细胞老化血浆蛋白质组学特征可预测人类疾病Plasma proteomic signatures of cellular aging predict human disease | Nature Medicine

摘要

老化在细胞和器官之间是不同步的。在此，我们测试了血浆蛋白质组学是否可用于分析细胞类型特异性的老化。通过对60,542名个体中测量的7,000多种血浆蛋白质进行分析，我们开发了机器学习模型来估计超过40种细胞类型的生物年龄，这些细胞类型涵盖神经元、免疫、胶质、内分泌、上皮和肌肉骨骼来源。我们发现20-25%的个体在单一细胞类型上表现出加速老化，1-3%的个体在10种或更多细胞类型上表现出加速老化。细胞老化特征与疾病状态相关，并能预测15年随访期内的发病和死亡风险。携带APOE4基因型的个体与APOE3携带者相比，表现出较老的星形胶质细胞但较年轻的巨噬细胞，而APOE2基因型则表现出相反的关联。此外，与携带两个APOE4等位基因的年轻星形胶质细胞个体相比，星形胶质细胞极度老化的个体患阿尔茨海默病的风险增加了三倍。与年轻骨骼肌细胞个体相比，骨骼肌细胞极度老化的个体患肌萎缩侧索硬化症的风险高出12.7倍。在吸烟者中，与仅吸烟相比，极度老化的呼吸道上皮细胞使肺癌风险增加了58%。特定细胞的易损性和累积的细胞老化负担影响生存，年轻的免疫和神经细胞类型具有保护作用。最后，我们开发了一个多细胞老化风险评分，可在不同队列和蛋白质组学平台中对死亡风险进行分层。这些发现建立了一个量化人类生理学细胞分辨率的框架，揭示了异质性老化轨迹及其对疾病易感性和弹性的影

主体

全球疾病负担的50%以上可归因于老化[1]。神经退行性疾病、癌症和慢性疾病的发病风险随年龄急剧增加[2,3,4]。尽管老化本身是疾病易感性的主要驱动因素，但老化本身仍未被充分理解，因此量化其生物学特性对于改善预防和治疗是一个重要的优先事项。

最近利用称为老化时钟的机器学习模型的研究表明，生物老化在个体内部和个体之间存在差异。包括表观遗传[5]、蛋白质组学[6]、转录组学[7]、多组学[8]和基于磁共振成像的老化时钟[9]在内的器官特异性生物年龄估计器表明，分子变化在寿命期间在不同器官之间异步发生。新兴的血浆蛋白质组学老化时钟为器官的老化状态提供了一个非侵入性窗口，并表明生物年龄较大的器官使个体易患器官特异性疾病，而较年轻的轮廓则与韧性相关[10,11]。此外，转录组学[12,13]和表观遗传[14]老化时钟将这些观察结果扩展到细胞分辨率，揭示了不同细胞类型之间的异质老化模式。虽然这些方法很有启发性，但它们需要收获的组织或动物模型，限制了其可扩展性和转化相关性。

在这项研究中，我们使用来自三个独立队列中60,542名个体的3,000多种蛋白质的血浆测量值对细胞老化进行了全面分析（图1a）。我们将血浆蛋白质映射到其假定的细胞起源，并构建了计算模型来测量40多种细胞类型的生物年龄。为了评估临床相关性，我们将年龄加速量化为年龄差距，并评估了与疾病和死亡率的关联。

血浆蛋白质丰度已知会以器官特异性方式随年龄变化，但是否存在类似的细胞水平模式尚不清楚。利用人类蛋白质图谱中的单细胞转录组数据（方法和扩展数据图1），我们将60种细胞类型与其相应的血浆蛋白质相关联。根据先前研究的指导[10,11,15]，如果一个基因在一个细胞类型中的表达量至少比任何其他细胞类型高两倍，我们将其分类为细胞类型特异性。使用此标准，我们发现可测量血浆蛋白质的16.5%（SomaScan检测中的1,202种中的7,289种）和Olink检测中24.2%（2,923种中的708种）映射到特定细胞类型（补充表1和2）。虽然两倍富集阈值可能看起来宽松，但许多映射到细胞类型的蛋白质具有明显超过此标准的倍数变化，支持细胞类型具有独特特征这一前提，这些特征可在血浆中检测到（方法和扩展数据图2）。我们在全球神经退行性疾病蛋白质组学联盟（GNPC）中观察到不同细胞类型之间明显的年龄相关血浆蛋白质表达模式，这是一个包含多个亚队列的大规模国际神经退行性疾病血浆蛋白质组学资源[16]（图1b和补充表3）。

基于这些观察，我们对血浆蛋白质表达模式进行了无监督层次聚类，以识别年龄相关变化同步发生的蛋白质组。我们确定了33个簇，大小从6到1,011种蛋白质不等，这些蛋白质随时间增加、减少或保持稳定（扩展数据图3）。这些簇显示出对细胞类型和生物通路的显著且可解释的富集，涵盖肝细胞和凝血调节（簇10，调整后P = 8.32×10^-6；补充表4），到B细胞、少突胶质前体细胞和神经系统发育（簇12，调整后P = 2.49×10^-10；补充表4）。有趣的是，我们发现共享谱系的细胞在同一簇中共存（例如内胚层来源的纤毛细胞、腺细胞和管腔细胞或中胚层来源的间皮细胞和骨骼肌细胞）；这一发现可能反映了寿命期间的发育转变和协调的基因表达程序[17,18]。通过使用自助重采样进行轨迹聚类的敏感性分析，评估了簇的稳定性（补充图1），表明我们的结果是稳健的。

这些观察支持我们的核心假设，即细胞类型以不同速率老化，其老化轨迹可以通过血浆蛋白质丰度的变化来捕获。接下来，我们通过训练机器学习模型来预测基于细胞类型特异性蛋白质的血浆丰度的时间年龄，为不同细胞类型建立了群体生物老化模型（方法）。为了证明稳健性和可推广性，我们为两种血浆蛋白质组学平台——SomaScan（测量7,289种蛋白质）和Olink（测量2,923种蛋白质）——开发了细胞老化时钟，并在三个独立队列中应用了这些模型：GNPC（n = 14,281，SomaScan）、1946年国家卫生与发展调查（NSHD；n = 1,803，SomaScan）和英国生物银行（UKB；n = 44,458，Olink）。

对于SomaScan平台，模型是在GNPC中最大的特征明确的健康队列——Knight阿尔茨海默病研究中心（KADRC）队列的健康个体生成的血浆蛋白质数据上训练的。SomaScan模型应用于更广泛的GNPC队列进行疾病关联分析，并应用于NSHD队列进行外部验证。我们为60多种不同细胞类型生成了老化模型，经过性能质量评估后，保留了43个模型用于下游分析（方法；有关跨蛋白质组学平台保留模型的列表，请参阅补充表5-7）。KADRC队列中的模型性能如图1c和补充图2所示。

