摘要
人类肠道微生物组影响治疗结果，但药物反应的微生物组特征是否在不同队列间具有普遍性仍不清楚。本研究对3个队列（共100名患者）进行多队列分析，以确定跨队列的微生物特征是否与新发类风湿关节炎(RA)患者的甲氨蝶呤(MTX)反应相关。治疗前的肠道微生物组群落结构和功能因未来的MTX反应状态而异，MTX无应答者(MTX-NR)表现出粪拟杆菌(Bacteroides caccae)减少和糟渣瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)富集。MTX-NR中多种微生物功能减少，包括核苷酸代谢、叶酸介导的一碳池和组氨酸代谢。值得注意的是，候选MTX降解基因在MTX-NR中富集。微生物组功能谱在预测未来MTX反应方面优于临床指标。这些结果表明，一致的微生物组特征与不同RA队列中的MTX反应相关，为新诊断RA患者的微生物组导向精准医学铺平了道路。
引言
我们的胃肠道栖息着多样化的微生物群落，统称为人类肠道微生物组，它在调控个体对饮食、药物和疾病易感性的反应中发挥关键作用。肠道微生物代谢药物，影响其药代动力学；反之，许多药物会改变微生物组组成，从而塑造宿主免疫力。因此，治疗前微生物组可能有助于预测药物反应，从而加速疾病治疗，特别是在免疫介导的治疗中。因此，研究人员正努力将这些见解整合到精准医学中。
然而，临床转化的一个障碍是确定微生物组-药物反应关联是否能在多个队列中预测。虽然几项研究已确定了预测药物反应的微生物分类群和功能，但尚不清楚药物反应的微生物生物标志物是特定于某一研究人群还是能在不同队列间普遍适用。关于黑色素瘤中检查点抑制剂治疗的研究结果不一，有些研究报告了队列间一致的关联，而其他研究则报告了队列特异性关联。本研究旨在确定类风湿关节炎(RA)患者肠道微生物组中是否含有可预测甲氨蝶呤(MTX)反应的跨队列微生物组特征，甲氨蝶呤是一种与微生物组以多种方式相互作用的抗代谢和免疫调节药物。识别跨队列的关联将有助于开发可推广的基于微生物组的预测工具，从而为RA精准治疗提供具有临床可行性的见解。
RA是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是关节持续发炎，导致疼痛、肿胀和进行性关节损伤。MTX作为一线疾病修饰抗风湿药物(DMARD)被广泛使用，因其疗效、成本效益和全球可用性而受到认可。然而，在12周治疗期后，仅约50%的患者对MTX单药治疗表现出足够的临床反应。鉴于启动有效治疗和预防不可逆损伤的关键"治疗窗口"，需要预测治疗反应的生物标志物。基线临床参数、药理基因组变异和循环代谢标志物（包括血清脂质组谱）已与治疗结果相关联。然而，大多数提出的预测因子在独立队列中的重现性有限。这些限制凸显了对可推广的预测生物标志物和改进MTX反应机制见解的需求。
MTX反应的差异可能源于肠道微生物组谱的个体间差异。我们和其他人已表明，根据未来对MTX的反应，治疗前肠道微生物组的群落结构和功能在患者中存在差异。此外，我们已证明肠道微生物组影响MTX的生物利用度，并且微生物MTX代谢与患者中不同的药物反应相关。值得注意的是，分类和功能微生物组特征均与治疗结果相关联，并已探索和验证了基于治疗前微生物组谱的预测模型。
然而，这些研究是队列特定的，微生物特征是否与MTX反应相关并在多个队列间普遍适用尚不清楚。本研究通过对三个独立队列的新发RA患者肠道微生物组进行综合分析，以：(i)识别与MTX-NR持续相关的微生物特征，(ii)深入了解MTX反应的机制，以及(iii)开发一种可推广到人群的预测模型，用于早期识别MTX-NR。在合并队列中，治疗前微生物组与MTX反应相关，分类和功能谱显示与未来反应具有生物学意义的关联。与MTX生物学相关的通路，包括核苷酸和氨基酸代谢，在MTX-NR中减少；相反，候选MTX代谢基因富集。基于跨队列功能谱训练的微生物组机器学习模型在验证队列中准确预测了未来的MTX-NR。这是首次对新发RA患者肠道微生物组进行的多队列分析，以识别与药物反应相关的持续微生物特征。本研究为全球微生物组指导治疗优化的未来努力提供了宝贵见解。
