摘要
虚弱是一种多因素老年综合征，与死亡率增加和不良健康结果相关，其肠道微生物组特征与健康老龄化所观察到的特征不同。我们在SUPERB队列（包含2,081名75-80岁瑞典女性）中分析了肠道宏基因组谱与虚弱严重程度估计值以及使用内部开发和验证的虚弱死亡指数(FMI)评估的虚弱相关临床结果之间的关系。FMI是一个综合指标，整合了与虚弱和死亡风险相关的功能、生理和心理维度，与SUPERB队列中的查尔森共病指数相比，显示出与死亡率更强的关联。FMI与微生物多样性、基因丰富度和预测功能能力呈逆相关，这些特征与身体功能、死亡率和跌倒相关伤害有关。共404种细菌物种与FMI显著相关，在包含1,448名老年人的中国队列中，大多数物种显示出一致的关联。本文展示了跨不同大陆与虚弱和死亡相关的微生物特征。
引言
虚弱是一种复杂的、多因素的老年相关综合征，其特征是生理储备减少和对不良健康结果的易感性增加，包括跌倒、住院、残疾和死亡。虽然常用工具如Fried虚弱表型、Rockwood虚弱指数和临床虚弱量表能够捕捉虚弱的特定方面，但现有指标通常无法涵盖其全部功能、心理和生理维度。查尔森共病指数(CCI)虽然广泛用于死亡风险分层，但以疾病为中心，对虚弱这一更广泛概念的敏感性不足。
为了更好地捕捉这一多维度特性，我们开发了虚弱死亡指数(FMI)，这是一个整合了人体测量学（年龄和体重）、身体功能（行走速度和椅立试验）、当前吸烟状况、心理健康生活质量(QoL)调查、住院持续时间以及CCI的综合测量指标。
肠道微生物组正日益被视为宿主生理的调节器和虚弱病理生理的潜在贡献者。它影响全身炎症、代谢、肌肉骨骼功能以及免疫和神经内分泌信号。衰老伴随着肠道微生物组的组成和功能变化，包括多样性减少、有益共生菌丧失以及促炎和机会性菌群的扩张，这些变化与少肌症、认知障碍和多病共存相关联。虽然衰老会改变肠道微生物组的组成和功能，但虚弱中观察到的微生物组特征与健康衰老不同，不仅反映了日历年龄，还反映了生理过程的恶化。
在本研究中，我们使用宏基因组测序调查了SUPERB大型瑞典队列（包含2,081名75-80岁女性）中与FMI捕获的虚弱相关表型相关的物种级特征。我们证明FMI与虚弱相关临床结果（包括伤害性跌倒、髋部骨折和死亡率）的关联比CCI更强。我们还表明，较高的FMI与微生物多样性减少、包括较低的基因丰富度和香农指数相关。在考虑与衰老相关的微生物基因丰富度整体下降的模型中，FMI与Enterocloster、Clostridium、Dysosmobacter和Faecalibacterium中的不同物种相关，从而区分了与FMI相关的微生物特征与一般微生物衰退。在中国老年人队列（1,448名62-96岁男女性）中，SUPERB中识别的几种物种级关联得到复现，证明了跨地理人群的一致性。
结果
虚弱死亡评估和研究人群
具有完整临床和宏基因组数据的参与者（n = 2,081）平均随访7.9年（四分位间距：7.1-8.6年）。我们在SUPERB队列（n = 3,028）中开发了虚弱死亡指数(FMI)，该队列由75-80岁社区居住女性组成。数据包括病史、人体测量学、身心健康评估以及伤害性跌倒、髋部骨折和死亡的发生情况，这些都是与虚弱及其结果相关的已知因素。FMI是从多变量生存模型中推导出来的，该模型使用与虚弱和死亡相关的因素和Cox比例风险模型，以死亡为随访7.9年的结果。
队列根据FMI评分分为四组，Q1代表无虚弱，Q2为轻度虚弱，Q3为中度虚弱，Q4为重度虚弱。当应用于具有完整宏基因组数据的分析子集（n = 2,081）时，较高的FMI评分与死亡、髋部骨折和跌倒相关伤害风险增加相关。与非虚弱组相比，重度FMI组的个体死亡风险高出5倍（风险比[HR] 5.05，95% CI 3.58-7.11，P < 0.001），伤害性跌倒风险更高（HR 1.63，95% CI 1.32-2.01，P < 0.001），髋部骨折风险高出两倍以上（HR 2.4，95% CI 1.54-3.75，P < 0.001）。随着FMI组的增加，观察到死亡率、髋部骨折和跌伤风险逐渐升高。基于Bootstrap的时间依赖AUC比较表明，FMI相比CCI具有更好的预测性能。
