的Infinite 200 M微孔板读数器（均来自Tecan，德国美因茨）分析总RNA的数量（RNA浓度）和质量（A260/A280比值）。cDNA的合成如前所述。使用Rotor-Gene Q系统（Qiagen，德国希尔登）和基因特异性引物对（Eurofins MWG Operon，德国埃伯斯贝格）进行qPCR分析，如最近所述。引物的特性见补充材料表S2。qPCR数据使用Vandesompele等人2002年测试的几种潜在参考基因中三个最稳定的（CANX、MDH1、SDHA）进行归一化。
CRF、肌肉力量、身体活动和营养摄入的测量
心肺运动测试使用自行车测力计（Excalibur Sport®, Lode）进行，涉及两个斜坡协议。首先进行3分钟无阻力热身。根据每位参与者的训练或健身水平选择特定的斜坡协议，目标是在15分钟内达到最大负荷。详细的运动方案在Böttrich等人中有描述。使用手握测力计（Baseline® Hydraulic Hand Dynamometer LiTE®, Fabrication Enterprises Inc., 美国）测量优势手的最大自主握力。指示参与者在评估期间将手臂放在身体两侧。提供口头鼓励以激励参与者尽最大努力。执行四次最大收缩，使用记录的最高握力值进行后续分析。为测量每日步数，参与者在右腕佩戴Fitbit charge 2（FC2）7天。FC2测量步数、楼层、距离、活动分钟数和睡眠。FC2通过身体运动使用微电子三轴加速度计记录身体活动。所有FC2设备均使用Fitbit在线用户界面初始化，设备数据使用Fitbase软件提取。在睡眠、洗澡/淋浴或游泳时不佩戴。指示参与者在佩戴FC2的7天内保持日常例行活动。7天结束时，将每日步数求和，然后除以天数以计算平均每日步数。此外，以相同方式测量楼层计数和距离。营养行为通过食物频率问卷（FFQ）测量。FFQ包括关于过去四周消费的53种食物项目的频率和数量的问题。问卷通过邮件发送给参与者，要求他们在家中完成并返回。食物项目的消费频率根据指定类别询问。
数据分析
首先评估数据集是否存在缺失数据模式和线性偏差。在假设随机缺失（MAR）的情况下进行缺失数据插补。应用单变量和多变量插补技术有效处理缺失数据。对于每种插补方法，使用Scikit-Learn的Logistic Regression()分类器进行逻辑回归。特定列的插补版本被视为预测变量，而代表目标变量"SAP"的列用于分类。通过比较每种方法获得的AUC（曲线下面积）值确定每列的最佳插补方法。产生最高AUC的方法被选为插补该特定列的最合适方法。具体而言，使用Scikit-Learn的SimpleImputer（版本1.3.0）进行单变量方法的均值和中值插补。多变量方法包括使用Scikit-Learn的KNeighborsRegressor()进行k-NN插补、Python中的多元回归插补、SPSS中的随机回归以及Python中的miceforest包，该包实现了使用LightGBM的链式方程多重插补（MICE）。miceforest插补涉及10次迭代，产生10个数据集，从中提取第一个用于分析。补充的MICE算法导出的插补方法使用IterativeImputer和两种不同的估计器：一种使用RandomForest估计器，另一种使用BayesianRidge估计器，均从Scikit-Learn实现。
数据检查后，在数据集中发现了显著的异常值，有些是在插补后出现的。因此，实施了异常值处理策略。这包括从均匀分布中在指定的上下限内生成随机值，并用这些随机生成的值替换检测到的异常值。执行统计测试以评估数据分布并确定变量与SAP形成之间的显著关联。对于非正态分布变量，使用Kruskal-Wallis检验，而对于正态分布变量，使用ANOVA。在相关情况下应用了事后检验，如Dunn检验和Tukey检验，以识别统计学上显著的差异。此外，使用单变量逻辑回归模型评估了这些变量与SAP发展的相关性。鉴于大多数变量不符合正态分布，进行了两种类型的对数转换：log(x + 0.00001)和log(aX + c)，其中'c'表示数据集中最小的正值，'a'确定为'c'的倒数（a = 1/C）。这需要先对数据集中存在的负值进行基于偏移的转换。数据预处理后，进行了多变量分析以识别潜在生物标志物并有效分类数据集。鉴于二元响应变量和高变量相关性，使用R包mixOmics采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。