年龄相关的记忆衰退严重影响着大部分老年人的生活质量。海马体中的神经印迹在记忆的形成、存储和回忆中起着关键作用。海马体将新信息存储于神经印迹的能力会随年龄增长而下降，但导致记忆丧失的机制尚不完全清楚。胃肠道微生物组新近被认为是调节认知的重要因子，并被视为一种可修饰的外周信号，可能促成年龄相关的记忆丧失。然而，肠道微生物信号传递到大脑以调节记忆的神经通路在很大程度上仍不清楚。在此，我们描绘了一条从肠道代谢物、先天免疫反应、迷走神经信号传导到海马体记忆编码的微生物组-肠-脑通路，该通路影响认知衰退的速度。我们的研究结果为外周干预提供了多个靶点，并表明炎症诱导的内感受功能障碍可能是年龄相关认知衰退背后一个普遍化的原理。
微生物组对认知衰退的影响
为了研究年龄相关的微生物组改变对认知老化的影响，我们通过将老年小鼠的肠道微生物群落移植到年轻受体小鼠中，实验性地将微生物组年龄与宿主年龄分离开来。我们通过将2个月大的小鼠与18个月大的小鼠共同饲养，实现了年轻小鼠中微生物组的加速老化，导致年轻和年老小鼠之间微生物群落的平衡，呈现出类似于老龄的状态。通过衰弱评分评估的身体健康状况在微生物组平衡后并未改变。
值得注意的是，与老年小鼠共同饲养一个月，在新型物体识别任务中损害了年轻小鼠的短期记忆，并且在延长共同饲养时间后仍然维持。这种现象在雌性和雄性小鼠中均观察到，以及在来自不同供应商的年轻和年老小鼠的各种组合中；然而，探索行为并未受到共同饲养的影响。同样在巴恩斯迷宫实验（一项长期空间学习和记忆任务）中观察到了老龄微生物组对学习和记忆的影响。
我们接下来试图区分共同饲养对肠道微生物群落组成的影响与其社会效应。为此，我们采取了四种正交实验策略。首先，我们将年轻小鼠与其他不同的年轻小鼠共同饲养，这并未影响它们的认知行为。其次，我们用从年轻或年老供体获得的粪便微生物组样本定植年轻的的无菌小鼠。微生物组移植在受体中重现了供体微生物组的组成，从而在没有共同饲养的情况下在年轻小鼠中建立了与年龄相关的微生物组改变。与共同饲养环境一样，加速年轻小鼠的微生物组老化在新型物体识别和巴恩斯迷宫任务中消除了学习和记忆表现，且未改变探索行为。我们的第三个实验策略是在无菌条件下进行共同饲养实验。我们将无菌小鼠老化至超过18个月，并在无菌隔离器中与年轻无菌小鼠共同饲养。值得注意的是，尽管共同饲养，但年轻无菌小鼠保留了其完整的认知能力，表明与年老动物共同生活的社会效应不足以诱发认知缺陷。在准备这些实验的老龄无菌小鼠时，我们还注意到它们的认知衰退速度相较于常规小鼠有所延迟，在18个月大时仍表现出正常的学习和记忆能力。第四，我们使用了多种抗生素策略，在年轻和年老小鼠共同饲养之前、期间或之后消融微生物定植。重要的是，共同饲养前其微生物组已被广谱抗生素消融的年老小鼠与年轻小鼠共同饲养，并未导致新型物体识别受损。此外，在共同饲养的同时使用抗生素也保护了年轻小鼠免受共同饲养的有害影响，从而重现了无菌条件下共同饲养获得的结果。我们还试图确定微生物组老化的负面影响是否可逆。为此，我们在年轻小鼠出现共同饲养诱导的认知缺陷后，对它们进行广谱抗生素治疗。两周的抗生素治疗不仅恢复了共同饲养的年轻小鼠的记忆表现，而且即使是年老小鼠在抗生素治疗后也显示出认知能力的改善。总之，这些发现表明，在老年时期，微生物组元素会促成认知衰退，这是一种可传播给年轻小鼠并可被抗生素治疗阻止的特性。
认知衰退的微生物驱动因素