临床和功能特征在FMI组间的分布如表1所示。重度FMI组与年龄较大、当前吸烟率较高、CCI升高、身体功能较差相关，表现为握力降低、行走速度较慢、椅立试验次数减少，同时身体和心理健康生活质量评分（由12项短式健康调查问卷定义）也较低。此外，FMI严重程度的增加与全身炎症（通过全身炎症反应指数[SIRI]测量）显著相关，以及药物使用更为普遍，包括他汀类药物、质子泵抑制剂和二甲双胍。
FMI与微生物多样性之间的关联
研究人群的肠道微生物特征显示出FMI各组（无、轻度、中度、重度）在微生物组成、多样性和基因丰富度方面的显著差异。在基于物种级Aitchison差异的主坐标分析(PCoA)中，观察到四组FMI的肠道微生物组成明显聚类。第一主坐标解释了总组成方差的8.8%，显著区分了所有FMI组，而第二主坐标占方差的4.5%，进一步区分了中度和重度组（P < 0.001）与无FMI组，凸显了随着FMI增加微生物谱的渐进变化。
在多变量分析中，FMI解释了总肠道微生物组成变化的0.6%（R² = 0.006，P = 0.001，PERMANOVA，999次置换）。使用Bray-Curtis差异的敏感性分析确认了FMI组间微生物组成的显著差异（R² = 0.007，P = 0.001）。相比之下，BMI、药物使用、身体活动、吸烟、教育水平和CCI等所有其他测试因素各自解释的比例要小得多，CCI仅占变异的0.2%。肠道微生物衍生的第一主坐标与死亡风险和跌倒伤害相关。
Alpha多样性（通过香农指数确定）和基因丰富度（反映预测基因的总数）与FMI组显著相关，并随FMI组中虚弱程度增加而降低。我们检查了总体微生物多样性和功能丰富度是否与虚弱相关临床结果相关。较高的香农多样性和基因丰富度与跌倒伤害和死亡风险降低显著相关，而与髋部骨折无明显关联。这些发现表明，肠道微生物多样性和功能基因含量的减少可能反映了微生物组生态弹性的受损，并与虚弱相关不良事件的易感性相关。
与FMI、共病和药物使用相关的微生物分类变化
为了识别与FMI严重程度显著相关的细菌物种，我们进行了线性回归分析，使用主要模型，调整了年龄、BMI、教育水平、吸烟状况、饮酒、他汀类药物使用、质子泵抑制剂(PPI)和二甲双胍使用。基因丰富度调整模型还包括对基因丰富度的额外调整，以揭示与FMI特定相关的关联，而不是FMI组中观察到的多样性下降的次要影响。
在主要模型中，没有调整基因丰富度的情况下，404个物种在使用Bonferroni校正阈值（α = 0.05/2057；P < 2.43 × 10⁻⁵）进行多重测试校正后，与FMI显著相关，而额外调整基因丰富度后，63个物种显著相关。34个物种在调整基因丰富度前后均与FMI显著相关，包括Enterocloster属中的几个物种以及口腔细菌和病原体（例如Streptococcus mutans和Actinomyces oris）。29个物种（例如Massilistercora sp902406105、Dysosmobacter sp900770295、Acutalibacter timonensis、Anaerotruncus rubiinfantis和Roseburia sp003470905）仅在调整基因丰富度后才显示出显著关联，代表了与FMI的额外内在关联。
为了区分与虚弱相关的微生物特征和与共病负担和基线健康状态相关的特征，我们将微生物与FMI和CCI的关联进行了比较，并进行了额外的敏感性分析。在调整了年龄、BMI、教育、吸烟、饮酒、他汀类药物、质子泵抑制剂和二甲双胍使用的线性回归模型中，CCI在Bonferroni校正后与82个物种显著相关（P < 2.43 × 10⁻⁵）。其中80个物种与FMI相关物种重叠。