结果
研究人群
为识别与新发类风湿关节炎(NORA)患者未来MTX反应持续相关的微生物组特征，我们研究了3个RA队列。队列1(N=47)由在纽约大学3个风湿病诊所连续招募的患者组成，此前已被我们的团队研究过。队列2(N=24)为本研究在纽约大学和加州大学旧金山分校新招募的患者。队列3(N=29)由2017年4月至2019年7月期间从英格兰12个门诊风湿病诊所招募的英国患者组成；队列3的数据从序列读取存档(SRA)下载。我们认为，研究在不同时间段和地理区域收集的三个不同队列将提供机会，识别可推广到RA患者的基于微生物组的MTX反应预测因子。此外，联合分析可导致样本量和检测关联的效力增加。三个队列(N=100)的人口统计学数据见表1。
所有患者均接受口服MTX作为标准护理治疗。MTX反应在MTX治疗开始后12-16周进行评估。患者被分类为MTX-R(N=47, 47%)或MTX-NR(N=53, 53%)，如前所述，基于MTX单药治疗后DAS28改善≥1.8且无需额外或替代治疗。
研究人群的平均年龄为48.6±15.2岁，研究组间无差异(MTX-R 48.0±15.9，MTX-NR 49.0±14.7，Welch's t检验，p=0.76)。与RA的女性优势一致，76%的受试者为女性，MTX-NR(43名女性，10名男性)和MTX-R(33名女性，14名男性)的性别分布相似。
治疗前肠道微生物组与三个队列中未来MTX反应相关
我们先前已表明，NORA患者的治疗前肠道微生物组与未来临床反应相关，其他人也证实了这一发现。在这里，我们询问微生物组-药物反应关联是队列特定的还是在跨越地理和时间尺度的更大患者组合中可检测到普遍趋势。如预期，联合分析显示，队列与微生物组结构和功能显著相关；这可能是由于样本收集和技术工作流程的差异以及与地理位置相关的固有微生物组变异所致。为了解决这些队列特定的批次效应，我们使用MMUPHin工具对微生物组数据进行标准化和批次校正，以进行后续综合分析。值得注意的是，校正前由队列解释的属水平微生物组方差为11%(PERMANOVA R²=0.109，p=0.0009)，校正后显著降低至3%(PERMANOVA R²=0.03，p=0.004)。
使用批次校正数据集，我们首先分析了微生物分类多样性差异。物种Shannon多样性(α多样性)在MTX反应间无差异(Welch's t检验，p=0.06)。相比之下，群落组成(β多样性)在门、属、种和菌株水平上与MTX反应相关(PERMANOVA，p<0.05)。为识别与MTX反应相关的特定分类群，我们使用多变量线性回归，调整年龄、性别和队列。在门水平上，我们发现MTX-NR表现出厚壁菌门(Firmicutes)丰度更高，拟杆菌门(Bacteroidota)丰度更低(线性回归FDR≤0.2)，这与我们先前报告一致。当按队列分层时，队列1和队列3显示出一致的趋势，具有低至中度异质性。
接下来，我们在较低分类水平上检查了丰度差异，测试了79个微生物科、159个属和235个种。一个科、5个属和2个种的丰度显著不同(线性回归，FDR<0.2)。Odoribacteriaceae科和Odoribacter属在MTX-NR中更低(线性回归，FDR<0.2)。Dorea和Ruminococcus属在MTX-NR中显著更高(线性回归，FDR<0.2)。在种水平上，粪拟杆菌(Bacteroides caccae)在MTX-NR中更低，糟渣瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)在MTX-NR中更高(线性回归，FDR<0.2)。总之，这些发现确定了与不同队列中MTX反应相关的微生物组特征，并加强了肠道微生物组可预测未来MTX反应的假设。