使用类似的方法，使用UKB队列的Olink血浆蛋白质组学（训练子集n = 21,983）构建了细胞老化模型，并应用于UKB中的保留测试集（n = 22,475）。鉴于Olink平台测量的蛋白质较少，因此细胞类型特异性特征也较少，我们还整合了14个谱系水平的细胞类型模型，这些模型聚合了系统发育相关的细胞类型（例如，淋巴谱系结合B细胞、T细胞、NK细胞和浆细胞），以捕获跨平台的老化特征并在不同粒度水平上了解细胞老化（补充表5、补充图3和方法）。经过性能质量评估（方法）后，保留了48个Olink细胞老化模型用于下游分析。所得模型由唯一映射到每个细胞类型的血浆蛋白质组成（补充图2和补充表5-7）。

对于每个细胞类型和个体，我们计算了"年龄差距"，定义为个体预测的细胞类型特异性生物年龄与相同时间年龄的平均个体模型预测生物年龄之间的残差。正的年龄差距表示加速老化，而负差距表示相对生物年轻。年龄差距按每个老化模型进行z评分，以便跨细胞类型进行比较。对于每种细胞类型，根据其z评分的年龄差距对个体进行分类，其中极端老化和年轻老化分别定义为z评分年龄差距>2和<-2[11]。

为了描述规范的细胞类型生物老化模式，我们将SomaScan细胞老化模型应用于GNPC队列中的7,074名健康个体，并在五个时间年龄窗口中可视化极端老化者的分布（图2a）。值得注意的是，神经元和胶质细胞类型——包括施万细胞、抑制性和兴奋性神经元——在生命后期显示出较高的年龄差距，超过85岁年龄组中有7.1%、6.6%和6.4%的个体被归类为极端老化者。相比之下，肠杯状细胞和纤毛细胞在年轻时就表现出老化加速，在60岁以下的个体中有4.9%和4.2%受到影响。我们假设独特时间年龄窗口中细胞特异性生物极端老化者的流行可能反映了细胞易损性和疾病发病时间。虽然随着年龄增长，神经元和施万细胞的老化加速可能与认知障碍和感觉感知丧失有关，但年轻个体中杯状细胞和纤毛细胞的加速老化可能指向中年期间肠道通透性增加和室管膜纤毛屏障完整性降低[19,20,21]。

在GNPC队列的所有健康个体中，我们发现35.4%没有极端细胞年龄差距，24.4%在单一细胞类型上表现出加速老化，而1.5%的人群在10种或更多细胞类型上经历广泛加速。对于研究的每种细胞类型，我们发现0.9-3.8%的人群具有极度老化的细胞，0.7-3.2%具有极度年轻的细胞（扩展数据图4a）。同样，在UKB中，26.1%显示没有极端细胞年龄差距，22.7%在单一细胞类型上表现出加速老化，2.8%在10种或更多细胞类型上表现出广泛加速，每种细胞类型有1.9-4.1%显示极端加速和0.7-2.5%显示极度年轻的细胞（扩展数据图4b）。

值得注意的是，细胞年龄差距在UKB队列中表现出与可修改风险因素的关联。在同时吸烟和肥胖的个体中（n = 1,046），我们在多种细胞类型中观察到生物年龄的广泛增加，而具有健康生活方式的个体（n = 1,044）定义为从不吸烟、不饮酒、身体质量指数（BMI）低于25且没有扩大的腰围、充足的睡眠（≥7小时/晚）和规律锻炼（≥5天/周），显示出整体更年轻的细胞年龄（图2b）。

我们在UKB队列中对遗传影响的分析表明，特定基因型会加速某些细胞类型的衰老，同时保护其他细胞类型（图2c）。APOE基因型，作为神经退行性疾病的主要风险因素，显示了对免疫与中枢神经系统细胞老化的剂量依赖性、拮抗性影响：APOE2携带者表现出显著更年轻的星形胶质细胞特征但更老的巨噬细胞，而APOE4携带者则表现出相反的情况，具有更老的星形胶质细胞但更年轻的巨噬细胞，这表明拮抗多效性在细胞分辨率上运作。这与进化假设一致，即APOE4增强的免疫警觉性在历史上高病原体负担下提供了生存优势，尽管加速脑老化增加了现代延长寿命中阿尔茨海默病（AD）的风险[22,23]。

对GNPC队列中7,074名健康个体跨细胞类型的年龄差距配置文件共现情况的检查表明，细胞老化可能在少数细胞类型上同步进行（图2d）。这些协调的模式在兴奋性神经元、髓鞘形成细胞和内皮细胞中尤为明显，表明共享或同步的途径。某些细胞群体——如兴奋性神经元、施万细胞、NK细胞、巨噬细胞、骨骼肌细胞和成纤维细胞——作为潜在的"老化中心"出现，显示出与其他多种细胞类型的关联。相比之下，上皮细胞类型往往表现出更孤立或弱相关联的年龄差距配置文件。

通过分析NSHD，世界上最长的持续追踪出生队列[24]，我们检查了364名个体10年期间极端细胞老化的稳定性。在图2e中，我们展示了两个代表性配置文件：巨噬细胞极端老化者（基线时364名个体中的9名），和肺泡2型细胞类型极端老化者（基线时364名个体中的11名）。极端老化状态得到了大量保留：基线时的巨噬细胞极端老化者中有55%在10年随访期间保持了这种状态，而肺泡2型细胞极端老化者显示出81%的保留率。我们将此分析扩展到基线年轻细胞类型老化者（补充图4a），揭示了不同细胞类型之间独特的稳定性配置文件（补充图4a,b）。我们的观察表明，处于极端细胞老化状态的个体往往会在随着时间的推移保持这种状态。某些细胞类型显示出旧或年轻状态的维持，可能反映了对生物老化的不同易感性[25]。

综上所述，这些分析表明，血浆衍生的细胞类型特异性生物年龄估计与异质性细胞老化模式相关联，可能对疾病易感性和韧性具有潜在影响。

有意义的生物年龄估计应捕获潜在的生理状态，并与健康轨迹和疾病结果相关联。因此，我们评估了细胞年龄差距是否与疾病状态相关，重点关注GNPC中存在的神经退行性疾病：AD（n = 2,761）、肌萎缩侧索硬化症（ALS，n = 245）、帕金森病（PD，n = 476）、额颞叶痴呆（FTD，n = 199）和轻度认知障碍-主观认知障碍（MCI-SCI，n = 1,992）。GNPC中这五种神经退行性疾病患者的时序年龄分布如扩展数据图5所示。

利用SomaScan老化模型，我们使用点二列相关与Benjamini–Hochberg错误发现率校正测试了所有43种细胞类型年龄差距与每种神经退行性疾病之间的关联（图3a）。所有疾病-细胞类型对中最强的关联是ALS和骨骼肌细胞老化（r = 0.43，调整后P = 1.36×10^-15），这与ALS中已知的运动神经元退化和肌肉萎缩的病理生理学一致[26,27]。