为优化模型，使用不同组件的稀疏PLS-DA（sPLS-DA），并通过100次重复的10折交叉验证方法评估其性能，使用BER和AUC作为性能指标。sPLS-DA是一种通过降低数据维度和选择最相关特征同时保持可解释性来识别区分预定义组的关键变量的方法。通过评估三种不同的距离度量（最大距离、马氏距离和质心距离）确定最佳组件数量。样本投影到由组件1和2定义的低维空间，以区分与SAP形成正负相关的变量，并通过变量加载图识别重要特征。第一组件中的负加载表明对"无SAP"类贡献更高，而正加载表明对"SAP"类贡献更强。最佳和最终模型，以最低BER和log(aX + c)转换为特征，保留了147个预测变量。此选择过程导致仅包含八个特定于食物/营养的参数。随后，我们构建了相关性网络（sPLS-DA相关性网络分析）以可视化和解释10个最重要选定变量之间的相关性和相互作用，帮助揭示关键相互作用和潜在生物学机制。
结果
研究队列由79名参与者组成，198个预测变量中有148个包含在分析中，代表方法中描述的所有测量参数，以及一个二元响应变量（亚临床动脉粥样硬化斑块"是"或"否"）。在79名参与者中，29名根据颈动脉超声被确定为有亚临床动脉粥样硬化斑块（SAP）。在28例中，斑块存在于单个颈动脉段，而一名参与者在两个段中显示斑块。大多数斑块位于颈动脉球或近端颈内动脉。总数据集约3.8%由缺失数据组成。监督偏最小二乘判别分析（PLS-DA）表明，当使用两个组件时，错误率达到最小，这是由最大距离法确定的（图2a）。通过将主成分（PC）−2与PC-1作图，观察到有和无SAP参与者之间的显著分离，两类之间重叠最小（图2b）。为组件1和2选择的变量最佳数量为140，最低平衡错误率为35%（图2c）。应用稀疏PLS-DA（sPLS-DA），并根据其区分能力对变量进行排名，如组件1（图3a）和组件2（补充材料图S2a和b）所示。sPLS-DA用于识别对区分有和无SAP组贡献最大的变量。此方法通过突出仅最相关的生物标志物来减少数据集。由于数据量大，仅展示sPLS-DA对各变量类别的最重要结果。相关性网络分析伴随sPLS-DA，突出10个最重要参数并说明复杂数据集内的生物关系。
细胞特征
sPLS-DA确定CD4+初始T细胞为在整个模型中组件1上关联最强的变量。CD4+初始T细胞与SAP呈负相关（加载权重：−0.220）。排名第五，CD8+ CM T细胞与SAP呈正相关（0.174）。在前10个变量中，CD4−CD8−双阴性（DN）淋巴细胞也与SAP呈负相关（−0.161）（图3b）。此外，在前30个中，CD4+CM（0.121）和CD8初始（−0.117）被观察到，而在前50个中，CD8+ EM（0.083）值得注意。
血清蛋白特征
在组件1上前20个中发现了几种蛋白特征（图3b）。关联最强的蛋白特征是OPN（0.163）和IL-18（0.163），两者均在前10个变量中。两者均与SAP呈正相关。此外，在前20个中包括MMP-12（−0.152）、OPG/TRAIL比值（−0.145）、Tenascin C（−0.133）、Trail（0.127）以及在γδ+细胞刺激后检测到的IFN-γ（0.129）。在前50个中，包括细胞因子如IL1RA（−0.082）、IL-6（−0.093）和IL-15（−0.094），以及其他蛋白质如半乳糖凝集素（−0.102）或FGF23（−0.098）。
基因表达特征
在组件1上前10个变量中，两个基因特征与SAP呈负相关。这些是Lamin B1（LMBN1）（−0.171）和PRKAA1（−0.163）。SERPIN1（−0.149）在前20个中（图3b），而在前30个中包括FOXO3（−0.113）、肿瘤蛋白53（TP53）（−0.110）和TNFSF10（−0.105），均与SAP呈负相关。
血管评估
sPLS-DA特别突出了三个与SAP强相关的预测因子，位于前5个变量中。这些包括SBP（0.207）、血管年龄（0.189）和cSBP（0.178），均与SAP呈正相关（图3b）。在前40个中，包括舒张压DBP（0.096）和cDBP（0.092）的参数，也与SAP呈正相关。
人体测量、身体能力、活动和营养摄入
