【摘要】重新激活心脏损伤后的人类心外膜对于心脏组织再生具有重要意义。尽管当前分化方案可从诱导多能干细胞（iPSCs）生成高纯度、自我更新的心外膜细胞，但这些细胞仍处于胚胎状态，阻碍了对成体心外膜重新激活的研究。本文介绍了一种优化方法，通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，使胚胎心外膜进入静止状态，从而促进多层次心外膜成熟。该方法生成了功能成熟的心外膜，可用于模拟成体心外膜重新激活。此外，我们还评估了包含心肌细胞和成熟心外膜的心脏类器官，探索了心外膜静止背后的分子机制。研究结果表明，iPSC衍生的成熟心外膜在研究成体心外膜重新激活方面具有潜力，这对于有效的心脏再生至关重要。此外，心脏类器官模型深入解析了心肌细胞与心外膜之间的复杂相互作用及其在心脏发育和再生中的意义。
【引言】人类心外膜是心脏最外层的结构，在心脏发育和再生中起着至关重要的作用。在胚胎发育过程中，心外膜会分化出多种类型的细胞前体，包括血管平滑肌细胞和成纤维细胞。研究表明，小鼠出生后的最初几天以及胚胎发育阶段，心外膜细胞具有再生能力，但这种能力在出生后逐渐丧失。尽管大多数研究都关注定义成熟心外膜的转录组特征，但普遍认为健康状态下成体心外膜是一种低迁移性和低再生能力的静止组织。
为了更深入地理解心外膜成熟过程，我们设计了一种方法，利用雷帕霉素靶点（mTOR）信号抑制来引导胚胎心外膜进入静止状态，从而实现多层次的成熟。我们的研究表明，这种方法能够生成功能成熟的心外膜，为研究成体心外膜重新激活提供了重要平台。同时，心脏类器官模型进一步揭示了心肌细胞与心外膜之间复杂的交互作用，为探讨心脏再生和衰老过程中的分子机制奠定了基础。
【结果】mTOR信号通路活性下降伴随生理心脏成熟。通过对小鼠心脏发育过程中的转录组数据分析，我们发现mTOR信号在E12.5之后逐步失活。这一变化伴随着关键下游靶点如pAKT、pS6K和p4E-BP1的表达减少，表明mTOR信号减弱可能与心脏成熟密切相关。此外，出生后一周（P7），细胞周期抑制因子p27显著上调，提示细胞进入静止状态以获得成体功能。
在体外实验中，我们使用mTOR激酶抑制剂Torin1处理胚胎期第12天（E12）的小鼠心脏，结果显示WT1蛋白表达显著降低，而心肌特异性标志物TNNI3表达增加，表明心外膜和心肌均加速向成熟状态转变。通过RNA测序分析，我们进一步验证了Torin1处理后的心外膜在转录组水平上与成体心外膜更为接近。
在hiPSC衍生的心外膜细胞中，双抑制mTORC1/2显著增强了心外膜静止和成熟。我们系统性地将hiPSC分化为心外膜样细胞，并通过化学条件维持其特性。随后采用Torin1处理7天，观察到WT1和其他胚胎标志物的表达大幅下降，同时出现间充质-上皮转化（EMT）能力受损的现象。这些结果表明，mTOR信号全面抑制可以推动心外膜向静止和成熟状态过渡。
为了验证该平台的应用价值，我们进行了高通量筛选（HTS），测试了约1600种生物活性化合物对hiPSC衍生成熟心外膜的再激活效果。结果显示GSK3α/β抑制剂作为活性化合物，可重新激活心外膜增殖。这为开发针对特定细胞类型的心脏再生疗法提供了新的靶点。
【讨论】本研究揭示了mTOR信号在心外膜成熟中的核心作用，并提出了通过药理学手段调控mTOR信号来促进心外膜静止和成熟的方法。尽管WT1和C3等基因的表达变化与以往研究存在一定差异，但我们的蛋白质水平数据更准确地反映了心外膜成熟过程中的动态变化。未来工作需进一步探索其他潜在调控因子，例如RELB、MAFG和HIVEP2，以及它们如何影响心外膜成熟。
此外，虽然mTOR完全抑制能够增强hiPSC衍生心外膜的功能成熟，但这种方法仅部分再现了成体心脏表型，因此需要结合其他策略来实现更全面的成熟。本研究未正式表征共培养条件下TNNI3表达的心肌细胞成熟表型，因此观察到的TNNI3表达增加并不一定意味着功能改善，例如钙处理或电生理性质的提升。
【结论】综上所述，本研究通过药理学方法成功实现了hiPSC衍生心外膜的成熟，为建立研究成体心外膜重新激活的平台奠定了基础，有助于深入理解其在再生反应中的基本作用。此方法不仅为心脏疾病治疗提供了新思路，还为研究心脏再生、衰老及迟发性心血管疾病的复杂机制提供了宝贵的细胞模型。
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