摘要
载脂蛋白E4（APOE4）是阿尔茨海默病（AD）的最强遗传风险因素，但其在疾病早期前临床阶段对神经元和网络功能的全部影响尚不清楚。本文发现，年轻的APOE4基因敲入（E4-KI）小鼠表现出海马区域特异性的网络过度兴奋，这种表型可预测后期认知能力下降。这种早期表型源自特定亚群的小型、高兴奋性神经元，并可通过选择性清除神经元APOE4而消除。随着年龄增长，E4-KI小鼠在齿状回中发展出颗粒细胞过度兴奋、抑制功能进行性障碍以及兴奋-抑制失衡。通过单核RNA测序与多级基因筛选，研究发现了年龄依赖性和细胞类型特异性的转录变化，并确定了早期神经元过度兴奋的候选调节因子，包括Nell2。靶向CRISPR干扰敲低Nell2可挽救异常兴奋性，表明Nell2是APOE4驱动功能障碍的贡献者。这些发现共同定义了分子和回路机制，将神经元APOE4诱导的早期网络损伤与AD发病机制中的年龄相关进展联系起来。
主要内容
APOE4（载脂蛋白E4）等位基因是AD的最强遗传风险因素，其影响程度与基因剂量呈正相关[1]。在大多数临床研究中，APOE4携带者占所有AD病例的60-75%[2]，凸显了APOE4在AD发病机制中的重要性。人类纵向研究表明，APOE4对认知的有害作用是年龄依赖性的，且在AD典型症状出现之前就已存在[3]，APOE4携带者比非携带者更早出现年龄相关的记忆衰退[4]。此外，结构成像和认知研究表明，40岁以下的健康APOE4携带者表现出皮层变薄[5]、灰质萎缩和认知能力下降[6]。表达人类APOE4但不累积β-淀粉样蛋白（Aβ）的E4-KI小鼠表现出性别和年龄依赖性的学习和记忆缺陷[7,8]。现有数据表明，APOE4在AD发病中不仅在活跃阶段发挥作用，实际上在疾病发作前数十年（包括前临床和前驱阶段）就开始起作用。然而，目前仍不清楚APOE4如何促进AD的启动和进展。
前症状性阿尔茨海默病家族患者的年轻人群中已报道海马过度激活[9]，轻度认知障碍（MCI）患者中也存在[10]。亚临床癫痫发作和间期尖峰（IIS）也常见于AD的前临床和前驱阶段[11,12]，且与认知能力加速下降相关[11,13]。多种AD小鼠模型表现出早于Aβ斑块形成的网络过度兴奋和癫痫[14]，我们先前研究表明APPswe/PSEN1dE9小鼠中癫痫发生是由Aβ诱导的神经元过度兴奋驱动[15-17]。AD小鼠中记录的海马IIS与人类癫痫患者中观察到的类似[18]。重要的是，这种特征性癫痫样活动与记忆表现呈负相关[13,18,19]，研究发现使用抗癫痫药物左乙拉西坦降低海马过度兴奋可改善轻度认知障碍患者的认知功能[20,21]，并在APP/PS1[22]和其他AD小鼠模型[23,24]中减轻行为缺陷和神经病理。综上所述，人类和动物的综合数据表明网络过度兴奋导致AD相关认知下降，并代表一个可行的治疗靶点[25]。
APOE4与年轻、非痴呆携带者中海马区域特异性过度活动相关[26-33]，也与MCI和早期AD患者相关[34,35]，这种过度活动程度可预测未来记忆衰退[34]。此外，APOE4与应激期间亚临床癫痫活动相关[36]。APOE4携带者患癫痫的风险更高[37]，发病通常更早[38]，尤其是在创伤性脑损伤后[39,40]。此外，APOE4使颞叶癫痫（TLE）治疗耐药可能性增加六倍[41]，并与TLE患者记忆力下降相关[42,43]。值得注意的是，年轻E4-KI小鼠从5个月大开始自发出现癫痫——这种现象在E3-KI或E2-KI动物中未观察到，雌性E4-KI小鼠表现出更高的癫痫渗透率[44]。这表明APOE4诱导的网络兴奋性变化发生在可观察的认知功能缺陷表现之前[7]。尽管E4-KI小鼠中已报道癫痫发作易感性增加和渗透率[45]，但很少有研究探讨这些病理表型的网络层面驱动因素。已提出多种APOE4相关神经元过度活动[46]和网络功能障碍的解释，包括抑制功能受损[46]和中间神经元丢失[47]。然而，APOE4诱导的网络过度兴奋的精确神经元机制仍不清楚。揭示APOE4驱动的早期网络病理生理的原因对于理解其对AD发病机制的贡献至关重要。