有趣的是，除了骨骼肌细胞外，我们观察到心肌细胞在ALS患者中也表现出加速老化（r = 0.33，调整后P = 4.08×10^-9），这与ALS患者中心脏异常的新兴证据一致[28]，可能由影响骨骼肌和心肌组织的共享分子途径驱动。鉴于ALS与骨骼肌和心肌细胞老化的强烈关联，我们可视化了这些细胞类型相对于时间年龄的估计生物年龄（图3b）。局部加权散点图平滑（LOWESS）回归分析显示，ALS患者在时序年龄跨度上表现出明显的骨骼肌细胞和心肌细胞老化加速。

AD与多种细胞类型的加速老化相关，最显著的是少突胶质前体细胞（r = 0.15，调整后P = 1.86×10^-44）、胰腺内分泌细胞（r = 0.15，调整后P = 3.49×10^-44）、抑制性神经元（r = 0.15，调整后P = 1.48×10^-40）、近端肠细胞（r = 0.13，调整后P = 3.85×10^-33）和星形胶质细胞（r = 0.10，调整后P = 3.25×10^-21）。有趣的是，虽然抑制性神经元的老化与AD相关，但兴奋性神经元的老化则无关（图3a），可能支持越来越多的文献，这些文献将网络过度兴奋与突触抑制丧失和抑制性中间神经元的选择性易损性联系起来[29,30]。值得注意的是，虽然我们认识到AD合并症如糖尿病可能引入混杂效应，但分层分析显示，没有2型糖尿病的AD患者表现出胰腺内分泌细胞加速老化，而2型糖尿病以复合方式放大了这种效应（补充图5）。这些发现突显了AD病理生理学的系统性质，特别是与肠道上皮老化、代谢失调和少突胶质-神经元相互作用的强关联[31,32,33]。

为进一步优先考虑与神经退行性疾病相关的细胞类型，我们调查了细胞类型特异性极端老化者状态与疾病状态之间的比值比（OR）（补充图6）。ALS与加速骨骼肌细胞老化表现出异常强的OR（OR = 7.85，调整后P = 5.50×10^-5），表明骨骼肌细胞极度老化的个体患ALS的可能性比没有加速的个体高7倍以上。在GNPC队列内的ALS队列中（n = 355；245名ALS患者，110名对照），57名骨骼肌细胞极端老化者中有53名（93.0%）被诊断为ALS。这种显著关联与报道的肌肉病理学和ALS中外周组织可能与运动神经元退化一起促进疾病进展的新兴证据一致[34,35]。

值得注意的是，FTD显示与人类蛋白质图谱中最初标记为"水平细胞"的细胞类型具有强烈的横断面关联，为准确反映这种老化特征的生物学基础，我们将其称为NEFL-C1QL2投射神经元老化（补充图7）。NEFL是轴突损伤的广泛认可生物标志物，通常在FTD中明显升高，而C1QL2是一种已知在易受额颞叶变性影响的颞叶边缘结构中突出的突触组织者[36,37]。总的来说，这些疾病模式化的细胞老化特征支持几种可能的病理生理学关联，并可能还突出潜在的新外周细胞靶点，用于机制研究和治疗干预。

虽然描述的横断面研究揭示了细胞老化与疾病状态之间的关联，但一个关键问题是细胞老化是否可以预测未来的疾病发作。为了解决这个问题，我们检查了细胞老化特征是否能在15年随访期间对UKB队列中的神经退行性疾病发病率进行风险分层。

对于ALS，与年轻老化相比，骨骼肌细胞极度老化的个体患新发ALS的风险显著增加（风险比（HR）= 12.74）。按老化状态（极端、正常和年轻）划分的Kaplan-Meier分析显示了累积ALS发病率的显著差异（图3c；对数秩P < 0.0001）。有趣的是，加速骨骼肌老化的ALS诊断之间的关系即使在仅考虑血液抽取和细胞老化评估后3年以上诊断的病例时仍然存在（扩展数据图6）。ALS的诊断时间通常延迟到8-15个月，但多年差距可能表明影响肌肉组织的病理机制在症状出现前几年就开始了[38]。我们在心肌细胞老化和新发ALS之间观察到类似的风险分层（图3c；极端与年轻老化：HR = 6.59）。

当检查细胞老化特征对新发AD风险的预后价值时，星形胶质细胞老化成为最强的预测因子（图3d）。与年轻老化的个体相比，星形胶质细胞极度老化的个体患新发AD的风险增加了12.59倍。Kaplan-Meier分析显示了按老化状态进行的风险分层（对数秩P < 0.0001），这在APOE基因型亚组中保持稳健（图3g）。

鉴于我们先前发现星形胶质细胞在APOE4携带者中以剂量依赖方式加速老化（图2c），我们接下来检查了APOE基因型和星形胶质细胞老化如何共同影响AD发病率。对APOE基因型和星形胶质细胞老化状态所有组合的累积发病率分析揭示了显著的协同效应（图3e）。APOE4纯合子且星形胶质细胞极度老化的个体在15年随访期间显示出最高的累积发病率38.3%，而具有正常星形胶质细胞的老化子则为12.6%。这种风险梯度在基因型中是一致的：APOE3/4携带者且星形胶质细胞极度老化的个体显示10.2%的累积发病率，而具有正常星形胶质细胞的老化子则为2.7%，APOE3/3携带者显示出类似的模式（3.6%与0.8%）。

从潜在治疗相关性的角度来看，没有一名APOE4/4携带者且星形胶质细胞年轻的患者（23名）以及仅有1.8%的APOE3/4携带者且星形胶质细胞年轻的患者发展为AD。虽然仅有10名APOE2/2携带者表现出星形胶质细胞极度老化，但APOE2/2携带者总体保持低发病率，这与APOE2等位基因的已知保护作用一致。这些结果可能暗示中枢"炎性老化"机制和星形胶质细胞激活是理解为何只有部分APOE4携带者易患AD的关键[39,40]，而其他人则保持受保护状态。

与AD的已知遗传风险梯度一致，疾病发病率从APOE3/3携带者（n = 27,263）到APOE3/4携带者（n = 9,884）再到APOE4/4携带者（n = 1,210）逐渐增加，反映了APOE4等位基因剂量对AD风险的升级影响（扩展数据图7）。值得注意的是，在每个基因型组内，星形胶质细胞极度老化一致地识别出AD风险较高的个体，与具有正常和年轻星形胶质细胞的个体相比，表明星形胶质细胞老化提供了超出APOE基因型的独立风险分层。