年龄（0.158）在前20个中被确定为SAP的正向预测因子，而内脏腹部脂肪%（−0.122）是SAP的负向预测因子。在饮食变量中，煮熟的水果（0.160）被确定为SAP的正向预测因子，位于前20个中。在身体能力的前20个变量中，观察到肺功能参数FEV1/FCV（−0.148）（图2b）。VO2peak排名135，值为0.007。在前50个中包括FB2距离（−0.095）和FB2楼层（−0.084）。
网络分析确定最重要的预测变量
虽然sPLS-DA有助于识别区分组的关键预测因子，但相关性网络分析提供了这些预测因子之间相互作用的视觉和直观表示。sPLS-DA相关性网络分析显示，10个最重要的预测变量如图4所示。这些是与其他变量和SAP相关性最高的10个预测变量，因此应突出临床相关性。该网络中强相关性的存在表明每个特征与一个类别呈正相关，与另一个类别呈负相关。具体而言，变量CD4初始T细胞（r: −0.36）、LMBN1（r: −0.28）、TP53（r: −0.27）和CD4⁻CD8⁻ DN淋巴细胞（−0.26）与"SAP"类呈负相关，表明随着其值增加，SAP发生可能性降低。相反，SBP（r: 0.38）、cSBP（r: 0.31）、血管年龄（r: 0.35）、OPN（r: 0.26）、CD8⁺（r: 0.29）和CD4⁺ CM（r: 0.26）T细胞与"SAP"类呈正相关。
讨论
综合生物信息学分析的最终模型显示，与免疫衰老和全身炎症迹象强烈相关的分子特征与SAP的存在相关。这适用于T细胞亚群、各种细胞因子的数量以及PBMC的基因表达谱。此外，血管功能参数与SAP之间存在强相关性。生活方式因素，如身体活动的测量，在此参与者队列中预测SAP存在的排名较低，表明其间接影响。
结果表明，CD4+初始T细胞在统计模型中与早期SAP呈最强负相关。这一发现与先前研究一致。Gaddis等人表明，与高CVD风险个体相比，低CVD风险个体的CD4+初始T细胞升高。Olson等人同样发现循环CD4+初始T细胞与亚临床动脉粥样硬化呈负相关。然而，在大多数将初始T细胞与动脉粥样硬化斑块相关联的研究队列中，研究人群不如我们的同质。扩大的初始T细胞池可能表示增加的抗炎能力，因为初始CD4+ T细胞有潜力分化为其他亚型，如先前研究中证明的免疫调节Tregs。与此一致，CD4+ CM T细胞被发现与SAP呈正相关。与我们的研究相反，Ammirati等人观察到，在自由生活人群中，与CD4+初始或CM T细胞相比，CD4+ EM T细胞与主动脉内膜中膜厚度存在强相关性，这些患者被诊断为慢性稳定型心绞痛或急性心肌梗死。使用人类颈动脉斑块和PBMC的单细胞T细胞受体测序，他们在效应CD4+ T细胞群体中发现了最强的克隆扩增。当前研究表明，与CD4+ CM T细胞相比，CD4+ EM与动脉粥样硬化斑块相关联。然而，重要的是要注意，这些研究中检查的参与者主要患有临床相关的动脉粥样硬化。考虑到CD4+ EM T细胞在包括斑块在内的外周组织中逐渐被检测到，它们在斑块中诱导强烈的促炎反应，这一观察可能表明在疾病晚期血液中存在增加。我们研究中CD4+ CM T细胞与SAP组的正相关可能表明与早期动脉粥样硬化背景下炎症环境或抗原暴露相关的潜在慢性免疫激活。然而，必须强调的是，我们研究中CD4+ CM T细胞的抗原特异性仍未知。关于CD8+CM T细胞的作用知之甚少。现有数据表明CD8+ T细胞在动脉粥样硬化中表现出双重作用，执行动脉粥样硬化保护和促动脉粥样硬化功能。动物研究数据显示，CD8+ EM和CD8+ CM细胞群体在动脉粥样硬化斑块中起促动脉粥样硬化作用，特别是在老年小鼠中，突显了其作为潜在标志物的作用。然而，关于它们在亚临床动脉粥样硬化中的作用知之甚少。因此，CD4+初始T细胞、CD4+和CD8+ CM T细胞在亚临床动脉粥样硬化中的作用应在未来研究中进一步探索。本分析中确定的另一T细胞群体是CD4−CD8− DN淋巴细胞，这是一个缺乏CD4和CD8共受体的异质群体。本研究中未进一步表征其精确组成，其在心血管疾病中的作用仍知之甚少。本研究数据表明其具有保护功能，因为该细胞群体的频率与SAP呈负相关。因此，该细胞群体可能在识别亚临床动脉粥样硬化中发挥作用，并应在未来研究中进一步调查。
除了T细胞外，还发现其他分子标志物与SAP在早期阶段的发生相关。OPN通过促进免疫细胞粘附到内皮壁、血管炎症老化和促进斑块形成在动脉粥样硬化中起重要作用，从而加剧动脉粥样硬化。它的存在是诊断钙化性主动脉瓣疾病和缺血性血管疾病（如中风、心肌梗死和外周动脉疾病）患者结果的强有力预测因子。虽然OPN已被广泛研究，但亚临床动脉粥样硬化中的结果不一致。与我们的结果一致，OPN可作为早期动脉粥样硬化发展的生物标志物。
