血浆中的细胞外囊泡（EVs）由外泌体、微囊泡和凋亡小体组成。我们报告了一种利用称为Mag-Net的磁珠来富集血浆EVs的策略。对这一血浆EV部分进行蛋白质组学分析可以检测到超出未分级血浆液相色谱-质谱动态范围的蛋白质。Mag-Net方法具有稳健性、可重复性、成本低廉的特点，并且只需不到100 μL的血浆输入。结合数据非依赖型质谱分析，我们展示了从超过4,000种蛋白质中测量超过37,000个肽段的能力。通过对患有神经退行性疾病和健康对照的一个试点队列应用Mag-Net，我们发现了204种能够区分阿尔茨海默病痴呆（ADD）患者与非ADD患者的蛋白质（q值<0.05），以及310种能够区分帕金森病患者与非帕金森病患者的蛋白质。通过机器学习，我们能够以受试者工作特征曲线下面积（AUROC）= 0.98 ± 0.06区分ADD个体与非ADD个体。
引言
对血浆蛋白质进行稳健定量表征对于疾病的诊断、进展监测以及治疗反应至关重要。血浆是临床实验室中最主要的样本类型，其蛋白质在促进组织普遍采样方面具有极大的潜力，同时保持微创性，本质上为组织提供了“液体活检”的代理。尽管估计血浆中含有超过10,000种蛋白质，但大多数使用未分级血浆消化物进行的蛋白质组学实验仅能检测到不到800种蛋白质，主要是由于蛋白质浓度的巨大动态范围——例如白蛋白和IL-6之间的浓度差异。换句话说，血浆中50%的蛋白质质量是一种蛋白质（白蛋白），而22种蛋白质占总蛋白质质量的99%。
可以通过免疫亲和减法色谱去除最丰富的蛋白质来部分缓解血浆蛋白质的动态范围问题。这种去除通常会减少人血浆中6至20种最丰富蛋白质约90%-99%。去除增加了检测到的蛋白数量，因为它降低了动态范围。然而，这些去除柱不仅捕获目标抗原，还经常去除目标抗原及其结合的蛋白质。最终，即使在去除最丰富的蛋白质后，在蛋白质组学实验中，前50种最丰富的血浆蛋白质仍可能占总信号的90%。
为了进一步克服动态范围的挑战，在LC-MS/MS之前，可以将蛋白质去除与离线的蛋白质或肽水平分馏相结合。已提出了多种策略，包括SDS-PAGE、等电聚焦、高pH反相肽水平分馏和强阳离子交换分离。这些方法的缺点在于它们具有免疫去除的劣势，同时也导致通量大幅降低，有些方法甚至每样本产生25-96个分馏。
最近，Tognetti等人展示了最先进的数据非依赖采集方法——包括采集方法和计算分析——在血浆蛋白质组学中的价值。通过结合Agilent亲和去除柱human-14和在Orbitrap Exploris 480质谱仪上使用2小时HPLC梯度的DIA采集，他们能够在无需额外分馏的情况下跨样品测量2732种蛋白质。这项工作意义重大，因为它首次证明了每个样品单次LC-MS/MS运行即可测量超过2500种蛋白质。
更近一步，Blume等人报告了无需免疫亲和去除，使用衍生有各种表面化学性质的顺磁性纳米颗粒富集不同亚群的血浆蛋白质组。这些数据显示，使用多个纳米颗粒和LC-MS运行可以检测到1500至2000个蛋白质组。然而，与先前的分馏实验类似，用于富集的纳米颗粒数量是以通量为代价的。尽管存在这些挑战，该纳米颗粒技术的兴奋点和当前影响凸显了使用磁珠捕获一部分血浆蛋白质组以扩展到较低丰度蛋白质的前景。