治疗前肠道微生物功能与队列间MTX反应状态相关
鉴于按MTX反应观察到的微生物群落组成差异，我们接下来研究了微生物功能谱，观察基因和通路丰度。虽然不同基因功能的总数无差异(Wilcoxon秩和检验p=0.34)，但基因功能组成按MTX反应不同，表明肠道微生物编码的基因与并可能影响MTX治疗结果(PERMANOVA，R²=0.019，p=0.031)。使用调整年龄、性别和队列的多变量线性回归，我们检测到37个基因在未来的反应状态上丰度不同，包括8个在MTX-NR中富集和29个在MTX-NR中减少的基因(FDR≤0.2)。这些包括参与氨基酸、碳水化合物和核苷酸代谢等的基因，表明广泛的微生物代谢通路与MTX反应相关。
同样，对通路丰度(MetaCyc通路)的分析显示，治疗前微生物组按未来反应状态不同。虽然通路总数在组间相似(Welch's t检验，p=0.22)，但我们发现通路丰度组成按MTX反应不同(PERMANOVA，R²=0.027，p=0.018)。调整年龄、性别和队列后，我们发现482个通路中有5个通路丰度显著不同(FDR≤0.2)。两个参与次黄嘌呤核苷酸生物合成的通路在MTX-NR中减少："次黄嘌呤-5′-磷酸生物合成I"(PWY-6123)和"次黄嘌呤-5′-磷酸生物合成II"(PWY-6124)(FDR≤0.2)。相反，MTX-NR表现出"嘌呤碱基降解I，厌氧"(P164-PWY)、"甲醛同化III，二羟基丙酮循环"(P185-PWY)和"甘油降解至1,3-丙二醇的超通路"(GOLPDLCAT-PWY)的富集(FDR≤0.2)。这些发现共同表明，MTX-NR微生物群具有降低的核苷酸合成能力和增强的嘌呤降解、甘油代谢和甲醛同化能力。
此外，我们对排序的KEGG正交组(KO)丰度进行基因集富集分析(GSEA)，以增强识别与生物学相关基因集一致变化的敏感性。总共29个代谢通路丰度不同(FDR<0.05)，其中7个通路富集，22个通路在MTX-NR中减少。MTX-NR的微生物组显示出与核苷酸/辅因子代谢、氨基酸生物合成、蛋白质合成和细胞生长相关的代谢通路减少。值得注意的是，几个在MTX-NR中减少并在MTX-R中富集的氨基酸通路——包括精氨酸、组氨酸和色氨酸代谢——先前已与关节炎和MTX疗效相关联，表明增加的微生物氨基酸代谢可能有助于改善治疗反应。总的来说，这些发现表明，MTX-NR微生物组表现出降低的氨基酸和核苷酸代谢、中心碳处理以及辅因子和次级代谢物生物合成的潜力，而这些通路在MTX-R中富集。
与未来MTX反应相关的跨王国通路
在宿主中，几个通路已被证实与塑造MTX反应相关，包括参与核苷酸代谢、腺苷产生、叶酸介导的反应和氨基酸代谢(特别是组氨酸、色氨酸和精氨酸)的基因。许多这些通路在微生物中保守，但这些特定微生物通路或基因是否与MTX反应相关尚不清楚。有趣的是，我们的GSEA显示，MTX-R中这些通路中的几个显著富集(FDR<0.05)。因此，我们询问不同丰度的KO是否与先前与MTX疗效相关的基因重叠。
我们首先关注参与核苷酸代谢的微生物功能，因为这是MTX作用机制的核心。与腺嘌呤磷酸核糖转移酶(apt; K00759)和核苷三磷酸焦磷酸化酶(yhdE; K06287)相关的KO在MTX-R的微生物组中显著更高(线性回归，FDR<0.2)。虽然核苷三磷酸焦磷酸化酶(yhdE)广泛调节核苷酸代谢，但apt特异性催化腺嘌呤转化为腺苷单磷酸(AMP)，随后可在细胞外代谢为腺苷。鉴于MTX部分通过腺苷发挥抗炎作用，MTX-R中微生物核苷酸代谢的富集可能增强腺苷可用性并有助于腺苷介导的免疫调节。