我们接下来试图利用这些实验性的微生物组扰动来识别参与调节认知衰退的细菌微生物组元素。我们使用两个标准来确定候选分类群：（1）其相对丰度随年龄增长而增加，（2）它们通过共同饲养和微生物组移植传播给年轻动物。为了表征整个生命周期中微生物组的变化，我们追踪了一个由15只雄性C57BL/6小鼠组成的队列，纵向评估其健康状况，并从断奶到死亡期间每2-4个月对粪便内容物进行宏基因组测序和蛋白质组学分析。该队列显示出在2岁时出现衰弱和死亡率，平均寿命为955天，最大寿命为1，210天。我们使用Kraken 2将宏基因组读数分配至分类身份。年龄是微生物群分类组成变异的主要驱动因素，在生命周期中有1，133个物种的相对丰度显示出显著变化。与年龄相关的细菌群落变化的获取与微生物组宏基因组编码能力的改变有关，这通过KEGG直系同源物随时间的相对丰度变化确定。
然后，我们根据识别可能驱动认知衰退元素的标准，对分类学元素进行排序。首要候选物是金氏帕拉拟杆菌（Parabacteroides goldsteinii），其丰度随年龄增长而增加，并且可通过共同饲养和微生物组移植传播。粪便蛋白质组学也证实了帕拉拟杆菌属肽段的年龄相关增加。值得注意的是，用金氏帕拉拟杆菌定植无菌小鼠或抗生素处理过的小鼠会诱发认知障碍。此外，来自一个金氏帕拉拟杆菌天然高丰度设施的小鼠显示记忆功能降低。其他细菌，如另枝菌属和毛螺菌科，其丰度同样随年龄变化且可通过共同饲养传播，或者乳杆菌属，其未显示出随年龄的变化，并未影响认知功能。总之，这些发现表明，生命周期中的某些微生物组变化——包括金氏帕拉拟杆菌的过度生长——会影响小鼠认知衰退的速度。
大脑对微生物组老化的反应
学习和记忆高度依赖于海马体。因此，我们探索了微生物组老化和金氏帕拉拟杆菌过度生长是否影响海马体功能。成年海马体神经发生随年龄增长而下降，并与学习和记忆能力有关。我们注意到老年小鼠的海马体神经发生显著减少，但共同饲养的年轻小鼠并未受到影响。类似地，海马体中增强的炎症反应，如星形胶质细胞增生所示，仅在老年小鼠中观察到，而不能通过共同饲养传播给年轻小鼠。我们也没有观察到树突棘结构可塑性的任何差异。这些结果表明海马体神经发生、炎症或树突棘形态不太可能是微生物组影响学习和记忆的原因。
因此，我们采用基于无偏RNA测序的方法来评估具有不同宿主和微生物组年龄的小鼠的海马体分子变化。我们根据与宿主年龄或认知表现的相关性将差异表达基因分为四类。值得注意的是，新物体暴露诱导的即早基因激活在年轻小鼠中强烈观察到，但在老年小鼠组以及与老年小鼠共同饲养的年轻小鼠中均减弱。由于即早基因表达是神经元激活的指标，我们接下来探索了海马体的特定区域是否促成了这种神经元反应的减少。针对FOS的染色显示，共同饲养年轻小鼠的CA3、CA1和齿状回在应对新奇刺激时表现出受损的激活。此外，年轻小鼠微生物群样本的无菌受体在应对新物体时显示出齿状回活动的强烈增加，但来自年老供体的微生物群受体中的FOS反应则减弱。老年抗生素治疗或无菌小鼠认知能力的恢复与海马体对新物体的FOS反应恢复有关。相反，用年龄相关的细菌物种金氏帕拉拟杆菌定植年轻小鼠抑制了海马体对新物体暴露的反应。这些实验表明，年龄相关的微生物组变化通过改变海马体中的神经元反应来影响记忆功能。
内感受功能障碍与记忆丧失