在本研究中，我们旨在研究APOE同种型、年龄和区域依赖性海马网络过度兴奋的机制和后果。为此，我们采用多层次方法，结合自由活动小鼠的体内局部场电位（LFP）记录[8]、离体海马切片全细胞膜片钳电生理学和单核RNA测序（snRNA-seq）技术，以识别跨不同年龄观察到的神经元功能表型的潜在基因。最后，我们使用靶向CRISPR干扰（CRISPRi）验证关键候选基因作为APOE4诱导的选择性海马过度兴奋的中介物。
结果
年轻E4-KI小鼠中区域特异性海马网络过度兴奋
尽管先前报道老年E4-KI小鼠的内嗅皮层出现神经元过度活动[46]，但关于年龄依赖性APOE4效应对海马网络兴奋性影响的数据仍缺乏——海马是一个对空间学习和记忆至关重要的大脑区域，在AD早期受影响[48]。为研究年龄和APOE4依赖性网络活动变化，我们分析了来自两组独立年轻（5-10个月）和老年（12-18个月）E-KI小鼠的体内LFP记录数据[8]。我们关注间期尖峰（IIS）（图1a），这是网络过度兴奋的关键标志，其特征是神经元群体自发、高振幅、短暂的同步放电[49]，常见于AD患者[11]和大多数AD小鼠模型[14]。我们分析了活动期间背侧CA1、CA3和齿状回（DG）区域海马细胞层中的IIS率。结果显示，与同龄E3-KI小鼠相比，E4-KI小鼠从年轻时起在CA3（图1b）和DG（图1c）区域而非CA1区域（图1d）表现出更高的IIS率，揭示了早期、APOE4诱导的和区域特异性的网络过度兴奋。
尽管表现出网络过度兴奋，年轻E4-KI小鼠在莫里斯水迷宫（MWM）测试中与E3-KI小鼠相比没有空间学习障碍（图1f）。然而，到14月龄时，同一组E4-KI小鼠发展出显著的学习障碍，表现为隐藏平台试验第2天的逃逸延迟延长（图1g），这与先前关于老年E4-KI小鼠空间学习能力下降的报道一致[7,8]。为确定这些延长的逃逸延迟是否反映了真正的空间学习障碍而非非认知因素，我们分析了小鼠定位隐藏平台所用的搜索策略[50]（扩展数据图1c）。在隐藏平台试验的第2天，E4-KI小鼠表现出对随机搜索策略（如重复扫描或随机搜索）的更高依赖，导致策略评分升高（扩展数据图1d,e）。这表明无法从先前试验中学习或回忆平台位置，否则将能够通过空间定向策略（如"定向游动"和"焦点搜索"）有效完成任务。
值得注意的是，老年E4-KI小鼠的逃逸延迟表现出相当大的异质性，类似于IIS率（扩展数据图1a,b）。我们利用这种变异性，检验了早期网络过度兴奋是否可以预测未来学习障碍（图1e）。确实，年轻E4-KI小鼠（5-10个月）记录的CA3和DG区域IIS率与同一动物在老年时（14-18个月）隐藏平台试验第2天的逃逸延迟显著相关（图1h,i），而在E3-KI小鼠中未观察到这种相关性（图1h,i），CA1区域IIS率与E-KI小鼠的逃逸延迟也无相关性（图1j）。与这些发现一致，年轻小鼠的CA3 IIS率也与老年E4-KI而非E3-KI小鼠的第2天策略评分显著相关（扩展数据图1f）。年轻E4-KI小鼠的DG IIS率显示出类似趋势，但未达到统计学显著性（r=0.56, P=0.071；扩展数据图1g）。最后，CA1 IIS率在任何基因型小鼠中均不能预测策略评分（扩展数据图1h）。综上，这些发现表明APOE4诱导的海马早期过度兴奋，特别是CA3和DG区域，是后期认知衰退的关键早期标志和潜在驱动因素。