为进一步解决共病的潜在混杂，我们进行了补充敏感性分析。在此共病调整模型中，我们额外控制了基线疾病，包括类风湿关节炎、痴呆、缺血性心脏病、心力衰竭、脑血管疾病、慢性肺病、肝病、糖尿病、肾衰竭、偏瘫或截瘫、消化性溃疡病、实体非转移性肿瘤、淋巴瘤或白血病、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进和营养不良。调整后，所有FMI相关物种仍然显著。
除了在所有模型中将药物使用作为协变量外，我们还按PPI、他汀类药物和二甲双胍使用进行了分层分析（使用者vs.非使用者）。FMI-微生物组关联在药物分层中显示出接近完全的方向一致性（>98.5%），他汀类药物使用者中有77%、PPI使用者中有59.4%、二甲双胍使用者中有18.6%的关联仍然显著。在PPI和他汀类药物使用者中，显著关联的数量超过了置换分析中预期的随机数量，而在二甲双胍使用者中则较少，后者的样本量最小（n = 101）。这可能反映了较小亚组中统计功效的降低，特别是二甲双胍使用者（n = 101；PPI使用者n = 285；他汀类药物使用者n = 519），以及药物组中较高的FMI水平，表明虚弱严重程度更高。
FMI相关微生物组与临床结果
最显著且与FMI呈正相关的、流行率≥15%的物种包括Enterocloster spp.、Clostridium Q symbiosum、Clostridium A scindens、Erysipelatoclostridium ramosum和Eggerthella lenta。值得注意的是，其中几个物种与FMI和虚弱相关参数显示出强烈的正相关性，并与身体和心理功能降低以及伤害性跌倒和死亡风险增加相关。
流行率≥15%的最显著且与FMI呈负相关的物种包括许多未表征的宏基因组组装基因组(MAGs)和潜在的丁酸产生菌，如Faecalibacterium prausnitzii的I和H亚群以及Faecalibacterium sp900539945，以及Dysosmobacter sp900544615和Agathobaculum sp003481705。这些物种与更好的身体和心理功能以及生存率提高相关。
微生物物种与临床或生物化学参数的关联总结在补充图4中，突出了与虚弱相关的类群与宿主表型之间的一致模式。与FMI正相关的物种通常与身体活动呈负相关，与SIRI、年龄和药物使用呈正相关。相比之下，与FMI负相关的物种往往与身体活动呈正相关，与SIRI、年龄和药物使用呈负相关。
肠道微生物组代谢潜力、FMI和临床结果
为了调查与FMI相关的肠道微生物组代谢潜力并进一步表征物种级关联，我们量化了肠道代谢模块(GMMs)，代表了人类肠道微生物组中手动整理的代谢途径，并评估了它们与FMI的关联。
与FMI（无vs.重度）最强烈且正相关的GMMs包括参与氨基酸降解的途径，特别是谷氨酰胺、谷氨酸和精氨酸，以及核糖分解代谢、乳酸代谢和丙酸产生、三甲胺/三甲胺-N-氧化物代谢，以及包括硝酸盐还原的厌氧呼吸（图5a和补充数据9）。相反，与FMI最强烈且呈逆相关的GMMs包括来自二氧化碳的产甲烷作用、三酰甘油降解、半胱氨酸生物合成/同型半胱氨酸降解、果胶降解、乙酸产生和丁酸产生II，对应于丁酰辅酶A辅酶A转移酶途径和but末端基因（图5a）。其中几个模块也与死亡率和伤害性跌倒相关（图5a和补充数据9）。所有与FMI（无vs.重度）显著相关的GMMs在调整基因丰富度后仍然显著。
为了跟进物种谱和GMMs与FMI的关联，我们接下来量化了从碳水化合物（but和buk）和蛋白质（atoA/D和4hbt）产生丁酸的末端基因的相对丰度。分析显示，随着FMI严重程度的增加，but丰度显著下降，而与无虚弱相比，重度组中atoA/D增加（图5b）。几种与FMI正相关的物种，如Enterocloster spp.、Blautia spp.、Sellimonas intestinalis、Hungatella effluvii和Eggerthella lenta，与预测的总丁酸产生能力和/或but丰度呈负相关，而与FMI负相关的物种，如F. prausnitzii、Anaerosacchariphilus sp900553635、Dysosmobacter sp900544615和几个MAGs，与but途径或预测的总丁酸产生能力呈正相关。