值得注意的是，FOS反应的年龄相关变化并非海马体独有。包括孤束核以及体感和内嗅皮层在内的几个额外脑区在年老和共同饲养的年轻小鼠中均显示出降低的神经元激活。鉴于这些区域在感觉处理中的作用，我们假设衰老会导致通过肠道支配感觉神经元传导的内感受信息减少。我们利用了一个事实，即迷走神经和脊髓传入神经的大部分都表达香草素受体TRPV1，并评估了Trpv1DTA小鼠的认知表现，这些小鼠缺乏表达TRPV1的神经元。值得注意的是，年轻的Trpv1DTA小鼠显示出海马体激活减少，并在新型物体识别任务中模拟了老年小鼠的表型，同时保留了正常的总体海马体结构。在化学遗传学沉默TRPV1+神经元后也观察到了相同的效应。因此，我们推测感觉神经元的抑制可能是年龄相关微生物组变化对海马体功能的负面影响的基础。为了验证这一点，我们在与老年小鼠共同饲养的年轻小鼠中化学遗传学激活了TRPV1+神经元。值得注意的是，感觉神经元的激活完全恢复了它们的海马体FOS活动和认知表现，同时使年轻对照组的NOR能力保持不变。使用低剂量的TRPV1激动剂辣椒素也观察到了类似的效果，它挽救了老年小鼠和共同饲养的年轻小鼠的孤束核激活、海马体反应和记忆功能。辣椒素治疗同样能够克服金氏帕拉拟杆菌对海马体记忆的有害影响。不出所料，辣椒素对认知的有益作用依赖于TRPV1+神经元的存在。
鉴于TRPV1广泛表达于脊髓和迷走神经传入神经，以及大脑的某些区域，我们试图更精确地定义介导微生物对记忆功能影响的神经元群体，使用标记物引导的靶向感觉亚群。我们首先沉默了表达Phox2b的神经元，它标记迷走神经而非脊髓传入神经。对年轻小鼠中表达Phox2b的神经元进行化学遗传学抑制，足以重现记忆缺陷和海马体FOS抑制。然后，我们使用Phox2b和Trpv1表达神经元的交叉遗传学靶向，更选择性地靶向表达Trpv1的迷走神经细胞——通过全身成像确认——这同样消除了海马体对新奇刺激的反应和物体记忆。相比之下，通过鞘内注射树脂毒素或通过腹腔神经节切除术手术消融肠道支配的脊髓神经元来靶向脊髓中表达Trpv1的传入神经，并未影响认知表现。这些发现表明，迷走神经功能受损可能参与肠道调节年龄相关的认知衰退。为了直接验证这一假设，我们对年轻小鼠和与老年小鼠共同饲养的年轻小鼠的单个迷走神经元进行肠道营养输注时的钙成像。值得注意的是，携带年龄相关微生物组的年轻小鼠的结状神经节显示出减弱的迷走神经激活，表现为反应性神经元数量减少和神经元激活幅度降低。
迷走神经PHOX2B+ TRPV1+神经元由几个神经元亚群组成，包括表达胆囊收缩素A受体的肠道支配神经元。我们发现，通过结状神经节注射胆囊收缩素偶联的神经毒素皂素来消融CCKAR+神经元会损害认知表现，这与过去在大鼠中的观察结果一致。由于CCKAR+神经元对肠道CCK肽有反应并在肠道和海马体之间传递信息，我们试图确定CCK对迷走神经传入的刺激是否足以恢复老年小鼠的认知表现。值得注意的是，在外周给予CCK后，老年小鼠和共同饲养的年轻小鼠的认知表现与对照年轻小鼠无法区分，并且海马体FOS反应得到恢复。由于CCK不仅作为胃肠道迷走神经激活剂，还对其他组织产生激素效应，我们确定其增强记忆的效果是否依赖于感觉神经元。去神经支配的Trpv1DTA小鼠对CCK给药无反应，表明感觉神经元是CCK对海马体功能产生效应所必需的。使用胰高血糖素样肽1——另一种刺激迷走神经的肠道肽——也实现了相同的效果。一致地，GLP1受体激动剂利拉鲁肽增强了老年小鼠的记忆功能。尽管这些肠道肽能够恢复认知功能，但它们的内源性水平在老化和金氏帕拉拟杆菌定植期间并未改变。此外，CCKAR抑制剂地伐西匹和A-65186并未诱导认知缺陷，表明肠道激素水平降低并非导致认知衰退的年龄相关内感受功能障碍的原因。
肠道代谢物与认知衰退