APOE4诱导年轻小鼠海马神经元细胞类型特异性过度兴奋
我们接下来研究了E4-KI小鼠海马区域特异性网络过度兴奋的神经元机制。神经元内在兴奋性（IE），可以通过几个基本参数测量，使用全细胞膜片钳记录进行评估。我们关注基本参数：阈值电流（引发动作电位所需的最小去极化电流）、输出增益（1秒去极化电流步长与产生放电频率之间的关系）和尖峰潜伏期（对1秒、800-pA斜坡电流注入的首次动作电位延迟）。此外，我们还检查了调节兴奋性的被动神经元特性，包括输入电阻（Rin）和膜电容（Cm），其中Cm与膜表面积成比例，反映了神经元大小[51]。
CA3锥体细胞在年轻E4-KI小鼠（7-9个月）中，CA3锥体细胞（PCs）表现出比年轻E3-KI小鼠更显著的过度兴奋。这通过更高的输出增益（图2a-c）和更低的阈值电流（图2d）体现，但尖峰潜伏期分析未显示基因型介导的差异（图2e,f），当使用年龄和基因型作为因素进行最大似然比测试时。有趣的是，老年E3-KI小鼠（17-19个月）的CA3 PCs显示出兴奋性显著增加（图2b-d），这与老年E4-KI小鼠的兴奋性相似，消除了年轻时观察到的兴奋性差异。其他与IE相关的参数也进行了分析（扩展数据图2），以及动作电位相关参数（扩展数据图3）。年轻E4-KI小鼠的神经元表现出较高的最大放电频率（图2b和扩展数据图2b）和增加的快速后超极化（fAHP）（扩展数据图3e），与E3-KI小鼠相比，但动作电位幅度、上升时间、半宽或慢后超极化（sAHP）无差异（扩展数据图3a-d,f）。
年轻E4-KI小鼠的CA3 PCs也具有更小的Cm值（图2g），伴随着更高的Rin值（图2h）。由于神经元中特定Cm为0.9μF cm^-2，跨越所有细胞类型[52]，因此Cm直接代表膜表面积，从而反映细胞大小[51]。使用共聚焦显微镜对CA3 PC胞体体积的直接测量证实E4-KI细胞小于E3-KI小鼠中的细胞（图2i）。此外，Cm和Rin值在E3-KI和E4-KI神经元中均显著相关（图2j），表明细胞大小和输入电阻之间的联系[53,54]。在老年E3-KI小鼠中，CA3 PCs变小，表现为与年轻E3-KI小鼠相比Cm值降低和Rin值升高（图2g,h）。年龄和基因型相关的细胞大小及IE变化的相似性表明因果关系，如其他AD模型中报道[55,56]。确实，所有CA3 PC IE参数与年轻E4-KI小鼠中的Cm显著相关，但与E3-KI小鼠不相关（图2k-m），表明APOE4诱导的过度兴奋至少部分由细胞大小减小驱动。
齿状回颗粒细胞在记录的齿状回颗粒细胞（DGCs）中，我们基于电生理特性识别出两个亚群。I型DGCs[57]的特点是不能在较高刺激强度下维持放电（图3a,b），与II型DGCs相比，无论APOL基因型或年龄，均表现出更小的细胞大小（较低的Cm和较高的Rin值）和更高的IE[57]。放电阈值的频率分布分析（神经元开始抑制的去极化电流步长幅度）显示了对应I型和II型神经元的两个峰值（图3c），表明不同的细胞亚群。在年轻E3-KI和E4-KI小鼠中，I型DGCs的比例相似（图3d）。然而，对所有组的分析显示显著的年龄-基因型交互作用（P=0.0008，Cochran-Mantel-Haenszel检验），反映了APOL基因型依赖性和年龄依赖性DGC亚型组成变化，老年E4-KI小鼠中的I型DGCs比例高于老年E3-KI小鼠（图3d）。