鉴于先前证据将氨基酸代谢与关节炎和MTX反应联系起来，我们接下来研究了参与氨基酸代谢的不同丰度KO。与先前研究一致，色氨酸生物合成通路在MTX-R中富集。此外，MTX-R显示出前苯丙氨酸脱水酶(pheA2; K04518)的富集，该酶将前苯丙氨酸转化为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成中的苯丙酮酸。
此外，微生物精氨酸代谢在治疗组间有所不同。L-精氨酸可改善关节炎，降低疾病严重程度和骨丢失。MTX-R显示出谷氨酸脱氢酶NADP+和精氨琥珀酸合成酶(argG; K01940)的富集(线性回归，FDR<0.2)。这两种酶都参与L-精氨酸合成通路。
总之，这些观察表明，MTX-R的微生物组具有增加的核苷酸和氨基酸产生能力，可能有助于增强MTX反应。
与未来MTX反应相关的微生物基因参与MTX代谢
最近，我们报告说肠道微生物组调节MTX在关节炎中的生物利用度和治疗结果。基于这一观察，我们调查了微生物MTX代谢能力是否在MTX-R和MTX-NR之间不同。我们先前报告了18种预测代谢MTX的微生物酶(Prokka注释)；其中9种映射到我们在三个队列中检测到的KO基因。有趣的是，这些预测MTX代谢KO的累积丰度在MTX-NR中显著富集(Welch's t检验，p<0.05)，在每个单独队列中观察到一致的趋势。
此外，我们最近表明，肠道微生物能够通过MTX代谢产生如p-甲基氨基苯甲酰基-L-谷氨酸(p-MABG)等代谢物。abg操纵子介导结构相关化合物p-氨基苯甲酰基-L-谷氨酸(p-ABG)的运输和代谢。该操纵子由三个基因组成：abgA和abgB，它们编码p-氨基苯甲酰基-谷氨酸水解酶亚基A和B，以及abgT，它编码转运亚基T。因此，我们询问KO中对应于abg操纵子基因的KO是否丰度不同。值得注意的是，对应于这三个基因的KO累积丰度在MTX-NR中显著更高(Welch's t检验，p=0.008)，在队列间观察到类似效应。
总之，这些发现表明，MTX-NR微生物组富含参与MTX降解的基因。微生物MTX降解基因可能降低MTX生物利用度，从而导致对MTX的反应不良。
基线DAS28评分与三个队列中未来临床反应相关
发现RA患者的治疗前微生物组与MTX反应相关后，我们接下来询问是否可以使用微生物特征开发预测模型，无论是否包含临床参数。首先，我们询问临床参数（如年龄、性别、基线疾病活动度或血清状态）是否与未来MTX反应相关，因为先前研究表明一些关联。在已确诊RA患者中，基线DAS28-ESR、抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)和健康评估问卷(HAQ)评分已被确定为有利MTX反应的主要预测因子。这在新发类风湿关节炎(NORA)中是否也成立尚不清楚。
有趣的是，在NORA患者中，我们观察到基线DAS28评分在未来的MTX-R中高于MTX-NR(Welch's t检验，p=0.012)。这种趋势在所有三个队列中都观察到，表明基线疾病活动度更高与患者对MTX反应可能性增加相关。接下来，我们询问基线DAS28是否与治疗前微生物丰度相关。这将使我们能够识别与疾病活动度相关并可能影响治疗结果的分类群。在属水平上，4个细菌属与基线DAS28显著相关(Spearman等级相关检验，FDR≤0.2)，其中3个呈正相关(Allisonella, Ligilactobacillus, Segatella)。在种水平上，我们发现Eubacteriaceae bacterium与基线DAS28呈负相关(Spearman等级相关检验，FDR=0.13)。相反，9个细菌种与DAS28呈正相关，包括Allisonella histaminiformans、Clostridium fessum、Dialister hominis、Gemmiger SGB15295、Lachnospiraceae bacterium OF27 8pH9A、Ligilactobacillus ruminis、Segatella brunsvicensis、Segatella copri和Veillonella atypica(Spearman等级相关检验，FDR≤0.2)。值得注意的是，Segatella copri(以前分类为Prevotella copri)已反复与RA发病机制相关联。我们的发现通过进一步将S. copri丰度与疾病严重程度相关联扩展了这些观察结果。