为了将星形胶质细胞老化的预后能力与已建立的AD风险因素进行比较，我们对其与AD多基因风险评分（PRS）、APOE4携带者状态（存在或不存在）和时间年龄进行了比较分析（图3f）。与星形胶质细胞极度老化相关的AD风险增加（HR = 5.16，95% CI 4.06-6.56）与APOE4携带者状态（HR = 5.30，95% CI 4.54-6.18）相当，超过了PRS（HR = 2.14，95% CI 1.92-2.39）和较老的时间年龄（HR = 1.24，95% CI 1.22-1.27）。同时携带APOE4等位基因且星形胶质细胞极度老化的个体风险最高（HR = 11.58，95% CI 8.56-15.66）。值得注意的是，AD风险的性别分层分析显示，女性不仅对APOE4（女性HR = 5.82，95% CI 4.73-7.16，而男性HR = 4.68，95% CI 3.71-5.90）的有害关联更易感，而且对星形胶质细胞极度老化（女性HR = 6.84，95% CI 5.09-9.20，而男性HR = 3.54，95% CI 2.35-5.34）也是如此。同时携带APOE4和星形胶质细胞极度老化的女性比男性面临更大的AD风险增加，进一步说明了AD发病机制中的性别特异性模式[40]。最有趣的是，年轻星形胶质细胞将AD风险降低了60%以上。

总的来说，这些发现突显了星形胶质细胞老化作为一种可能强大的生物标志物，独立且协同地对APOE基因型进行AD风险分层。维持年轻的星形胶质细胞功能可能是一种潜在的治疗策略，以减轻疾病负担，特别是对于遗传易感个体。

鉴于细胞类型特异性老化与神经退行性疾病之间的显著关联，我们进一步检查了细胞类型年龄差距与临床痴呆评分（CDR）之间的关系，CDR是痴呆严重程度和一般认知及功能表现的综合测量[41]。在所有细胞类型中，少突胶质前体细胞和抑制性神经元的老化显示出与CDR最强的相关性（扩展数据图8）。当在GNPC队列中跨队列可视化年龄差距并按CDR评分分层时，少突胶质前体细胞老化显示出与认知障碍恶化一致的逐步增加，在队列J、F和N中效果显著。类似地，抑制性神经元年龄差距随着CDR评分的升高而增加。这些观察进一步说明了细胞类型特异性老化在认知衰退中的生物学相关性。

进一步分析细胞老化和AD，我们检查了NSHD队列Insight-46神经影像亚研究（n = 483）[42]中参与者的年龄差距关联。我们进行了回归分析，评估血浆pTau-217负担（pg ml^-1）和前临床阿尔茨海默认知综合评分（PACC）与细胞年龄差距的独立关联（图3h）。鉴于血浆pTau-217可靠地识别脑淀粉样β和tau病理，其准确性可与脑脊液和PET生物标志物相媲美，它作为验证细胞类型特异性老化与AD病理之间关联的稳健正交测量[43]。此外，PACC评分是一种经过验证的测量方法，对早期认知衰退敏感，广泛用于前临床痴呆和AD研究[44]。

与在GNPC中获得的结果一致，我们发现血浆磷酸化tau-217（pTau-217）负担与几种神经元和胶质细胞类型显著相关，包括星形胶质细胞（系数beta (β) = 1.08，调整后P = 3.92×10^-7）、少突胶质前体细胞（β = 1.02，调整后P = 1.19×10^-6）、少突胶质细胞（β = 0.76，调整后P = 2.2×10^-4）和抑制性神经元（β = 0.76，调整后P = 2.2×10^-4）（图3h）。对于PACC，我们观察到认知恶化与多种细胞类型的升高等级年龄差距相关，其中少突胶质前体细胞表现出最强的关联之一。

总体而言，这些发现表明，从血浆蛋白质组学衍生的细胞类型老化特征与多个队列中的神经退行性疾病相关，并可能在细胞水平上提供对潜在病理生理学的粒度洞察。

接下来，我们调查了细胞老化特征在UKB队列中15年随访期间对癌症、中风和慢性疾病的预后价值。我们的发现表明细胞老化特征强烈预示未来疾病。

对于肺癌，肺泡2型细胞和更广泛的呼吸道上皮谱系的极端老化最能预测（HR = 8.39，95% CI 6.68-10.52；HR = 8.47，95% CI 6.69-10.71，分别）（图4a,c）。值得注意的是，在我们的研究中，这些细胞老化特征增强了肺癌风险分层，超越了已知的风险因素吸烟状况：同时吸烟且两种细胞类型都极度老化的个体风险最高（HR = 15.33，95% CI 11.02-21.31），比仅吸烟的风险高58%（HR = 9.69，95% CI 8.04-11.68），而从不吸烟者风险最低。

肺泡2型细胞和呼吸道上皮谱系老化特征在调整年龄、性别、吸烟状况和估计包年数后仍保留独立的预后价值（扩展数据图9）。肺泡2型细胞的显著预后价值——作为肺泡修复和再生的干细胞——与肺泡2型细胞是肺癌最常见形式肺腺癌的细胞起源一致。这些发现与文献一致，表明肺实质中再生能力受损可能为恶性转化创造许可环境[45,46]。

对于2型糖尿病（图4b,c），髓系谱系极端老化表现出最强的预后价值（HR = 3.88，95% CI 3.33-4.52），在调整已建立的风险因素后仍然显著（补充图8），这与髓系衍生细胞因子在启动胰腺胰岛炎症微环境和增加2型糖尿病易感性中的作用一致[47]。

对于新发慢性阻塞性肺病（COPD）（图4c），肺泡2型细胞和更广泛的呼吸道上皮谱系的极端老化同时表现出最强的预后能力（HR = 6.31，95% CI 5.57-7.13；HR = 5.45，95% CI 4.75-6.25，分别）。对于新发心力衰竭（图4c），肌肉细胞和成纤维细胞的极端老化最能预测（HR = 4.65，95% CI 4.00-5.41；HR = 4.62，95% CI 3.98-5.39，分别），这与心肌损伤或老化后功能失调重塑的已知机制一致[48]。对于新发中风（图4c），NEFL-C1QL2投射神经元的极端老化表现出最强的预后价值（HR = 3.03，95% CI 2.47-3.72），其次是小胶质细胞（HR = 2.84，95% CI 2.33-3.47）（扩展数据图10）。

有趣的是，对于新发淋巴瘤（图4c），B细胞的极端老化具有高度预后价值（HR = 6.63，95% CI 4.25-10.33），其次是粒细胞（HR = 10.09，95% CI 6.86-14.83）和T细胞（HR = 6.75，95% CI 4.33-10.54）。在B细胞淋巴瘤中，T淋巴样和髓系前体衍生细胞的失调已知会促成恶性肿瘤发生[49,50]。这一发现提出了一个问题：造血微环境中协调的老化是否可能促进早期淋巴瘤发生。虽然难以直接比较，但这些HR高于淋巴样克隆性造血的不确定潜能，并与淋巴样镶嵌染色体改变相当[51]。