然而，Cox比例风险模型显示，丁酸产生途径本身与死亡率、髋部骨折或跌倒伤害风险之间没有显著关联（图5c和补充数据12）。这些结果表明，除丁酸产生能力外的特征可能有助于观察到的与低虚弱的相关性，可能包括其他功能特性，如抗炎和免疫调节功能。
探索性FMI和死亡率的机器学习分析
为了捕捉微生物类群、临床特征和虚弱相关结果之间复杂的非线性关联，我们实施了XGBoost机器学习模型，以探索与FMI和全因死亡风险的关联。从完整数据集中选择与FMI最相关的前60个类群作为候选微生物特征。这些特征与临床特征（包括年龄、BMI、教育水平、吸烟、饮酒、药物使用和基因丰富度）结合。这些定性分析使我们能够对特征进行数据驱动的优先排序，揭示每个结果的特定微生物特征和临床贡献者。特征重要性分析的定性评估显示，对FMI最重要的类群包括F. prausnitzii亚群I、Faecalibacterium sp900539945和sp900539885、Clostridium AP scindens、S. intestinalis、Massilioclostridium methylpentosum和Mediterraneibacter torques。值得注意的是，其中几种微生物物种显示出与微生物组基因丰富度和临床预测因子（如BMI和药物）相当的重要性。使用SHAP值（Shapley Additive Explanation values）来解释XGBoost模型中每个特征的内部贡献。特定于死亡率的XGBoost模型识别出几种也与FMI相关的类群（例如Faecalibacterium sp900539885和sp900539945、M. methylpentosum和M. torques），以及常规预测因子，如年龄、BMI、吸烟和微生物组基因丰富度。这些结果表明与FMI和死亡率相关的部分重叠的微生物特征。
中国老年人队列中的物种级一致性
为了验证FMI的效用及其与肠道微生物物种的关联，我们寻求在独立队列中复现我们的发现。在SUPERB队列中与FMI相关的物种在中国老年人队列中针对身体功能参数和死亡率进行了测试。在与FMI最显著相关的前5%物种中，11个物种（55%）在中国队列中显示出同方向的显著关联。总体而言，52.3%的所有FMI相关物种显示出与至少一个身体功能测量值和/或死亡率的一致关联。
在两个队列中与身体功能呈显著负相关的物种包括Enterocloster spp.（即E. bolteae、E. aldenensis和E. clostridioformis），而呈正相关的物种均为未表征的，包括Faecalibacterium sp900539945和sp900539885、Agathobaculum sp003481705和Lawsonibacter sp900549405，以及其他在属水平上分类未知的MAGs（例如CAG95 sp000438155和UBA9502 sp003480315）。E. aldenensis以及E. lavalensis和Clostridium Q symbiosum在中国队列中也与死亡率显著相关。
讨论
虚弱是一种多维度的衰老综合征，不能被传统的基于共病的指数完全捕捉。为了更好地识别SUPERB队列中与相关虚弱死亡风险相关的肠道微生物组物种，我们开发并内部验证了虚弱死亡指数(FMI)，这是一个源自临床、功能和生活方式参数的综合测量指标，反映了生理储备、身体表现和对不良结果的易感性。