在年轻E4-KI小鼠中，过度兴奋表型仅限于II型DGCs，这些细胞表现出较小的细胞大小（降低的Cm；图3j）、更高的Rin（图3k）、更低的阈值电流（图3m）和更短的尖峰潜伏期（图3n），而I型DGCs未显示此类影响（图3f,h,i）。E4-KI II型DGCs中Cm与IE参数的相关性进一步证实，细胞大小减小导致过度兴奋，类似于在CA3 PCs中观察到的现象（扩展数据图4k-n）。在老年小鼠中，II型DGCs在E3-KI和E4-KI动物之间表现出大小或兴奋性无显著差异（图3j,k,n），与E3-KI细胞中的年龄相关变化一致。然而，高过度兴奋I型DGCs比例增加（图3d）维持了老年E4-KI小鼠的DG过度兴奋（图3p,r）。最后，DGCs未观察到与IE相关的次级参数差异（扩展数据图2d-f和3g-l）。
CA1锥体细胞与CA1区域中无网络兴奋性差异一致（图1d），我们发现E4-KI和E3-KI小鼠在任何年龄的CA1 PCs中均无显著IE差异（扩展数据图5a-d）。尽管在两种年龄的E4-KI小鼠中CA1 PCs的Cm值低于E3-KI小鼠（扩展数据图5e），但这种减小程度较轻（年轻E4-KI小鼠：CA3 PCs 82%，II型DGCs 82%，CA1 PCs 87%，与年轻E3-KI小鼠相比），并未导致Rin的显著差异（扩展数据图5f）。此外，CA1 PCs的IE次级参数未显示基因型相关差异（扩展数据图2g-i和3m-r）。
总之，年轻E4-KI小鼠在CA3 PCs和DGCs中表现出细胞类型特异性过度兴奋表型，与神经元大小减小相关。相比之下，老年E3-KI小鼠表现出相似的神经元大小减小和兴奋性增加，可能反映正常衰老相关变化[58,59]。这些发现表明APOE4诱导的神经元过度兴奋在生命早期出现，并由神经元萎缩驱动。
移除神经元APOE4可挽救年轻E4-KI小鼠的过度兴奋表型
APOL主要在大脑星形胶质细胞中产生，但在应激神经元中也可生成[60,61,62]。为确定APOE4相关的大小和兴奋性表型是由神经元还是星形胶质细胞APOL4表达驱动[63,64]，我们在年轻E4-KI小鼠中进行了实验，这些小鼠中APOL4基因在神经元（fE4-KI/Syn1-Cre小鼠[63]）或星形胶质细胞（fE4-KI/GFAP-Cre小鼠[63]）中被选择性删除。神经元APOL4移除完全恢复了所有改变的形态-电参数——包括Cm和Rin、输出增益、阈值电流和尖峰潜伏期，使其与E3-KI小鼠的水平相似（图4a-g）。这强调了神经元APOE4在驱动大小和兴奋性变化中的关键作用。此外，移除神经元APOL4消除了Cm和主要IE参数之间的所有相关性（图4h-j），强化了神经元APOE4诱导的细胞萎缩与过度兴奋之间的关联。相比之下，移除星形胶质细胞APOL4对与兴奋性或细胞大小相关的电生理特性无显著影响（扩展数据图6）。这些发现强调了神经元APOE4促进神经元萎缩和继发性过度兴奋的关键作用。
CA3 PC和DGC亚群对APOE4诱导萎缩和过度兴奋的选择性脆弱性
在各组和基因型内观察到的神经元参数的显著异质性（图2和图3）表明CA3 PCs和DGCs中存在不同的病理和健康亚群。为识别这些亚群，我们基于形态-电特性使用k-means聚类，将不同基因型和年龄的神经元合并（图5a）。聚类显示两个主要组群（k=2），其稳健性通过自举法得到验证（扩展数据图7a,e）。将k增加至3未产生稳定的聚类（扩展数据图7i），表明基于年轻E4-KI和E3-KI神经元之间关键形态-电差异存在两个主要亚群（扩展数据图7m）。一个聚类始终表现出过度兴奋特征——较低的阈值电流、尖峰潜伏期和Cm，以及更高的增益和Rin（扩展数据图7a）——表明聚类捕获了过度兴奋和正常神经元之间的关键区别。这些兴奋性参数的共变进一步支持过度兴奋细胞状态，因此我们启发式地将这些聚类标记为"过度兴奋"和"正常"。
