尽管基因编辑并非新概念，锌指和TALEN平台早已投入使用，但CRISPR-Cas9的发现将基因编辑研究和临床转化推入了高速发展阶段。然而，就像其他平台一样，这个新秀并非适用于每种遗传疾病的每种编辑情况。
该领域长期以来的愿望是找到一种与突变无关的"一次治疗，永久治愈"方案，用于治疗那些由基因中多个突变或大规模染色体结构变异（包括缺失、重复、倒位和易位）引起的遗传疾病。这些遗传疾病的基因治疗需要大规模DNA操作，与校正单核苷酸点突变相比，面临着不同的技术和监管挑战。
科学家们戴上印第安纳·琼斯式的探险帽，寻找基因编辑的圣杯。正在探索的有前景的方法包括桥接重组酶、大型丝氨酸重组酶和CRISPR相关转座酶(CASTs)，以及像环状单链DNA(cssDNA)这样的免疫逃逸DNA载荷，后者可能解决双链DNA(dsDNA)载荷的先天毒性问题。
然而，对于大型载荷，递送仍然是一个难题。在很大程度上，当前的递送机制在载荷大小方面有限制，即使是使用mRNA格式和利用逆转录酶的变通方法也是如此。
需求是存在的，探索也将继续。适用于大型DNA载荷和递送机制的新基因编辑工具将得到完善，为一些可恶的疾病带来潜在的治愈希望。
桥接重组酶
桥接重组酶是一类新的可编程基因编辑工具，是第一种RNA引导的DNA重组酶，为DNA操作提供了独特的机制。
该系统有两个关键组成部分：重组酶酶，催化DNA重排；以及具有两个独立可编程环的桥RNA引导。靶向结合环控制基因组位点靶向，供体结合环指定供体载荷。
通过重新编程桥RNA来改变靶点和供体位点的构型和方向，使系统能够重新定向以执行从基因组中切除所需序列或原位倒转DNA片段。模块化意味着单一的两组分系统可以通过单一统一机制执行所有三种基本DNA重排——插入、切除和倒转。
"桥接重组酶最直接的优势是它们能够操作的DNA规模，"Arc研究所联合创始人兼核心研究员、斯坦福大学病理学助理教授Patrick Hsu博士表示。"一种能够在整个基因替换或校正结构变异规模上操作的技术，开辟了一类新的基因干预方式。"在人类细胞中已证明可实现多千碱基插入、高达0.93 Mb的倒转以及高达0.13 Mb的切除。
桥接重组也不依赖于dsDNA断裂。重组酶通过共价中间体直接催化链交换，使结果具有确定性，而依赖核酸酶的方法则不具备这一特点。这表明该系统在治疗应用中的有丝分裂后细胞中可能具有优势。该系统的大小约为Cas9的四分之一，可以编码在容量有限的递送载体中。
"该技术仍在开发中。虽然我们当前的效率和特异性数据（20%的插入效率和82%的靶向特异性）在人类细胞中代表了有意义的概念验证，但要实现安全有效的治疗应用，提高这两个指标是必要的，"Hsu说。自然界中发现的桥接重组酶系统的多样性仍在继续探索中。
大型丝氨酸重组酶
"对于更简单的情况，当我们想要将DNA载荷插入固定的"安全港"位点时，我们正在研究大型丝氨酸重组酶(LSRs)，"Hsu说。虽然这些酶缺乏桥接重组酶的RNA可编程性，但它们提供了非常高的插入效率和特异性，并且实际上是单向的，导致大型DNA载荷在人类基因组中非常稳定的插入。
2025年发表在《自然·生物技术》上的一篇论文描述了一种经过工程改造的LSR酶，能够以53%的效率和97%的全基因组特异性实现多千碱基DNA载荷的位点特异性插入。重要的是，已证明LSRs在非分裂细胞中（包括原代人T细胞）表现良好。
由Hsu联合创立的Stylus Medicine公司计划推进LSRs用于体内基因治疗。"我很期待看到将重组酶技术与机器学习辅助的蛋白质工程以及DNA和效应物递送方面的进步相结合，将为挑战性疾病环境带来哪些新疗法，"Hsu说。
CRISPR相关转座酶
CASTs是自然存在的细菌系统，利用无核酸酶活性的CRISPR机制将DNA整合到由向导RNA(gRNA)指定的基因组位置。"虽然CRISPR通常用于切割DNA，但CASTs却利用CRISPR系统引导位点特异性DNA转座，"哈佛大学化学与化学生物学系Isaac Witte博士说。
2019年，两个研究小组——一个由哥伦比亚大学的Sam Sternberg博士领导，另一个由麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的Feng Zhang博士领导——发现CASTs利用CRISPR系统通过转座酶复合物靶向DNA转座。后续工作证明CASTs是高效的细菌基因组编辑器。
CASTs可以移动多千碱基规模的DNA载荷，其自然进化的转座机制避免了在基因组中形成dsDNA断裂。问题是野生型系统在人类细胞中的整合活性极低（通常≤0.1%的处理细胞）或检测不到。
与Sternberg实验室合作，麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的David Liu博士实验室使用PACE（噬菌体辅助连续进化），一种由Liu实验室开发的定向进化平台，来提高CAST转座的效率。
在PACE中，感染宿主细菌的噬菌体在复制必需基因的位置编码进化基因。该必需基因实际上由宿主细菌编码。"在PACE中，你将进化生物分子的所需活性与该必需基因的表达联系起来。在本例中，我们将靶向DNA整合与编码进化CAST蛋白质组分的噬菌体复制联系起来，"Witte说。
一系列修改确保了活性的高效增强，从而产生了CAST转座酶蛋白TnsB的进化变体，该变体在人类细胞中介导了超过200倍的改进整合活性。TnsB蛋白包含十个分散在预测结构中的单个突变，这些突变有助于提高活性。
进化后的TnsB与其他PACE进化和理性设计的CAST组件结合，产生了evoCAST，一个为人类细胞整合活性优化的系统，发表在《科学》杂志上。
evoCAST DNA整合不需要在基因组中形成dsDNA断裂，从而导致传统基因插入方法（如核酸酶刺激的同源定向修复(HDR)）中常见的插入和缺失突变(indels)水平检测不到。此外，通过改变gRNA序列，evoCAST可以轻松重新编程到感兴趣的基因组位点，并支持各种DNA载荷大小，范围从不到1kb到至少15kb。
然而，潜在的局限性是evoCAST分子复杂，包含七个不同的蛋白质亚基，使得总编码大小（约8.5kb）相对于Cas9的约5kb来说相对较大。