除了疾病预测外，我们还调查了细胞老化特征在UKB队列中对全因死亡率的预后价值（图5a）。最强的关联见于肌肉谱系细胞的极端老化（HR = 4.38，95% CI 4.00-4.80）和骨骼肌细胞（HR = 4.18，95% CI 3.82-4.57），其次是神经元、成纤维细胞、肺泡2型细胞和髓系谱系细胞，不同细胞类型和谱系之间存在轻微的性别差异。在额外调整肾功能后，这些关联保持一致（补充图9和10）。当通过细胞老化状态检查生存分层时，与正常老化者相比，所有细胞类型的极端老化者显示出降低的生存率（补充图11）。肌肉谱系细胞、神经元谱系细胞和免疫谱系细胞的代表性生存曲线如图5c所示。

为了调查细胞老化和死亡率风险之间的时间动态，我们在NSHD队列中评估了三个纵向时间点的关联（图5b）。在15年期间（平均年龄78.2±0.3岁）追踪364名个体，我们发现细胞老化的预后价值随着时间的推移而增强。这种效应在骨骼肌细胞、抑制性神经元和星形胶质细胞中最明显，这些细胞在时间点上显示出逐渐增加的HR。到第三时间点，超过一半的细胞类型与死亡率显著相关（调整后P < 0.05），表明老化信号的累积和收敛。

接下来，我们通过根据极端老化细胞类型的数量对个体进行分层，检查了细胞老化累积负担如何影响生存（图5d）。出现了惊人的剂量-反应关系：具有正常老化特征的个体维持约90%的生存率，而具有20+种极度老化细胞类型的个体在15年随访期内显示出约34%的生存率。中间组显示分级风险。具有年轻免疫谱系或神经元谱系细胞类型的个体显示出与正常老化者相当或更好的生存率，联合年轻状态显示出最高的生存率。

细胞老化特定易损性和累积老化负担影响生存的观察促使我们开发了一个综合的多细胞老化风险评分（PARS），包括一组细胞类型（图5e）。PARS模型在UKB队列（n = 21,983）中训练，在（n = 22,475）中测试，并在NSHD队列（n = 1,803；SomaScan）中验证。使用队列特异性评分分布，将个体分为高（前5%）、低（后5%）和中等（所有其他）死亡风险组。Kaplan-Meier分析显示在训练和测试集中清晰的风险分层（对数秩P < 0.0001），高风险个体的生存率降低（图5f）。尽管蛋白质组学检测技术不同，但在验证队列中重现了这一发现。与作为死亡率最强预测因子的一致，骨骼肌细胞老化在PARS模型中表现出最大的系数[52]。这些发现说明了PARS作为死亡率和健康寿命的平台无关生物标志物的预后价值。

讨论

我们的研究引入了一个细胞类型特异性框架，用于通过血浆蛋白质组学建模生物老化，利用对三个独立队列中60,000多名个体的7,000多种血浆蛋白质的测量。

通过推导细胞类型特异性老化模型和年龄差距，我们发现生物老化在细胞水平上既存在显著异质性，也存在协调变化，包括可能反映不同疾病易损性的极端老化的不同发病。我们的框架揭示了细胞老化与神经退行性疾病之间的显著关联，具有在临床发病前数年的预后价值。值得注意的是，骨骼肌细胞极度老化在UKB队列中15年随访期间对新发ALS表现出显著的预后能力，即使对于基线评估后3年以上诊断的病例也是如此，暗示了无症状检测的潜力。

对于AD，GNPC中的分析揭示了多种细胞类型的加速老化，突显了该疾病的系统性质[53]。这些关联在NSHD队列中得到进一步验证，并通过与认知表型的联系得到支持。值得注意的是，少突胶质前体细胞老化在队列中与认知恶化一致相关，通过CDR和PACC测量。这些发现促使进一步调查少突胶质细胞谱系再生和髓鞘维持在年龄相关认知衰退中的潜在作用[54]。

星形胶质细胞老化在UKB队列中显示出与新发AD最强的关联，与APOE4携带者状态相当，并超过了多基因风险评分和时间年龄。有趣的是，星形胶质细胞老化与APOE基因型相互作用，APOE4纯合子中星形胶质细胞极度老化与正常老化相比，在15年随访期间AD累积发病率增加了3倍。这种风险梯度在基因型中持续存在，女性被确定为比男性更易受这些影响。年轻星形胶质细胞似乎有力地减弱了APOE4的有害影响。在得到复制之前，这种相互作用可能指向大脑韧性的机制。

细胞老化特征对新发癌症和慢性疾病也具有预后价值。极度呼吸道细胞老化识别出肺癌风险升高的吸烟者，而髓系谱系老化识别出血糖正常但2型糖尿病风险更高的个体，暗示了有针对性的监测和早期预防干预的潜力[55]。

我们的发现表明，特定细胞的易损性和累积老化负担影响生存。骨骼肌细胞老化显示出与死亡率最强的关联，其次是神经元、成纤维细胞、肺泡2型细胞和髓系谱系细胞；暗示肌肉骨骼、认知、肺和免疫维持对长寿的重要性[56]。惊人的剂量-反应关系显示，具有20+种极度老化细胞类型的个体在15年随访期内的生存率约为34%，而具有正常老化特征的个体约为90%，中间组显示分级风险。年轻的免疫谱系和神经元谱系细胞类型减弱了死亡风险。此外，我们的发现揭示了一个综合细胞类型多细胞老化风险评分（PARS）模型在不同队列和蛋白质组学平台中保持稳健的死亡风险分层，证明了其作为健康寿命的平台无关生物标志物的潜力。

总体而言，本研究中提出的非侵入性血液方法使生物老化能够在细胞分辨率上表征，为研究老化异质性和潜在的治疗相关疾病机制提供了新框架。未来工作应探索细胞老化的顺序进展和遗传基础。此外，生活方式因素和超级老化队列的互补分析可能识别出细胞水平上卓越长寿、韧性和再生的蛋白质组学特征。

我们的研究存在局限性。分析基于并因此限于人类蛋白质图谱中编目的细胞类型，使得某些特化细胞群体代表性不足。转录水平并不总是反映蛋白质丰度，某些分配给细胞类型的血浆蛋白质，如分配给心肌细胞的FABP3和分配给小胶质细胞的HAVCR1，可能在特定情况下更广泛地产生或释放。因此，血浆蛋白质来源于多种细胞过程，这些过程在此未明确区分[57]。由于队列主要是年长且高加索人种，因此在更年轻和更多样化的人群中进行更广泛的验证对于扩展本研究报告结果的普遍性至关重要。

总之，大规模血浆蛋白质组学与机器学习相结合，使活体人群中细胞类型特异性老化的非侵入性评估成为可能，并揭示了细胞老化、疾病和死亡率之间的强关联。

方法

蛋白质组学测量

SomaLogic（

Olink Explore 3072邻近延伸测定平台用于量化UKB队列中的血浆蛋白质。Olink蛋白质组学基于两种多克隆抗体池与靶蛋白质的结合以及随后两个独特单链DNA探针的杂交和富集。该检测涵盖2,941种免疫测定，靶向2,923种蛋白质。Olink测量基于制造商推荐的归一化蛋白质表达（NPX）值，包括归一化。有关UKB队列中Olink蛋白质组学数据质量控制、获取和处理的更多细节记录良好[58]（更多细节可在