我们接下来研究了微生物功能是否与DAS28评分相关。Spearman相关分析显示495个KO与DAS28显著相关，包括461个正相关和34个负相关(FDR≤0.2)。值得注意的是，三甲胺-N-氧化物(TMAO)还原酶细胞色素c与DAS28呈负相关(FDR=0.033)。鉴于TMAO通常具有促炎作用，这表明细菌TMAO还原活性可能降低全身TMAO水平，从而可能降低RA患者的疾病严重程度。在正相关的KO中，2个KO与不同的维生素生物合成通路相关(Spearman等级相关检验，FDR≤0.2)：二氢蝶酸合酶(folP; K00796)已被证明催化从头叶酸通路中的关键步骤，5-氨基-6-(5-磷酸-D-核糖氨基)尿嘧啶磷酸酶(ycsE/yitU/ywtE; K21064)在核黄素生物合成中发挥作用。这表明微生物产生叶酸和核黄素的能力与基线时升高的疾病严重程度相关。
治疗前肠道微生物组预测队列间MTX反应
鉴于上述关联，我们接下来询问这些基线临床和微生物特征是否可用于开发跨队列预测模型，使用随机森林。我们训练和验证了整合年龄、性别、DAS28和/或KEGG丰度特征的随机森林模型，以预测MTX反应，通过受试者工作曲线下面积(AUC-ROC)评估性能。
我们首先采用留一队列出(LOCO)框架(见方法)评估在独立验证队列上的泛化能力：模型在两个队列上训练并在剩余的第三个队列上测试。基于KEGG正交组的模型性能取决于训练队列大小和地理代表性：在队列1和队列3(美国和英国合并N=76)上开发的模型在队列2(美国队列N=24)上表现出0.8的AUC，而当在队列3上测试时模型性能最低(AUC=0.59)，其中模型在美国患者(N=71)上训练并在英国患者(N=29)上验证。总体而言，当在3个独立验证队列上平均性能时，基于KEGG的模型性能适中，达到0.69的AUC。基于KEGG特征的模型(补充表14)比基于临床参数(年龄、DAS28评分、性别)的模型更具预测性(平均AUC=0.56)。将临床参数与KEGG特征一起纳入并没有提高模型性能(平均AUC=0.68)。这些发现表明，人类肠道微生物组提供跨队列预测能力，并可超越仅使用临床参数构建的模型的性能。
考虑到训练队列大小和地理代表性与LOCO分析中的模型性能相关，我们接下来询问包含所有三个队列的组合训练队列是否具有更大的预测能力。我们应用分层训练-验证框架(见方法；补充表15)，将所有三个队列汇集并拆分为80/20训练和验证队列：患者样本分为训练队列(N=81；38个MTX-R和43个MTX-NR)和保留的验证队列(N=19；9个MTX-R和10个MTX-NR；补充表15)。我们在训练队列上应用Boruta算法进行特征选择，识别出13个预测MTX反应的KO(补充表16)。在训练样本上的交叉验证中，整合KEGG特征的模型表现出强大的区分性能(补充表17)：仅KEGG模型达到0.879±0.078的平均AUC，而KEGG特征与临床变量组合显示出最高性能(AUC=0.895±0.071)。相比之下，仅临床模型表现出中等性能(AUC=0.63)，而DAS28、年龄或性别等单个变量的性能接近随机分类(AUC<0.59)。
在保留的验证队列上测试时，仅使用KEGG特征的随机森林模型达到类似的高预测性能(AUC=0.88)，并且优于基于DAS28、年龄或性别的临床变量模型(AUC≤0.67)。