FMI在概念上与Rockwood虚弱指数和Fried表型重叠，但范围和目的不同：FMI不是用作临床评估工具，而是将年龄、吸烟状况、体重、共病、表现基测量（例如行走速度、椅立试验）、心理健康和先前住院整合成一个单一的、源自死亡关联的加权指数。FMI显示出比CCI更强的与死亡率、髋部骨折和跌倒相关伤害的关联，并解释了更大比例的肠道微生物组变异（0.6% vs. 0.2%），表明它可能捕捉到与宿主-微生物组相互作用相关的额外生理维度。FMI与微生物多样性、基因丰富度和改变的分类和功能组成密切相关。
我们的分析不仅识别出虚弱和死亡的既定临床预测因子，还识别出与这些结果独立相关的肠道微生物物种级特征，并不仅仅是共病负担的反映。几个最显著相关的物种在中国老年成年人的独立队列中显示出一致的模式，支持了与衰老、功能下降和生存相关的物种级关联。
随着虚弱严重程度增加，物种多样性下降和功能基因丰富度减少与先前研究表明减少的微生物多样性是衰老人群中健康恶化和生态失调的标志相一致。这种减少可能反映了肠道微生物组生态平衡的破坏，导致对病原体的抵抗力降低和代谢能力受损。
先前的研究报告说，健康老龄化的特点是核心类群逐渐丧失和微生物独特性增加，而虚弱与关键共生菌的耗竭以及促炎、机会性和兼性厌氧细菌的富集相关。在我们的研究中，较低的基因丰富度（微生物功能潜力的代理）与死亡率和伤害性跌倒风险显著增加相关。通过在敏感性分析中将基因丰富度作为协变量，我们识别出专门与虚弱相关的类群，超越了一般微生物衰退，这是先前研究中未考虑的。
在SUPERB队列中，即使调整基因丰富度后，与虚弱和死亡最强烈的微生物预测因子包括已知的机会性病原体Enterocloster物种和口腔兼性厌氧菌S. mutans。粪便样本中口腔类群的存在先前已与共生肠道细菌的耗竭和不良患者结果相关。它们在控制基因丰富度后的持续存在表明，它们的富集可能反映了FMI捕获的虚弱相关过程，如屏障功能障碍或炎症。Clostridium Q symbiosum的丰度与SUPERB队列中的虚弱相关，也与SUPERB和中国老年人队列中的死亡率相关，并且在先前研究中与不健康老龄化相关。
Enterocloster物种E. bolteae、E. aldenensis和E. lavalensis也与不良结果相关，并在中国老年人复现队列中得到确认，这在先前研究中也有报道。此外，其他FMI相关物种如E. citroniae、E. clostridioformis、E. asparagiformis、C. innocuum、E. lenta、Ruminococcus gnavus和Flavonifractor plautii也被先前确定为不健康老龄化的标志。这些物种在肠道屏障受损时已知会引起感染，并与抗生素耐药性相关。此外，与FMI相关的类群与预测的丁酸产生能力相关。由于丁酸促进定植抗性、支持调节性T细胞功能并抑制炎症，其减少可能削弱宿主防御并允许这些机会性物种的扩张，表明预测的微生物代谢能力与虚弱相关表型之间存在关联。
肠道微生物组代谢潜力的分析与FMI相关的物种级谱型一致。在严重虚弱个体中富集的GMMs包括与氨基酸降解、乳酸代谢和丙酸产生、三甲胺/三甲胺-N-氧化物代谢以及厌氧呼吸相关的途径，与FMI正相关的物种中富集的口腔、机会性和兼性厌氧类群一致，与向蛋白质发酵和应激适应代谢的转变相容。其中几个预测功能与包括死亡率和伤害性跌倒在内的不良临床结果相关，表明微生物组代谢功能可能反映了虚弱相关的易感性。
与FMI呈逆相关的GMMs捕捉到与肠道和代谢健康相关的预测功能，包括来自二氧化碳的产甲烷作用、三酰甘油降解、果胶降解、半胱氨酸生物合成/同型半胱氨酸降解，以及乙酸和丁酸产生。丁酸产生末端基因的量化显示，在严重虚弱个体中，but基因呈阶梯式下降，而蛋白质衍生的丁酸途径（atoA/D）增加，与GMM谱显示的氨基酸代谢增加一致。