血管壁中的衰老免疫细胞，以及促炎介质分泌增加，可能加剧动脉粥样硬化斑块的形成。LMBN1是核结构的组成部分，维持细胞完整性和基因组稳定性。该标志物与SAP呈负相关，表明无SAP组中免疫衰老减少。TP53是一种肿瘤抑制基因，调节细胞衰老，其在动脉粥样硬化中的激活增加了斑块中的细胞衰老，影响疾病进展。然而，与假设相反，本研究发现TP53表达与SAP呈负相关。值得注意的是，基因表达并不直接表示蛋白质存在，受包括转录、翻译、转录后修饰或选择性剪接在内的各种机制调控。
血管评估的结果已在Größer等人的出版物中讨论过。在此当前的生物信息网络分析中，结果表明与收缩压和血管年龄相关的参数，结合分子特征，与SAP相关，因此似乎是合适的预测因子。值得注意的是，有SAP参与者的收缩压平均而言不被归类为高血压。这再次有力地表明，即使在仍被归类为高度正常的血压状态下，也可能有利于SAP发展。我们队列中斑块的节段分布与公认的血流动力学原理一致。病变主要位于颈动脉球和近端颈内动脉（低剪切应力和紊乱流区域），支持局部机械因素在早期斑块形成中起重要作用的观点，即使在没有明显高血压的情况下也是如此。这些发现突显了血管流动动力学在亚临床动脉粥样硬化发病机制中的重要性。
年龄被认为是动脉粥样硬化发展的最强风险因素。我们在研究队列中观察到显著相关性。然而，年龄在生物信息网络分析中未进入前10个变量，表明其他分子特征的重要性。此外，我们的研究参与者表现出高于平均水平的身体活动和CRF。与最大氧消耗的年龄调整参考值相比，我们的参与者在个人VO2峰值方面排名前20%。然而，未观察到两组之间最大VO2peak的显著差异，这可能是由于CRF方面高度同质的研究人群。我们的初步工作表明，血管健康参数与此队列中较高的CRF值相关。在此背景下，内脏腹部脂肪与亚临床动脉粥样硬化之间的负相关是意外的，需要谨慎解释。一种可能的解释是，此相对健康队列中整体高水平的心肺功能可能调节脂肪分布与血管健康之间的关系。或者，该发现可能反映残余混杂，或此人群中特定的行为或代谢特征。此外，进一步研究表明身体能力对衰老免疫系统参数的积极影响。因此，我们研究中确定的动脉粥样硬化预测变量与身体活动等生活方式因素之间的复杂关系应成为未来研究的重点。从我们记录的众多饮食习惯中，只有有限数量的FFQ项目被确定为最终统计模型的相关项。因此，无法做出明确推论，表明未来研究应关注这些项目。因此，煮熟水果摄入量与SAP之间的正相关可能反映与制备方法（如添加糖）或饮食模式相关的残余混杂，而非水果消费的直接影响。由于FFQ类别"煮熟水果"包括营养概况不同的多种食物，需谨慎解释。
然而，必须考虑某些优势和局限性。研究的主要优势是同质研究队列，所有人均被临床归类为健康老人，无预先存在的疾病和用药。然而，我们承认这种同质性可能限制结果对更广泛人群的普遍性。我们研究的一个关键局限性是，作为横断面研究，它不允许对动脉粥样硬化的预测因子得出明确结论。需要纵向研究来验证这些发现。此外，包含140个预测因子相对较高。因此，我们重点详细讨论了相关性网络分析中前10个最重要的预测因子。未来研究应旨在适应指标数量，以确保在临床应用中的可行性。另一个局限性是队列的狭窄年龄范围，阻止了与动脉粥样硬化存在相关的年龄相关过程的识别。应考虑选择偏倚等局限性，特别是鉴于我们关注55岁及以上的目标人群，包括50名男性和29名女性。样本中的性别不平衡可能影响结果。如果未测量与暴露和结果都相关的某些混杂变量，分析也可能容易受到混杂偏倚的影响。这些混杂因素可能通过潜在地逆转或减少主要预测因子的效果来影响结果。这可能给分析引入偏倚，影响最终模型的错误率。此外，SAP的诊断以及因此分为两组仅基于颈动脉超声的结果。未进行其他筛查方法，如冠状动脉钙化筛查。
结论
在我们的心肺功能同质高水平、无先前诊断疾病和无用药的老年人群队列中，我们能够将来自广泛数据网络的几种细胞和分子特征与SAP联系起来。发现有SAP的个体具有增加的免疫衰老迹象，如低比例的CD4+初始T细胞、高比例的分化T细胞、增加的炎症血清标志物和细胞衰老标志物。我们的数据强调了免疫标志物在检测仍临床无症状个体中SAP的重要性，突显了免疫过程在动脉粥样硬化发展早期阶段的关键作用。未来研究应验证这些生物标志物的预测潜力，这些生物标志物可能作为预防性和免疫调节生活方式干预（如身体活动）的目标，以打断动脉粥样硬化进展的病理级联。
【全文结束】