因此，我们试图确定年龄相关的微生物组变化影响迷走神经信号传导和记忆功能的机制。诱导认知功能障碍的微生物干预并未与肠道屏障通透性增加相关联。因此，我们测试了它们的活性是否由一种分泌分子介导。为此，我们培养了金氏帕拉拟杆菌并将其培养上清液通过口服补充给小鼠。值得注意的是，经过尺寸过滤的上清液部分足以诱导受体小鼠的认知衰退。相比之下，来自沙氏另枝菌培养物的上清液未显示活性。金氏帕拉拟杆菌上清液的活性在3kDa尺寸过滤后得以保留，并在不同的培养基中观察到。因此，我们得出结论，金氏帕拉拟杆菌对海马体功能的影响可能由小分子代谢物介导。为了识别候选分子，我们对培养上清液进行了非靶向代谢组学。在金氏帕拉拟杆菌培养物中富集最显著的分子中包括中链脂肪酸3-羟基辛酸（3-HOA）。值得注意的是，口服补充这种代谢物——它会增加其在局部和全身的浓度，但不在脑中——足以重现海马体反应降低和物体识别受损，表明它在调节年龄相关认知衰退中可能具有重要作用。为了确定这种功能是3-HOA独有的，还是可推广到其他MCFAs，我们检查了癸酸和月桂酸，这两种酸由于水不溶性而在我们最初的代谢组学实验中未被检测到。这些MCFAs同样因金氏帕拉拟杆菌定植而增加，并且在口服给药后对认知有类似效果。类似于老龄微生物组，MCFA处理减弱了迷走神经激活，减少了孤束核中的神经元刺激，并损害了海马体对新物体暴露的反应。
MCFAs可作为细菌脂多糖中脂质A的组成部分存在。因此，我们推测微生物组变化可能导致衰老过程中MCFA水平升高。一致地，我们发现肠道腔内的MCFA丰度在常规定植的小鼠中随年龄增长而增加，但在无菌或抗生素处理的小鼠中则没有。此外，升高的腔内MCFA水平可通过共同饲养从年老小鼠传播给年轻小鼠。我们还假设，旨在减少细菌MCFA产生的干预措施可能能够减缓认知衰退的速度。鉴于噬菌体作为肠道微生物群落调节剂的潜力，我们筛选了能够恢复老年小鼠记忆功能的噬菌体。我们一致观察到，在使用靶向狄氏帕拉拟杆菌的噬菌体φPDS1处理的老年小鼠中，认知能力有所改善。其他噬菌体，如针对变形链球菌的φAPCM01或针对大肠杆菌的φX174，并未影响记忆功能。尽管狄氏帕拉拟杆菌在我们实验中使用的鼠群中不存在，但我们推测φPDS1可能会减少其分类学近亲金氏帕拉拟杆菌的丰度；然而，每种噬菌体都表现出强烈的宿主特异性，金氏帕拉拟杆菌的水平在体外和体内都不受φPDS1的影响。除了裂解作用，噬菌体感染还可以通过转录改变来影响细菌宿主的生物学——常常引起细胞表面结构的变化。为了探究金氏帕拉拟杆菌对φPDS1的转录反应，我们对噬菌体感染的培养物进行了RNA测序，并将其与暴露于φAPCM01的培养物进行比较。我们确实注意到两种条件之间存在强烈的转录差异，许多差异表达基因影响外层细胞壁生物学。重要的是，φPDS1降低了在老年小鼠肠道腔中检测到的MCFA水平。总之，这些发现表明，靶向肠道细菌的噬菌体可能降低肠道MCFA水平并减轻认知衰退。
肠道炎症与迷走神经功能障碍
我们接下来想更好地理解MCFAs如何影响认知功能。几种MCFAs是表面受体GPR84的高效激动剂。因此，我们研究了MCFAs对记忆的影响是否由GPR84信号介导。第一个证据来自以下观察：DBA小鼠——携带一个使它们天然缺乏GPR84功能的的点突变（扩展数据图8a）——对3-HOA对认知功能的影响具有抵抗力，并且尽管被金氏帕拉拟杆菌定植，但与C57BL/6小鼠相比，它们认知衰退的开始时间延迟（扩展数据图8b–d）。GPR84缺陷的C57BL/6小鼠同样免受MCFAs对海马体反应和记忆功能障碍的影响（图4p–r）。此外，GPR84激动剂embelin模拟了MCFAs对海马体FOS反应和新型物体识别的影响（图4s,t），而GPR84抑制剂PBI-4050则抵消了3-HOA对认知表现的影响，类似于迷走神经刺激剂辣椒素（图4u）。此外，PBI-4050恢复了海马体中的神经元激活，抵消了金氏帕拉拟杆菌对记忆功能的有害影响，并在老年小鼠中重新建立了年轻化的NOR表现（图4v–y）。综上，这些结果表明MCFAs对记忆形成的影响是由GPR84介导的，而抑制GPR84可能为年龄相关的认知衰退提供保护。