研究人群和临床表型

GNPC v1.3数据集（

我们的初步分析包括GNPC中的21,979名个体，并进一步减少以考虑报告的完整性和一致性。具体而言，我们保留了v4.1（7,289种蛋白质靶点）SomaScan检测数据，并且仅包括具有完整年龄和性别信息的个体。由于血清和脑脊液中已知的样本质量和检测能力的差异，我们将分析限制在通过常规静脉穿刺在乙二胺四乙酸（EDTA）中收集的血浆样本。由此，优先考虑了14个独立队列中的14,281名个体进行下游分析（补充表3）。在这些个体中，7,074名被定义为健康。根据GNPC提出的定义，我们将健康人群定义为没有AD、PD、FTD、MCI或ALS诊断，并且临床痴呆评分（CDR）不超过零的个体。

KADRC队列是一项由美国国家老龄化研究所资助的纵向观察性临床痴呆参与者和年龄匹配对照研究。KADRC中的研究参与者接受纵向认知、神经心理学、成像和生物标志物评估，包括CDR测试。KADRC队列包括AD诊断个体和健康对照的样本。血液收集和处理按照先前报告的严格标准化协议进行，以最小化与抽血和处理相关的变异。所有血液抽取均在早晨进行，以最小化昼夜节律对蛋白质浓度的影响。华盛顿大学圣路易斯医学院机构审查委员会批准了该研究（机构审查委员会编号201109148），并根据批准的协议进行研究。从所有参与者或其家庭成员处获得书面知情同意。

NSHD是1946年3月在英国出生的一周内出生个体的纵向出生队列。在三个时间点测量血浆蛋白质组学（平均年龄±标准差：63.2±1.1岁，n = 1,803；70.7±0.7岁，n = 483；和72.9±0.6岁，n = 364），有364名参与者在所有三个时间点被追踪。通过国家卫生服务（2024年6月）从国家卫生服务英格兰和国家卫生服务中央注册处获得生存数据，随访至平均年龄78.2±0.3岁。撤回的个体被截尾（n = 2）。一部分参与者（n = 483）包括在Insight-46神经影像亚研究中。在该亚组中，使用ALZpath Simoa检测（Quanterix）量化血浆pTau-217。使用PACC（一种对早期认知衰退敏感的综合测量）评估认知功能。NSHD研究获得国家研究伦理服务委员会批准（14/LO/1173）。所有参与者提供书面同意。

UKB是一项前瞻性观察性队列研究，收集了约500,000名参与者（年龄40至69岁）的组学和表型数据，招募期在2006年至2010年之间。参与者接受了基线评估，包括身体测量、问卷调查和生物样本收集，并进行了长达15年的疾病结果和死亡率的纵向随访。所有参与者提供知情同意。

UKB制药蛋白质组学项目为约54,000名参与者在基线访问时生成Olink Explore 3072血浆蛋白质组学数据。在UKB制药蛋白质组学项目质量控制后，测量了约53,000个样本中的2,923种蛋白质。额外过滤移除了具有>1,000种缺失蛋白质的样本（n = 8,182）、报告和遗传性别不一致的样本（n = 373）以及在>20%样本中缺失的蛋白质（n = 7），得到最终数据集44,458个样本和2,916种蛋白质。数据按评估中心分为训练（n = 21,983）和测试（n = 22,475）集，使用训练集参数对蛋白质值进行z评分归一化。缺失值（2.7%）使用k近邻（k = 148；sklearn KNNImputer v1.3.1）进行插补，通过掩码值重建（平均绝对误差 = 0.57）验证性能。

疾病诊断日期从UKB"首次发生"（数据类别1712）、"癌症登记"（数据类别100092）和（如可用）"算法定义的结果"（数据类别47；例如AD、PD、ALS、FTD和中风）中收集。如果记录了多个日期，则使用最早的日期。使用以下"首次发生"或"癌症登记"ICD-10（以及如可用的ICD-9）代码：心力衰竭（I42、I43和I50）；中风（I60-64）；COPD（J41-44）；2型糖尿病（E11和E14）；淋巴瘤（C81-89，以及ICD-9 2014-2016、2019和2020）；肺癌（C33、C34和ICD-9 1623和1629）；AD（F00和G30）和PD（G20）。对于计算2型糖尿病发病率，从分析中移除被诊断为1型糖尿病（ICD-10 E10）或其他不常见形式糖尿病（"其他指定糖尿病"ICD-10 E13）的个体。根据出生月份和年份与诊断日期比较计算诊断年龄。通过将诊断年龄与计算或报告的评估年龄比较来找到诊断时间。

AD诊断日期源自"首次发生"类别或首次门诊血红蛋白A1c值≥6.5%的日期。被诊断为痴呆但无指定病因且无替代病因证据（基底神经节神经退行性疾病、ALS、多发性硬化症、梅毒、HIV、B12/叶酸/硫胺素缺乏、额颞叶痴呆、脑积水、酒精使用障碍（通过报告的消费诊断：女性>28单位/周或男性>35单位/周）、脑血管病理、镇静剂滥用、ICD-10 A81"中枢神经系统非典型病毒感染"或ICD-10 G32"其他神经系统变性障碍"）的个体被分配为AD诊断，鉴于其作为痴呆主要原因的地位。具有竞争性诊断（例如，FTD和AD或进行性核上麻痹和PD）的个体被归类为仅具有更罕见的诊断，鉴于正式诊断所需的高临床怀疑。从疾病发病率分析中移除非生理诊断日期的个体。

从UKB基线评估中提取以下变量：吸烟状况（数据字段20116_i0）、吸烟包年数（数据字段20161_i0）、血红蛋白A1c（数据字段30750_i0）、BMI（数据字段21001_i0）、腰围（数据字段p48_i0）、酒精消费（在数据字段1568_i0、1578_i0、1588_i0、1598_i0和1608_i0上汇总）、睡眠持续时间（数据字段1160_i0）、身体活动（数据字段884_i0和904_i0）、血浆肌酐（数据字段23478_i0）、血浆胱抑素C（数据字段30720_i0）、尿肌酐（数据字段30510_i0）、尿白蛋白（数据字段30600_i0）、APOE基因型（数据字段2315）和AD PRS（数据字段26206）。未报告具有任何APOE2或APOE4等位基因的个体被分配为APOE3/3基因型。健康生活方式定义为满足以下条件：从不吸烟、不饮酒、BMI<25、男性腰围<90 cm或女性<84 cm、每周至少5天进行10+分钟的中等或剧烈身体活动以及每晚≥7小时睡眠。可在