根据Witte的说法，宏观层面的局限性集中在递送上，例如减轻大多数治疗相关细胞类型中外源dsDNA的细胞毒性。此外，减少集成活动所需的尺寸和不同组件的数量可能有助于evoCAST在体内的应用。下一步包括利用CAST系统现有的自然多样性，为人类细胞中的基因编辑开发更多样化的CAST系统。
环状单链DNA
Full Circle Therapeutics的基因组编写技术围绕一种免疫逃逸DNA模态展开，即一种称为C4DNA的微型cssDNA——环状、清洁、隐蔽且可定制，最高可达20kb。
"基因编辑的圣杯是千碱基DNA整合。虽然大多数研究集中在新编辑酶的发现上，但我们从供体方面解决这一挑战。要在特定基因座整合基因大小的DNA，供体载荷模板的选择包括ds、ss、环状或线性DNA。使用RNA格式和利用逆转录酶的变通方法仍然在尺寸上受限，"Full Circles Therapeutics联合创始人兼首席科学官Howard Wu博士说。
该公司已商业化超过350种研究级cssDNA用于原始序列，并正在为临床应用开发GMP级产品的工艺。据Wu介绍，最初，公司创始人Richard Shan打算将线性cssDNA作为DNA商品供应给基因整合领域的研究人员。起始材料是被切割成线性链的cssDNA。一项使用cssDNA作为对照的偶然基准实验显示出比其线性对应物更好的整合性能。这一意外结果导致了一项基础专利，描述了将cssDNA用于靶向基因组整合。
在对不同DNA格式进行基准测试后，cssDNA表现更优，并且与各种CRISPR-Cas系统以及其他如TALEN等巨核酸酶编辑系统兼容。接下来，他们评估了假设：如果移动遗传元件如转座酶系统和LSRs可以使用cssDNA，则由于dsDNA引起的免疫原性可以被消除。
与哈佛医学院Benjamin Kleinstiver博士领导的团队合作，他们证明裸露的未修饰cssDNA与piggyback转座酶或LSRs结合，可以实现千碱基编写，尽管效率不高。提高整合效率的一种方法是设计一种可以通过氢键与cssDNA融合形成部分双链的寡核苷酸。与dsDNA相比，30-60个碱基的部分双链显示出良好的整合效率，同时保持免疫沉默。
在另一种方法中，团队修改了核编辑器并安装了从细菌基因组中鉴定出的具有与cssDNA强结合亲和力的肽序列。在这种情况下，修改后的Cas9成为一种工程分子伴侣，招募DNA分子并形成复合物，有效地将基因组工程复合物加载并递送到细胞核并直接靶向基因组。
与Kleinstiver实验室的持续合作旨在提高整合效率。在这种情况下，该方法使用部分双链cssDNA重新构建重组酶识别序列。科学家们将这种通过核合成模板添加大长度进行整合的方法称为INSTALL。INSTALL与多种基因组工程技术核酸酶和RNA引导重组酶兼容，可实现高保真千碱基规模的人类基因组编写。
"我们欢迎合作伙伴，"Wu说。"现在正是讨论DNA药物的最佳时机。"
参考文献
- Hiraizumi, M, Perry NT, Durrant, MG, et al. Structural mechanism of bridge RNA-guided recombination. Nature 2024; 630:994-1002. doi:10.1038/s41586-024-07570-2
- Durrant, MG, Perry NT, Pai JJ, et al. Bridge RNAs direct programmable recombination of target and donor DNA. Nature 2025:630:984-993. doi:10.1038/s41586-024-07552-4
- Perry NT, Bartie LJ, Katrekar D, et al. Megabase-scale human genome rearrangement with programmable bridge recombinases. Science. 2026 Mar 12;391(6790):eadz0276. doi:10.1126/science.adz0276
- Fanton, A, Bartie, LJ, Martins JQ, et al. Site-specific DNA insertion into the human genome with engineered recombinases. Nat Biotechnol. 2025 Nov 6. doi:10.1038/s41587-025-02895-3
- Witte IP, Lampe GR, Eitzinger S, et al. Programmable gene insertion in human cells with a laboratory-evolved CRISPR-associated transposase. Science. 2025 May 15;388(6748). doi:10.1126/science.adt5199
- Xie K, Starzyk J, Majumdar I, et al. Efficient non-viral immune cell engineering using circular single-stranded DNA-mediated genomic integration. Nat Biotechnol. 2025 Nov;43(11):1821-1832. doi:10.1038/s41587-024-02504-9
- Nam H, Xie K, Majumdar I, et al. Engineering tripartite gene editing machinery for highly efficient non-viral targeted genome integration. Nat Commun. 2025; 16:4569. doi:10.1038/s41467-025-59790-3
- Tou CJ, Xie K, Ferreira da Silva J, et al. Immune evasive DNA donors and recombinases license kilobase-scale writing. Nature. 2026 Mar 11. doi:10.1038/s41586-026-10241-z
【全文结束】