血浆包含一个异质的膜结合粒子集合，通常称为细胞外囊泡（EV），包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。这些膜结合粒子约占血浆总蛋白质组成的1-2%，并且通常使用诸如超速离心、尺寸排阻色谱和免疫亲和捕获等方法进行富集。Kverneland等人最近证明，通过使用差速超速离心制备的EV分数结合最新的DIA-质谱方法，可以在单次LC-MS/MS运行中测量近4000种蛋白质而无需去除。通过质谱分析这种富集的部分可以提供关于生成这些不同类型EV的细胞特异性过程的深入见解，并可能改善可测量血浆蛋白质的范围。然而，通过超速离心分离EV非常耗时，并且需要能够执行>100,000 x g的特殊离心设备，使得这项技术难以应用于大规模临床队列。为了解决这一限制，Kverneland等人使用了多次20,000 x g离心步骤，收集富含较大>100 nm直径膜基颗粒的沉淀。这些数据表明，EV作为血浆蛋白质组的一个有用的亚组，能够提高生物医学相关蛋白质的覆盖范围。但是，完全基于密度的EV富集方案常常受到高密度脂蛋白（HDL）颗粒的污染，因为它们具有相似的密度。这些方法表明，需要一种能够最小化脂蛋白颗粒污染并在96孔板格式下进行的EV富集方案。
最近，Tao及其同事描述了一种基于磁珠的化学亲和纯化策略，用于从生物流体中富集EV。这个“EVTrap”策略结合了“亲水性和芳香脂溶性基团”，作者描述为对脂质包被的EV具有高亲和力。所报道的方法很有前景，并展示了相对于竞争方法如超速离心、尺寸排阻和聚合物沉淀，显著的膜颗粒富集且污染极少。此外，使用磁珠捕获EV使这一策略适合自动化。使用这种简单的磁珠捕获方法，他们报告了仅从10 µl血浆中测量超过1000种蛋白质和从0.5 mL血浆中测量600-1000种磷酸化蛋白质的能力。这种方法甚至已经被用于定义帕金森病尿液EV的潜在诊断生物标志物。尽管前景看好，但EVTrap磁珠目前尚未商业化供应。因此，科学界仍然需要一种广泛可及的EV颗粒富集策略，以实现检测结果在社区内的转移和协调。
在这里，我们描述了Mag-Net，这是一种简单、经济且稳健的基于磁珠的方法，用于从血浆中捕获EV颗粒，同时去除丰富的血浆蛋白质。该方法通过结合大小和电荷来富集血浆中的EV。结合定量数据非依赖型质谱分析策略，我们展示了常规测量来自超过4000种血浆蛋白质的超过37,000个肽段的能力，且具有高精度。有趣的是，根据Philius或DeepTMHMM预测，通过Mag-Net测量的蛋白质中有21.4%具有跨膜结构域，另外有5-10%已知是脂锚定或外围相关的膜蛋白，这是在蛋白质组学分析中尤其是血浆中常被低估的一类蛋白质。我们表征了通过Mag-Net捕获的蛋白质、捕获膜颗粒的物理特性，并展示了该方法在血浆蛋白质组高覆盖率定量分析中的价值。
除了有效改善血浆蛋白质组学实验的动态范围外，EVs在包括阿尔茨海默病痴呆（ADD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化症在内的几种神经退行性疾病中也具有诊断潜力。例如，与外泌体相关的蛋白质（如Alix、flotillins）在外显子斑块中富集于ADD患者的大脑中。囊泡相关的蛋白质Alix和Syntenin-1在将淀粉样前体蛋白及其淀粉样裂解产物包装进EVs中起重要作用。EVs参与细胞外淀粉样β的酶降解，并通过小胶质细胞促进淀粉样β的聚集和清除。据报道，突触蛋白如NPTX2、AMPA4、NLGN1和NRXN2α在AD患者的血浆来源神经元EV中减少。即使是TDP-43这样的蛋白质也被证实在ADD诊断患者的血浆来源外泌体中升高。此外，最近有人提出，血浆来源EVs中的α-突触核蛋白可能是PD的潜在诊断生物标志物。还有报道称外泌体负责在细胞之间和整个外周运输致病形式的Tau。
为了说明Mag-Net的重要性，我们分析了来自40名个体的小队列血浆样本：10名患有阿尔茨海默病痴呆（ADD）；10名认知正常的帕金森病患者（PDCN）；10名伴有痴呆的帕金森病患者（PDD）；以及10名年龄匹配的健康认知正常（HCN）个体。我们的研究结果表明，无论病因如何（即阿尔茨海默病或帕金森病），该方法都能够区分有无痴呆的个体。令人惊讶的是，我们还发现了能够区分由不同神经退行性疾病引起的认知障碍的蛋白质。
结果