将临床特征单独添加到Boruta选择的KEGG特征(KEGG+年龄、KEGG+性别或KEGG+DAS28)略微降低了预测性能(AUC=0.84-0.87)，而组合所有临床和KEGG特征的模型显示出比仅KEGG特征略有改善的性能(AUC=0.92)。总之，基于微生物组的模型在预测跨队列MTX反应方面表现出强大的区分性能。
为更好地了解预测未来MTX反应的微生物组特征，我们接下来检查了由Boruta选择的13个KO，发现这些KO代表了与RA和/或自身免疫具有合理联系的多样化微生物功能。首先，K01197(hya；透明质酸葡萄糖胺酶)编码一种分解透明质酸(HA)的酶，这是肠道细胞外基质和关节滑膜的关键成分。HA作为支持特定分类群生长的微生物底物。重要的是，降低的滑膜HA水平与RA相关。
其次，5个核糖体蛋白也具有预测性：3个大亚基蛋白(rplW，大亚基核糖体蛋白L23；rplN，大亚基核糖体蛋白L14；rpmD，大亚基核糖体蛋白L30)和2个小亚基蛋白(rpsM，小亚基核糖体蛋白S13；rpsS，小亚基核糖体蛋白S19)。值得注意的是，K02892(rplW)与RA病理相关：其真核同源物RPL23A是一种普遍表达的自身抗原，特异性在RA患者中引发T细胞和自身抗体反应。此外，K02874(rplN)的真核同源物已被建议作为自身免疫疾病中的自身抗原。此外，这些在未来的MTX-R中富集(补充表6)和/或与DAS28呈正相关(补充表13)。其余7个KO与RA没有明确联系，与氨酰-tRNA生物合成(K00773, K01876)、营养获取(K01995, K04758)、蛋白质降解(K01358)、RNA周转(K08300)和DNA修复(K09760)相关(补充表16)。总体而言，我们的研究表明，与自身免疫疾病发病机制相关的KO子集也可能作为治疗反应的预测因子。
总之，这些结果表明，治疗前微生物组可以在独立验证队列中预测未来MTX反应，如LOCO分析所示。此外，包含RA患者多样性的模型提供了更大的预测能力。
讨论
多项研究已证明人类肠道微生物组与治疗结果之间的联系，但预测性微生物特征是否在不同研究人群中一致预测尚不清楚。我们的研究代表了对NORA患者肠道微生物组的首次综合分析，以识别与MTX反应相关的跨队列微生物特征，并为开发预测治疗反应的可推广模型提供框架。通过联合分析来自美国和英国的3个队列，我们识别了与MTX反应相关并在队列间预测的微生物分类群和功能，其中许多与RA或MTX具有生物学意义的联系。
与我们先前的发现一致，拟杆菌门在合并队列的MTX-NR中减少，厚壁菌门在MTX-NR中富集。这种厚壁菌门的富集值得注意，因为我们先前报告说该门富集了MTX代谢物种：在测试的16个厚壁菌门中，有62%(10个)从培养基中耗尽MTX，而在14个拟杆菌门中为0%。相比之下，拟杆菌门门的成员往往对MTX治疗敏感，通过生长抑制评估。这些观察结果使我们推测，MTX-NR中厚壁菌门的较高丰度可能导致增加的MTX代谢，从而导致反应良好的可能性降低。相反，MTX-R中敏感的拟杆菌门水平较高可能允许MTX通过作用于微生物组和宿主来减少炎症，从而发挥其抗炎作用。
为进一步支持这一可能性，合并分析表明，候选MTX代谢基因在MTX-NR中富集，在所有三个队列中观察到一致的趋势。这些候选MTX代谢基因使用相似性算法SIMMER识别，我们先前在队列1中显示这些基因在MTX-NR中更高。这一结果现在在此处另外两个患者队列中得到复制。此外，这些基因在药代动力学研究中显示出增加的微生物群依赖性MTX代谢的小鼠中富集，并且它们与通过临床关节炎评分评估的SKG小鼠模型中的MTX反应相关。结合我们对RA患者微生物群落的体外研究，显示从培养基中耗尽MTX与未来MTX反应呈负相关，这些发现提供了强有力的、定量的正交证据，证明人类肠道微生物组对MTX的微生物代谢在临床上是相关的。事实上，它可能是一个可修改的因素，可用于预测和改善RA的治疗结果。