识别细胞类型富集的血浆蛋白质

人类蛋白质图谱单细胞RNA-seq数据库（人类蛋白质图谱版本24.1 SomaScan检测量化的7,289种血浆蛋白质，用于SomaScan老化时钟模型，以及映射到Olink Explore 3072检测量化的2,923种血浆蛋白质，用于Olink老化时钟模型。值得注意的是，虽然组织中的基因表达并不保证分泌到血浆中，但研究表明相当一部分细胞类型富集的转录本对应于血液中可检测的蛋白质[57]。

估计细胞血浆蛋白质轨迹

血浆蛋白质表达被z评分（即标准化为均值=0，标准差=1），并使用LOWESS回归（frac=0.3；statsmodels v0.14.4）作为时间年龄的函数进行建模。所得轨迹用于热图可视化和聚类（scipy.cluster.hierarchy v1.15.1）。计算成对欧几里得距离并使用Ward方法执行层次聚类。使用肘部方法确定最佳聚类数，产生33个聚类（阈值=0.05）。

轨迹聚类与细胞类型和通路富集分析

为了识别在聚类中富集的细胞类型，我们执行了超几何富集分析。对于每个聚类，我们评估了聚类蛋白质与预先定义的映射到单个细胞类型的蛋白质集之间的重叠。对于每种细胞类型，使用超几何检验计算观察到实际或更大重叠的概率，给定聚类大小、映射蛋白质集大小和整体背景大小。为了解决多重测试，使用Benjamini–Hochberg程序应用错误发现率校正，使用statsmodels（v0.14.4）python包中的stats.multitest.multipletests函数。在聚类中富集的细胞类型被定义为满足调整后P<0.05的显著性阈值的细胞类型。满足此阈值的细胞类型在点图中绘制。使用相同方法将器官纳入此分析。使用先前研究的方法和Genotype Tissue Expression项目提供的公开可用数据集执行器官特异性蛋白质组的映射。

使用GProfiler（gprofiler-official v1.0.0）对每个聚类执行通路富集分析，使用人类基因命名空间（organism='hsapiens'），限制在Gene Ontology、Biological Process、Molecular Function、Cellular Component、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes和Reactome数据库。

细胞年龄估计和年龄差距计算

为了使用血浆蛋白质组学估计生物年龄，我们使用elastic net回归（glmnet R包，v4.1.7）开发了细胞类型特异性老化模型。每个老化模型都训练在一组用于预测时间年龄的细胞类型特异性血浆蛋白质上。我们实现了自助聚合，通过对训练数据进行有放回重采样生成100个自助样本。对于每个自助样本，我们在z评分归一化的对数转换蛋白质丰度值上训练一个模型，将性别（F=1，M=0）作为额外协变量来预测时间年龄。使用cv.glmnet函数通过10折交叉验证执行L1正则化参数（λ）的超参数调整。每个样本的最终预测年龄计算为100个自助模型的平均预测。我们将此方法应用于60种细胞类型，排除15种性别特异性细胞类型，以确保两种性别在细胞类型生物年龄估计中的代表性。

对于SomaScan平台，模型在KADRC队列的健康个体上训练，然后应用于更广泛的GNPC队列进行疾病关联分析，并应用于独立的NSHD队列进行外部验证。根据性能和稳健性标准评估老化模型。如果模型表现出足够的预测性能（训练中相关系数r≥0.25，测试中r≥0.15；最少4个蛋白质特征），则保留模型。包括少于4个特征的模型可能会限制下游推断的稳健性，因为蛋白质组学测定中固有的技术噪声。在应用这些质量控制标准后，保留43个细胞老化模型用于下游分析。

对于Olink平台，模型在UKB队列训练集中的21,983名个体上训练，然后应用于UKB队列测试集（n = 22,475）。由于Olink数据集包括2,916种蛋白质（质量控制后），少于SomaScan测量的7,289种蛋白质，并且通常产生更少的跨细胞类型特征，我们还开发了14个谱系水平的细胞类型模型，以捕获更广泛本体类别中的老化信号。为了展示我们的框架在多个细胞类型本体水平上建模细胞老化的能力，我们扩展分析以包括14个谱系细胞类型，包括以下广义父级类别及其相关子组：

淋巴谱系（B细胞、浆细胞、T细胞和NK细胞）；髓系谱系（单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和树突细胞）以及所有免疫细胞（合并所有淋巴和髓系细胞类型）。

神经元谱系（兴奋性和抑制性）；脑胶质谱系（星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞和小胶质细胞）；视网膜细胞谱系（视锥光感受器、视杆光感受器、双极细胞、水平细胞和Müller胶质细胞），以及所有神经系统（包括施万细胞的所有神经元和胶质细胞类型）。

血管内皮细胞和淋巴内皮细胞。

乳腺腺细胞、外分泌腺细胞、前列腺腺细胞、胰腺内分泌细胞、粘液腺细胞、浆液腺细胞、唾液导管细胞和分泌细胞。

呼吸道上皮谱系（肺泡1型细胞、肺泡2型细胞、基底呼吸道细胞、纤毛细胞、俱乐部细胞和离子细胞）；皮肤上皮谱系（基底角质形成细胞、上基底角质形成细胞、黑色素细胞、基底鳞状上皮细胞和鳞状上皮细胞）；胃肠道上皮谱系（远端肠细胞、近端肠细胞、肠杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞和胃粘液分泌细胞），以及泌尿生殖道上皮谱系（集合管细胞、远端小管细胞和近端小管细胞）。

骨骼肌细胞、心肌细胞和平滑肌细胞。

对于每种谱系细胞类型，我们识别了在谱系内平均表达量至少比谱系外任何细胞类型高两倍的蛋白质签名，从而捕获共享谱系水平的老化信号，同时保持生物学可解释性。在应用相同质量控制标准（训练中相关系数r≥0.25，测试中r≥0.15；最少4个蛋白质特征）后，保留了48个细胞类型特异性老化模型用于Olink分析（包括个体细胞类型和谱系）。

为了计算每个细胞类型特定老化模型的个体年龄差距，我们使用statsmodels（v0.14.4）python包中的LOWESS函数（fraction参数设置为2/3）拟合预测年龄和时间年龄之间的局部回归，以估计总体均值。我们基于对应队列中健康个体的拟合推导每个队列的年龄差距，以考虑队列差异，并排除GNPC中两个缺乏健康个体的队列（共16个）。个体样本年龄差距计算为预测年龄与对应时间年龄总体均值LOWESS回归估计之间的残差。年龄差距按每个老化模型z评分（即标准化为均值=0和标准差=1），以解决模型变异性差异并促进下游分析中跨细胞类型的比较。对于每种细胞类型，我们根据生物年龄与时间年龄的"极端"偏差对个体进行分类，定义为绝对z评分年龄差距超过2（即极端老化者>2，年轻老化者<-2）

细胞老化相关性分析和网络可视化

我们使用SciPy Python包（v1.15.1）中的pearsonr函数检查年龄差距跨细胞类型的皮尔逊相关性。在网络可视化中，每个节点代表一种特定细胞类型，按其细胞类别着色。边缘连接年龄差距相关性超过0.35阈值的细胞类型对。