GPR84的表达主要局限于髓系细胞。事实上，在对肠道免疫细胞的单细胞调查中，我们发现Gpr84仅由巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞表达（图5a及扩展数据图8e,f）。因此，我们测试了髓系细胞在微生物组和MCFA诱导的认知老化中可能参与的作用。值得注意的是，CSF1R抑制剂PLX-3397（可耗竭髓系细胞）在共同饲养环境和3-HOA给药后均恢复了认知功能（图5b,c）。由于CSF1R抑制同时消融中枢和外周的髓系细胞（扩展数据图8g,h），我们尝试用正交策略靶向外周巨噬细胞，同时保留大脑中的小胶质细胞。重要的是，氯膦酸盐脂质体（可耗竭吞噬细胞，但不能穿越血脑屏障，扩展数据图8i,j）同样挽救了3-HOA对NOR的有害影响（图5d）。类似地，CCR2基因缺陷的小鼠（会导致髓系细胞向外周组织而非大脑的招募受损，扩展数据图8k–n）同样对3-HOA的影响具有抵抗力（图5e）。髓系细胞消融改善了迷走神经元对营养刺激的反应（图5f–h）以及海马体对新奇刺激暴露的反应（图5i,j）。
为了直接测试GPR84的效应是否由髓系细胞介导，我们生成了骨髓嵌合体，将受辐射的受体小鼠用来自野生型或GPR84缺陷小鼠的骨髓进行重建，验证了有效的移植，然后用MCFA处理受体（图5k及扩展数据图8o,p）。在这些小鼠中，只有当造血区室缺乏GPR84时，认知功能才得以保留（图5l）。为了提高对髓系细胞的特异性，我们使用了混合骨髓嵌合体，将受辐射的受体小鼠用50:50的GPR84缺陷和CCR2缺陷骨髓混合物进行重建（图5m）。在这些小鼠中，外周髓系细胞选择性地缺乏GPR84表达（扩展数据图8q），尽管经过MCFA处理，它们的认知表现保持完好（图5n）。耗竭其他免疫细胞类型并未影响NOR任务的表现（扩展数据图9a–h）。这些发现突出了外周髓系细胞上的GPR84在驱动MCFAs对认知老化的影响中起重要作用。
GPR84信号会触发促炎细胞因子的产生，如肿瘤坏死因子和白介素-1β（参考文献41,42；扩展数据图9i）。我们注意到，获得老年微生物组导致胃肠道局部以及脂肪组织中炎症细胞因子表达增加，但未在全身部位或脑部（扩展数据图9j–m）。我们假设MCFAs的亲脂性可能导致它们优先在脂肪组织中积累，并且肠系膜脂肪组织可能是胃肠道炎症细胞因子的一个来源。事实上，在MCFAs处理的小鼠中，我们观察到脂肪组织内的浓度增加，以及肠系膜和腹股沟脂肪组织中细胞因子表达升高（扩展数据图10a–c）。这在老年C57BL/6小鼠中也能观察到，但在老年DBA/2小鼠中则没有（扩展数据图10d–f），表明GPR84可能参与响应MCFA积累而驱动年龄相关的炎症。
最后，我们试图确定外周炎症细胞因子对记忆丧失的功能相关性。我们首先确认了施用TNF或IL-1β足以损害认知功能（扩展数据图10g,h）。这一效应可通过CCK治疗得以挽救（扩展数据图10g），表明尽管存在持续的炎症反应，迷走神经激活仍能恢复认知表现。第二，一种TNF中和抗体挽救了老年小鼠以及共同饲养的年轻小鼠的记忆功能，并保护它们免受3-HOA补充的有害影响（图5o,p）。类似地，IL-1β中和保护了老年和共同饲养的年轻小鼠（图5q）。此外，NLRP3（一种GPR84诱导的炎症小体组分，是IL-1β蛋白水解加工所必需的，参考文献41,44）的缺陷同样赋予了对3-HOA治疗认知影响的抵抗力（图5r）。