癌症干细胞（CSCs）在结直肠癌（CRC）的化疗耐药性、复发和转移中起着关键作用。因此，识别调控肿瘤生长的关键分子靶点对于有效治疗至关重要。在此背景下，我们进行了广泛的体外和体内分子与功能研究，揭示了赖氨酸甲基转移酶SET和MYND结构域包含3（SMYD3）在结直肠癌干细胞（CRC-SC）生物学中的核心作用。具体而言，我们的研究表明，SMYD3在K158和K163位点上与c-MYC相互作用并对其进行甲基化修饰，从而调节其转录活性，这与干性和结直肠恶性肿瘤密切相关。体外数据表明，SMYD3的药物抑制或其稳定的基因敲除会影响患者来源的CRC-SCs和类器官的克隆形成和自我更新能力，并改变其分子特征。此外，我们发现SMYD3的稳定敲除或药物抑制显著减少了CRC的致瘤性和CRC-SC的转移潜力。总体而言，这些研究结果将SMYD3确定为直接作用于c-MYC的有前景的治疗靶点，可能对抑制CRC-SC的增殖和转移扩散具有重要意义。
SMYD3在干细胞相关过程中的功能分析
为了深入研究SMYD3在CRC干性相关过程中的功能，我们基于UniProt条目和现有文献鉴定了64个P蛋白，并将其聚类到发育和干细胞生物学途径中（补充图1a，补充表1）。有趣的是，这一聚类包括Takahashi和Yamanaka最初鉴定出的24个候选因子中的7个（c-MYC、SOX2、SOX15、STAT3、GDF3、FTHL17和FBXO15），这些因子能够诱导体细胞的多能性。我们对这64个P蛋白的功能聚类分析还基于Reactome数据库中描述的相关途径（补充表1）。这使我们能够专注于主要的癌症效应因子，尤其是c-MYC，它在CSC特征和CRC肿瘤发生中都起着关键作用。越来越多的证据表明，受损的c-MYC功能可能影响CSC干性维持、CSC相关肿瘤的转移以及对治疗的抗性。
为了验证我们的计算机筛选结果，我们进行了体外结合实验，分析全长HIS标记的SMYD3重组蛋白与未标记的c-MYC重组蛋白之间的相互作用。结果显示，c-MYC与SMYD3相互作用（图1a）。GST-HSP90 C端（616–736）用作阳性对照，这是基于Brown及其同事的先前报告。
随后，我们探讨了EM127对c-MYC依赖性转录的影响。结果表明，使用EM127处理患者来源的CRC-SCs会触发c-MYC靶基因的下调，包括CD44、SOX9、KLF4、NANOG、OCT4、SOX2和CCND1（CSC标志物）（图3c）。这些数据促使我们进一步研究SMYD3/c-MYC复合物在转录调控中的功能作用。为此，我们在患者来源的CRC-SCs中通过染色质免疫沉淀（ChIP）评估了SMYD3对c-MYC靶基因启动子区域的招募情况。ChIP实验显示，SMYD3与c-MYC一起被招募到多个c-MYC靶标的Wnt响应元件（WREs）中，这些靶标包括CD44、SOX9、KLF4、NANOG、OCT4、SOX2和CCND1，所有这些都与CRC干性特征和肿瘤进展有关。进一步表征这些区域显示了组蛋白H3上赖氨酸27（H3K27Ac）的乙酰化，这是活跃增强子的典型表观遗传修饰。此外，我们发现EM127处理减少了SMYD3和c-MYC在分析的WREs上的占据情况。这表明SMYD3作为c-MYC的共调节因子，促进这些细胞中其靶基因的转录。
SMYD3/c-MYC轴在患者来源的CRC-SCs中的癌症干性和其他癌症特征中的作用
为了更深入了解患者来源的CRC-SCs的分子特征，我们进行了RNA测序分析。所有患者的临床功能数据列于补充表4中。我们分析了来自7名SMYD3过表达（高-SMYD3）和7名未过表达SMYD3（低-SMYD3）CRC患者的CRC-SCs的基因表达模式。有趣的是，我们发现5/7名SMYD3过表达的CRC患者属于共识分子亚型4（CMS4），由于其表现为间充质表型并具有激活基质的基因特征，CMS4被认为是预后最差的亚型。此外，CMS4 CRC常常在晚期诊断，预后较差，任何分子亚型中的5年总生存率（62%）和无复发生存率（60%）最低。
总的来说，这些发现表明抑制SMYD3会导致由c-MYC驱动的致癌基因表达程序的抑制。
针对患者来源的CRC-SCs中的SMYD3以规避c-MYC介导的5-FU化疗耐药性
先前的报告表明，c-MYC调控癌症干性基因的转录并促进化疗耐药性，尤其是对5-氟尿嘧啶（5-FU）的耐药性。我们之前对SMYD3在介导癌细胞对化疗药物敏感性方面的功能进行了广泛表征。受这些数据的启发，我们在涉及5-FU的组合策略中研究了EM127作为化学耐药患者来源的CRC-SCs中敏化剂的潜力。为此，我们将患者来源的CRC-SCs预先用EM127处理48小时，随后再用5-FU处理24小时。我们的结果表明，这种联合治疗具有非线性的累积效应，比单独使用5-FU更为有效。具体来说，EM127预处理显著减少了CRC-SC的增殖指数，并同时增加了细胞死亡。这些发现支持了抑制SMYD3以增强CRC中5-FU敏感性的潜力。此外，我们发现EM127与5-FU联合治疗显著降低了CRC-SC的迁移能力。我们通过流式细胞术进一步研究了EM127和5-FU联合治疗对患者来源的CRC-SC命运的生物影响。Ki67检测显示EM127增强了5-FU的生长抑制活性，这一效应伴随着凋亡细胞死亡的增加。
体内实验表明，EM127无论是单独使用还是与5-FU联合使用，都可能是CRC肿瘤体积减小的有效治疗方法，因为它具有持久的治疗效果和良好的安全性特征，值得进一步研究以充分探索其临床潜力。综合上述所有数据表明，SMYD3的药物抑制可能作为单药治疗和与5-FU联合治疗CRC患者的有效方法。
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