极端老化稳定性分析

在NSHD队列中评估极端老化细胞状态的稳定性，跨越3个时间点（n = 364；平均年龄和标准差：63.2±1.1岁，70.7±0.7岁和72.9±0.6岁），其中量化从基线到最终时间点的极端老化者的保留率。仅包括在所有3个时间点都有蛋白质组学样本的个体进行极端老化稳定性分析。使用Python包pandas（v2.1.1）、NumPy（1.24.4）和Matplotlib（v3.8.0）构建Alluvial图。

年龄差距与神经退行性疾病状态的关联分析

使用SciPy（v1.11.3）中的pointbiserialr函数，使用点二列相关评估细胞类型特异性年龄差距与神经退行性疾病诊断之间的关联。分析包括GNPC中存在的5种神经退行性疾病：AD（n = 2,761）、ALS（n = 245）、PD（n = 476）、FTD（n = 199）和MCI-SCI（n = 1,992）。仅包括至少10个疾病病例和健康对照的相关队列纳入相应分析。对于每种疾病分析，包含疾病病例的相关队列中的健康个体作为对照。

新发疾病的预后分析

使用Python（v0.27.8）中的lifelines包和R包survival（v3.8.3）在15年随访期间使用Cox比例风险模型评估UKB队列中新发疾病的细胞老化特征的预后价值。参与者随访至疾病发作、死亡和/或最后一次临床更新。针对连续（z评分年龄差距）和极端老化状态估计HR和95% CI。模型针对时间年龄和性别进行调整，针对特定疾病或进一步分析包括额外协变量（例如，HbA1c、BMI、吸烟、包年和肾功能用于2型糖尿病）。

对于AD，我们将细胞老化特征的预后价值与已建立的风险因素进行比较。针对APOE4携带者状态、APOE2携带者状态、AD PRS、时间年龄、星形胶质细胞老化状态以及APOE基因型与星形胶质细胞老化状态的组合计算HR。通过为女性和男性分别拟合Cox模型执行性别分层分析，以评估AD风险关联中潜在的性别差异。对于ALS，执行敏感性分析，仅考虑血液抽取后3年以上诊断的病例，以评估预后价值是否保留。

使用Kaplan-Meier方法（lifelines v0.27.8）估计累积发病率曲线，并针对按老化状态分层的关键细胞类型-疾病关联进行可视化。使用对数秩检验评估组间生存差异。

全因死亡率分析

使用Cox比例风险回归模型（lifelines v0.27.8或survival v3.4.2）在15年随访期间评估细胞老化特征与UKB队列中全因死亡率的关联，针对时间年龄和性别进行调整。对于每种细胞类型，计算极端老化状态和连续年龄差距的HR和95% CI。通过为女性和男性分别拟合Cox模型执行性别分层分析，针对时间年龄进行调整。结果使用森林图进行可视化，显示总体、女性和男性群体的单独估计。

生成Kaplan-Meier生存曲线，以可视化按细胞老化状态（极端、正常和年轻）分层的关键细胞类型的死亡率风险。使用对数秩检验评估组间生存差异。为了检查细胞老化累积负担对生存的影响，我们根据表现出极端老化的细胞类型总数对个体进行分层，并为每个层生成Kaplan-Meier曲线。应用Cox比例风险回归、Kaplan-Meier估计和对数秩检验（lifelines v0.27.8）。

细胞老化与AD病理和认知表现的关联

我们评估了与GNPC中AD诊断相关的细胞类型是否与NSHD队列Insight-46亚研究（n = 483）中的AD病理和认知表现的生物证据相关。使用研究中可用的AD相关测量，我们应用针对性别和时间年龄调整的线性回归模型，评估z评分细胞年龄差距与pTau-217（pg ml^-1）负担之间的关联。使用Single Molecule Array（Simoa）HD-X平台上的ALZpath检测测量血浆pTau-217。为了评估认知功能，应用线性模型评估细胞年龄差距与PACC评分之间的关联，额外针对儿童认知能力进行调整。在分析前对连续变量进行标准化（z评分），使得回归系数表示标准差单位的效果大小。该分析应用于与GNPC中临床AD相关的22种细胞类型。使用R（v4.1.2）中的stats包拟合线性回归模型。

极端老化者比值比分析

通过使用Fisher精确检验计算比值比（OR），评估特定细胞类型中极端老化与神经退行性疾病诊断之间的关联。对于每个细胞类型-疾病对，我们构建了列联表，比较疾病病例与健康对照中极端老化者（z评分年龄差距>2）与非极端老化者的频率。使用SciPy Python包（v1.15.1）中的fisher_exact函数执行Fisher精确检验。通过在列联表的每个单元格中添加一个或两个应用Haldane-Anscombe连续性校正，以减轻零计数可能引起的潜在偏差。使用Woolf方法计算OR的95% CI。

国家卫生与发展调查中的纵向死亡率风险分析

我们分析NSHD队列，使用相同时间年龄个体在三个时间点的年龄差距估计值（n = 364；平均年龄63.2±1.1岁，70.7±0.7岁和72.9±0.6岁）计算10年期间的顺序死亡率风险估计值。使用Cox比例风险模型检查细胞年龄估计与约15年随访期间的死亡率风险之间的关联，针对随访退出（n = 2）或死亡（n = 281）进行截尾，并针对时间年龄和性别进行调整。使用R包survival（v3.4.2）。对于每种细胞类型，计算连续z评分年龄差距的HR和95% CI。

多细胞老化风险评分（PARS）的开发和跨平台验证

PARS模型通过在UKB队列训练集（n = 21,983；Olink）中使用多变量Cox回归对所有细胞类型的二进制极端老化状态进行建模而开发。与使用连续年龄差距值相比，使用二进制极端老化特征（存在或不存在）增强了对平台特异性技术变异的稳健性，并促进了跨平台泛化。使用模型系数计算个体PARS分数，并根据队列特定分数分布将参与者分为高（前5%）、中（中间90%）和低（后5%）风险组。使用相同的百分位分类在UKB测试集（n = 22,475）和独立NSHD队列（n = 1,803；SomaScan）中验证PARS模型。使用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验（lifelines v0.27.8）评估风险组之间的生存差异。

统计分析

使用SciPy Python包（v1.15.1）中的pearsonr函数实现皮尔逊相关。使用SciPy中的ttest_ind函数执行成对t检验，以比较APOE基因型组之间的细胞年龄差距。使用SciPy（v1.15.1）中的pointbiserialr函数评估细胞类型特异性年龄差距与神经退行性疾病之间的关联。在所有相关统计分析中应用Benjamini–Hochberg程序进行多重假设检验的FDR校正，使用statsmodels（v0.14.0）中的multipletests函数，显著性阈值为0.05。

报告摘要

有关研究设计的更多信息可在与本文相关的《自然投资组合报告摘要》中获得（链接到补充材料）。

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