我们还研究了参与认知衰退的TNF和IL-1β的细胞靶点。尽管TNF受体的表达主要在造血细胞上是必需的（扩展数据图10i），但在表达PHOX2B的细胞上删除IL-1β的受体抵消了MCFAs对记忆功能的影响（图5s），表明IL-1β信号在迷走感觉神经元上损害了其功能。一致地，感觉神经元的化学遗传学再激活保护了小鼠免受IL-1β对记忆的有害影响（图5t）。总之，我们的研究结果提出一个模型：衰老导致胃肠道环境的变化，包括金氏帕拉拟杆菌的过度生长和MCFAs的积累。这些代谢物进而通过GPR84信号驱动促炎性髓系细胞反应，从而损害迷走神经活动、海马体反应和记忆功能（扩展数据图10j）。
讨论
记忆丧失是衰老最具破坏性的方面之一，目前尚无有效的治疗方法。在这里，我们定义了一条连接肠道金氏帕拉拟杆菌、MCFAs、髓系细胞GPR84信号、细胞因子TNF和IL-1β、迷走神经功能障碍以及海马体新异反应降低的通路，该通路在衰老过程中导致记忆功能下降。
我们的结果提供了几个概念性进展。脑衰老具有很大的脑外源性成分。尽管已经定义了几种参与调节脑衰老的体液因子，但关于参与脑功能衰退的神经元性身体-大脑信号知之甚少。我们的研究表明，肠道和大脑之间的内感受交流路径可能在生命过程中丧失其功能，减少的感觉输入进入大脑促成了脑衰老的某些方面。因此，内感受功能障碍可能构成了几种衰老脑部疾病背后的共同原理。
我们的发现还表明，内感受功能障碍不仅是生命过程中发展的被动过程，而且还受到外周炎症微环境变化的主动影响。低度炎症是机体衰老的主要驱动因素，但在人群中显示出显著的异质性。金氏帕拉拟杆菌和MCFAs有可能通过本研究中描述的途径，作为众多炎症触发因素中的一个例子，来促成认知衰退，从而加剧这种异质性。这种环境敏感的迷走神经-海马体回路因此可能作为连接先前几个观察结果的共同下游元件，例如外周巨噬细胞在年龄相关认知衰退中的作用、饮食诱导的微生物组变化对记忆的影响、病毒感染后综合征的认知后遗症，以及肠促胰岛素激素的神经保护作用。
最后，尽管在大脑中髓系细胞和神经元之间的相互作用在认知衰退的背景下至关重要，但我们的数据表明，炎症过程不一定需要在中枢神经系统中发生才能影响认知功能。因此，外周组织（如胃肠道）中的局部炎症微环境可能足以触发感觉神经元功能障碍和认知后遗症，即使在血液或大脑中未检测到普遍增强的炎症反应也是如此。
在理解所提出的通路的细节方面仍存在几个主要挑战。首先，连接肠道和海马体的多突触通路仍然定义不清。先前的一份报告和我们的观察（扩展数据图4c,d）暗示内侧隔膜可能在脑干-海马体通信中发挥作用。其次，需要理解慢性外周炎症影响迷走神经活动的机制。迷走神经对IL-1β有反应，但慢性暴露于这种细胞因子如何改变迷走神经兴奋性尚不清楚。第三，导致内感受功能障碍的外周髓系细胞的类型和位置尚不清楚。最后，仍需确定这里在小鼠中描述的通路元素是否会导致人类年龄相关的认知衰退。迷走神经刺激已被报道可增强识别记忆、奖励动机和睡眠剥夺期间的认知表现，但需要评估以迷走神经为靶点的策略是否适合对抗年龄相关的认知衰退。
尽管存在这些未解决的问题，我们的发现强调了身体衍生信号在认知中的重要性，并突出了内感受系统对抗海马体功能和短期记忆年龄相关衰退的能力。内感受通路的药理学激活剂——我们称之为内感受模拟物——因此可能具有刺激大脑感觉输入以促进海马体记忆印迹形成的潜力。我们的发现要求系统探索可能的内感受模拟物及其对衰老大脑的影响。
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