通过与聚类中心点的距离对细胞进行分类，反映了它们与每个聚类的相似度（图5a）。散点图可视化了这一过程（图5b），每个神经元与统一线的残差差值代表聚类成员资格的强度。APOL基因型和年龄显著影响聚类成员资格，年轻E4-KI小鼠中过度兴奋神经元较多，E3-KI小鼠中随年龄增长向过度兴奋聚类转移（图5c）。然而，一些E4-KI神经元表现出与正常聚类的强烈关联，表明APOE4选择性易感性和抵抗力。在fE4/Syn1-Cre+小鼠中移除神经元APOL4显著减少了过度兴奋聚类，与E3-KI分布一致（图5c）。
DGCs中类似分析表明，年轻E4-KI小鼠的II型DGCs中过度兴奋聚类富集，主要由Rin和Cm差异驱动（图5d和扩展数据图7b）。合并DGC群体可靠地分离为I型和II型细胞，作为大体上不重叠的聚类，进一步确认了它们的独特表型（扩展数据图7q,r）。此外，在I型DGCs（图5e）或CA1 PCs（图5f）中未观察到与基因型或年龄相关的聚类分布差异。
总体而言，所有细胞类型之间的中心点比较显示一致的分化，其中过度兴奋细胞由形态-电参数（Rin和Cm）和内在兴奋性（输出增益、阈值电流和尖峰潜伏期）定义，而非由动作电位波形或其他膜特性定义（图5g）。聚类富集由细胞类型、APOL基因型和这些参数的年龄相关差异驱动，证实APOE4在特定神经元亚群中的表达导致细胞大小减小和过度兴奋。
E4-KI小鼠海马中区域特异性和年龄依赖性的兴奋-抑制失衡
E4-KI小鼠中过度活动和认知缺陷的另一个主要机制是突触功能障碍，特别是抑制功能的丧失[46,66]。为研究APOE4表达的网络和突触后果，我们记录了年轻和老年年龄组中CA3 PCs和DGCs中的自发兴奋性突触后电流（sEPSCs；图6a）和自发抑制性突触后电流（sIPSCs；图6b）。年轻E4-KI小鼠的CA3 PCs显示sEPSC频率更高，但振幅与年轻E3-KI小鼠相似（图6d,e）和扩展数据图8a,b），这与CA3局部网络中持续的兴奋回路一致[67]。在E4-KI和E3-KI小鼠的CA3 PCs之间未观察到sIPSC频率或振幅的APOL基因型特异性差异，表明该年龄下APOL基因型之间抑制性张力未改变（图6f,g和扩展数据图8c,d）。兴奋性输入增加，抑制性输入不变，导致E4-KI与E3-KI小鼠CA3 PCs中的兴奋-抑制（E-I）比值升高（图6c,h）。在老年时，CA3 PCs中sEPSC频率（图6d）和E-I比值（图6h）在E3-KI小鼠中显著增加，消除了APOL基因型之间的差异，并反映了老年E3-KI神经元中观察到的年龄相关兴奋性变化。
最后，我们发现老年时E4-KI DGCs中无兴奋性输入差异（图6i,j和扩展数据图8e,f）。相反，与我们在Hillar中间神经元退化中的年龄依赖性加速一致[7,66]，E4-KI小鼠的DGCs表现出sIPSC频率的进行性下降（图6k和扩展数据图8g），而sIPSC振幅在年龄或基因型之间无差异（图6l），导致老年时E-I比值显著升高（图6m）。
神经元APOE4表达导致神经元细胞类型特异性和年龄依赖性转录组变化