功能分析表明，先前在宿主中与RA和MTX相关的通路也在肠道微生物组中检测到，并与MTX反应相关。实验证据表明，宿主对组氨酸、色氨酸、精氨酸和核苷酸的代谢在MTX反应中具有机制相关性。在我们的分析中，所有这些肠道微生物通路在MTX-R和MTX-NR之间丰度不同。这些发现提供了证据，将微生物宿主代谢过程的微生物相关物与RA中的MTX反应联系起来。需要进行实验研究来评估这些微生物通路是否有助于MTX反应。
我们出乎意料地发现基线DAS28评分在未来MTX应答者中显著更高，这种趋势在所有三个队列中可重现，表明基线疾病活动度更高与新发RA患者中MTX反应可能性增加相关；这与在已确诊RA患者中的发现相反。尽管如此，使用DAS28的预测模型仅达到中等区分(AUC=0.64)。有趣的是，S. copri与DAS28呈正相关，与先前将S. copri扩增与RA风险和严重程度增加联系起来的研究一致。有趣的是，以Segatella为主导的健康杂食个体据报道表现出血清三甲胺N-氧化物(TMAO)基础水平升高，这是一种与促炎作用和动脉粥样硬化相关的代谢物。值得注意的是，我们观察到DAS28与微生物TMAO还原酶(torZ；三甲胺-N-氧化物还原酶[细胞色素c])呈负相关，表明TMAO还原细菌与RA患者较低疾病活动度之间可能存在机制联系。
最后，基于治疗前KEGG正交组丰度训练的机器学习模型能够准确预测未来MTX反应。留一队列出(LOCO)和分层拆分框架均显示，基于微生物组特征的模型可以在预测MTX反应方面优于临床特征。LOCO分析显示，基于微生物组的模型可以在独立验证队列中以高预测能力预测反应：队列2(为本研究新招募的队列)以AUC=0.80预测。虽然其他队列没有以高能力类似预测，但这可能是由于训练队列大小减小、反应状态中的类别不平衡和/或训练队列不能代表验证队列，表明在更大、更具代表性的队列上训练可以改善跨队列泛化性。因此，当我们在所有三个队列的样本上训练模型时，模型性能在保留的验证队列上得到改善。
值得注意的是，我们的研究确定了与自身免疫疾病和宿主-微生物群相互作用相关的特定KEGG正交组。值得注意的是，hya (K01197)编码一种作用于宿主透明质酸(HA)的透明质酸葡萄糖胺酶，这是肠道细胞外基质的主要成分。通过降解HA，该酶促进细菌进入和粘附到粘膜层，从而影响上皮屏障功能和免疫信号传导。有趣的是，该基因出现在三个LOCO模型中的两个中(补充表14)和分层拆分模型中(补充表16)。同样，rplN (K02874)在两个LOCO模型(补充表14)和分层拆分模型(补充表16)中检测到。值得注意的是，rplN (K02874)和另一个预测因子rplW (K02892)的真核同源物是患者和自身免疫疾病小鼠模型中已知的自身抗原。它们在MTX-R中富集和/或与基线DAS28呈正相关，这让我们推测模仿宿主自身抗原的肠道微生物蛋白可能在一些RA患者中引发炎症；它们的富集作为RA中MTX治疗反应的有利预测因子，鉴于MTX可能作用于肠道微生物组以减轻炎症。
尽管如此，这项研究存在局限性。首先，总体样本量适中(N=100)，但考虑到在治疗开始前前瞻性招募新发RA患者的固有挑战，这代表了迄今为止调查MTX反应微生物预测因子的最大RA患者队列。其次，当前分析主要是关联性的，但我们先前在小鼠和体外和体外的研究支持总体发现。
第三，我们的最终模型是在所有三个队列的受试者上训练的，独立验证队列将进一步加强我们的发现。
尽管存在这些局限性，我们的多队列分析为肠道微生物组与RA患者反应相关并预测未来反应的假设提供了强有力的支持，并且可推广的基于微生物组的预测因子可能推进RA治疗中的精准医学。此外，我们的研究提供了来自多个临床队列的证据，表明肠道微生物组中MTX代谢基因的富集与MTX反应可能性降低相关。这些发现为未来阐明微生物代谢通路在调节对MTX反应中的作用的机制研究提供了基础。
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