F. prausnitzii和未表征的Faecalibacterium MAGs是与FMI负相关最强的类群之一，并且在中国老年人队列中也与更好的身体功能相关。这些结果与先前发现一致，并与F. prausnitzii作为人类肠道中主要的but含丁酸产生菌的已确定作用一致。同样，Dysosmobacter sp900542115的丰度也与丁酸产生潜力和较低的FMI严重程度相关。Dysosmobacter welbionis是该属的模式种，是一种丁酸产生菌，在超重个体中与BMI、空腹血糖和糖化血红蛋白呈负相关，并在小鼠中对肥胖、胰岛素抵抗和脂肪组织炎症具有保护作用。
虽然这些结果支持丁酸产生细菌的作用，但丁酸产生潜力本身与虚弱相关临床结果无显著关联。F. prausnitzii和其他肠道细菌的抗炎特性可能特别相关，特别是考虑到随着FMI评分增加观察到的全身炎症（通过SIRI测量）的增加。然而，我们的宏基因组功能分析仅限于代谢潜力，未来研究需要阐明细菌抗炎活性在虚弱和老龄化中的作用。
我们还识别出在调整基因丰富度后唯一与FMI相关的类群，如Dysosmobacter sp900770295和Massilistercora sp902406105，这些可能在先前未考虑一般微生物组耗竭的分析中被忽视。虽然这些类群的功能作用尚不清楚，但它们可能代表了在改变的微生物组组成条件下有利的微生物。
与虚弱和死亡率呈负相关的已知和未表征类群的识别加强了虚弱相关生态失调的已知模式，其特征是共生菌的丧失和炎症相关类群的富集，并强调了未来研究的候选者，以延迟或减轻老年人功能下降。
我们的发现与最近的研究一致，表明衰老和虚弱伴随着肠道微生物组生态失调，其特征是有益的短链脂肪酸产生共生菌的丧失以及促炎和机会性细菌的富集。Pu等人报告了虚弱个体中多样性减少和显著的微生物变化，识别出162种与虚弱相关的物种。我们的结果与肠道微生物组组成影响全身炎症、身体和认知功能的证据一致，这些是虚弱的关键组成部分。
与FMI在我们的队列中相关的许多类群已在多个独立研究中与虚弱和不健康老龄化一致关联，并在中国队列中显示出与身体功能和/或死亡率的一致关联，支持我们的发现跨大陆的稳健性。此外，我们的分析通过独立于共病、药物使用和基因丰富度评估这些关联，扩展了先前的工作。
尽管我们的研究有优势，但也应承认几个局限性。分析的横断面性质排除了因果推断，难以确定肠道微生物变化是否先于虚弱发作或仅仅是与衰老相关的生理衰退的结果。此外，由于SUPERB队列中的数据限制，我们无法将FMI与Fried虚弱表型或Rockwood虚弱指数进行比较。
噬菌体和古菌群落未被评估，无法评价它们对虚弱相关生态失调的潜在贡献。代谢推断是从微生物基因模块谱派生的，而不是直接的代谢组学测量。因此，SCFA、氨基酸和脂质代谢的预测改变反映了潜在的功能能力，而不是测量的代谢物浓度。我们的分析在物种水平上进行，不捕获种系水平的异质性，这在地理上不同的队列中可能特别相关。
由于同一物种内的菌株可能在基因含量和功能上有所不同，本研究中报告的关联不应被解释为反映跨人群的共享功能谱系。尽管我们在使用协调的生物信息学框架的独立分析的中国队列中观察到一致的物种级关联，但缺乏种系解析分析限制了机制解释，这将在未来研究中解决。
另一个局限性是复现队列中死亡率结果的统计功效较低（n = 99），这可能减少了显著复现的物种数量。发现队列仅由来自瑞典的老年女性组成，但大多数排名靠前的物种在中国老年人队列中（包括男性和女性（女性54%），年龄范围62-96岁）与身体功能和/或死亡率一致相关。
一个额外的局限性是缺乏关于饮食摄入的数据，这已知会影响肠道微生物组。未来纳入更多样化队列和外部复现数据集的纵向研究对于验证这些发现和评估微生物组虚弱生物标志物的更广泛应用至关重要。
总之，FMI整合了与SUPERB队列中死亡风险相关的加权临床、功能和心理社会成分。使用FMI，我们识别出与FMI严重程度、虚弱相关不良临床结果和死亡率相关的肠道微生物物种级特征。转化为疗法将需要进一步的种系水平研究、特定细菌类群的分离以及鉴定与宿主相互作用并涉及虚弱相关过程的微生物功能。
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