Mag-Net方法用于血浆蛋白质组学概述
为了改善血浆蛋白质组学的动态范围，我们努力开发一种简单、低成本、高效且自动化的方案，能够富集膜结合颗粒，同时去除丰富的血浆蛋白质。MagReSyn®磁性颗粒已被证明具有高结合能力，并且兼容自动化的LC-MS/MS工作流程。此前，由聚赖氨酸（K8，K16）组成的带正电荷的肽已被证明能够结合磷脂并实现细胞外囊泡的富集。因此，我们采用静电策略测试了带有四级铵官能团的MagReSyn®强阴离子交换（SAX）磁珠，用以结合磷脂双层结合颗粒并去除血浆中的丰富血浆蛋白质。图1展示了Mag-Net的工作流程。血浆与SAX磁珠按4:1体积比孵育，并在室温下轻轻混合。未结合的血浆成分被洗去并去除。捕获的膜颗粒用SDS溶解，释放的蛋白质被还原、烷基化，并通过蛋白质聚集捕获（PAC）样品制备方法进行处理。蛋白质通过乙腈聚集到SAX磁珠上，经过多轮乙腈和乙醇清洗后，再用胰蛋白酶消化。整个过程使用KingFisher Flex磁珠机器人完成，分两个独立循环进行。
图1：Mag-Net亲和捕获工作流程
a SAX磁珠与血浆孵育以筛分和结合带负电荷的膜结合颗粒。磁珠被磁铁固定，丰富的血浆蛋白被轻轻洗掉。膜颗粒在磁珠上裂解，蛋白质被还原和烷基化，重新沉淀到磁珠上，然后用胰蛋白酶消化。收集肽段并使用nLC-MS/MS分析。 b 使用Kingfisher机器人方法自动执行Mag-Net工作流程。
使用数据非依赖型质谱（DIA-MS）对Mag-Net富集样本和相应的未分级血浆样本进行LC-MS/MS分析，无论使用何种计算方法分析数据，都得到了异常大量的肽段和蛋白质（图2）。使用EncyclopeDIA v2.12.30和六个气相分馏LC-MS/MS运行生成的色谱图库，我们能够从富集部分检测到4163个蛋白质组和从相应未分级全血浆中检测到1,088个蛋白质组（图2b，黄色条形）。为了证明蛋白质和肽段检测不仅仅是因为使用了基于Mag-Net富集部分生成的柱上色谱图库，我们还使用Prosit文库分析了数据（图2b，蓝色条形）。此外，分析还使用DIA-NN在无文库模式下进行，使用相同的fasta文件（图2B，灰色条形）。富集膜颗粒部分和未分级血浆的肽段检测数量在三重复准备和分析中显示在图2a中。在所有情况下，使用MagReSyn® SAX磁珠在消化前捕获膜颗粒，通过单次LC-MS/MS分析提高了血浆蛋白质组的覆盖范围（图2b）。此外，使用从Mag-Net富集样本的气相分馏分析生成的色谱图库，提高了未分级血浆的蛋白质覆盖范围。
图2：DIA-MS/MS分析富集膜颗粒和未分级血浆的肽段
a 在1% FDR下检测到的肽段数量（平均值+/−标准差），使用三种不同的分析策略。不同的分析策略包括使用带有Prosit文库的EncyclopeDIA（蓝色）、使用气相分馏生成的色谱图库的EncyclopeDIA（黄色）和无文库模式下的DIA-NN。EncyclopeDIA报告检测到的肽段，而DIA-NN报告肽段前体。Mag-Net协议检测到的肽段比使用相同分析的未分级血浆至少多出451%。 b 在1% FDR下使用三种不同分析策略检测到的蛋白质数量（平均值+/−标准差）。使用带有柱上色谱图库的EncyclopeDIA返回最多肽段和蛋白质，因此所有进一步分析都使用它。 c 富集膜颗粒（蓝色）与相同未分级血浆样本（红色）之间的蛋白质差异分析。 d 使用Enrichr工具评估2877个通过Mag-Net协议富集的蛋白质的Jensen COMPARTMENTS富集情况。* DIA-NN报告肽段前体，而EncyclopeDIA报告肽段。这使得两种工具之间的肽段检测比较具有挑战性。
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