APOE4跨神经元亚型的异质性效应类似于APOE4对神经元转录组的细胞类型特异性影响[61]。这表明独特的转录组特征可能调节APOE4表达神经元功能障碍的易感性或抵抗力。为揭示与海马神经元中APOE4相关的基因表达差异，我们分析了从不同年龄E3-KI和E4-KI小鼠海马获得的snRNA-seq数据集（图7a,b）[61]。为探索选择性APOL4在年轻E4-KI小鼠神经元中删除对神经元表型完全正常化的转录组相关效应，我们还为5个月和10个月大的雌性fE4-KI/Syn1-Cre+小鼠的海马生成了snRNA-seq数据（补充图1）。
为筛选与在APOL基因型、细胞类型和年龄方面观察到的神经元形态-电表型相符的感兴趣基因，我们关注聚类1和2（DGCs）以及6（CA2/CA3 PCs）。由于5个月和10个月大fE4-KI/Syn1-Cre+的测序与先前研究[61]独立进行，这些数据被单独聚类（补充图1a-f和补充表1和2）。两个数据集的整合因明显的批次效应而不可行，这通过典型相关分析得到证实。因此，为将聚类身份与原始Zalocusky等人数据集[61]中的身份对齐，我们使用Jaccard相似度指数（JSI）计算每个聚类的所有显著标记基因（补充表1）。基于JSI分析，新聚类1与原始聚类1对齐，聚类2与原始聚类2对齐，聚类12与聚类6对齐，聚类5与聚类3对齐（补充图1g）。
为后续分析，我们使用六个特定标准确定感兴趣基因（图7c）。首先，基因必须在5个月和10个月大E4-KI和E3-KI小鼠之间差异表达，因为我们在此时点观察到E4-KI神经元与E3-KI神经元相比的过度兴奋。第二，这些基因还必须在10个月大E4-KI和E3-KI小鼠中高APOE表达的细胞之间差异表达，其中细胞被分类为"高APOE表达"，如果其APOE mRNA水平高于该细胞类型中位数2 s.d.。第三，基因必须在fE4KI/Syn1-Cre+小鼠与E3-KI小鼠的5个月和10个月大神经元之间无差异表达，因为我们发现神经元APOL4删除导致神经元表型完全正常化。第四，基因必须在20个月大E4-KI与20个月大E3-KI小鼠的神经元之间无差异表达，因为在此老年E-KI小鼠中未观察到神经元表型。最后，基因必须在20个月大与5个月大E3-KI小鼠神经元之间差异表达，其表达变化遵循与早期标准相同的模式，因为我们观察到与年龄相关的细胞大小减小以及年轻与老年E3-KI小鼠之间CA3 PCs和DGCs的过度兴奋（图2和图3）。从5个月大E3-KI小鼠的DG聚类1（补充表3）、DG聚类2（补充表4）和CA2/CA3 PC聚类6（补充表5）的初始552个、889个和492个基因池（图7c），我们的分析流程产生了DG聚类1的三个候选基因（Mdga2、Shisa4和Tnrc6b），DG聚类2的16个（Mdga2、Nell2、Lrrtm4、Parvb、Plxna4、Ubn2、Rph3al、Adamts17、Creld1、Cyp7b1、Chst9、Clta、5330417C22Rik、Parp8、Dpf3和Proca1）以及CA2/CA3 PC聚类6的八个（Nell2、Dclk1、Slit3、Ppfia2、Lrrc7、Nlgn1、Rnf182和Nnat）（补充表7）。相比之下，对背侧CA1 PCs（E-KI聚类3和年轻fE4-KI/Syn1-Cre+聚类5；补充表6）的相同基因分析未产生任何候选基因，与这些神经元未显示APOE依赖性IE表型一致（扩展数据图5）。
在年轻E4-KI小鼠神经元中靶向逆转Nell2过表达挽救其较小大小和过度兴奋表型
在识别出可能介导APOE4对神经元兴奋性不利影响或调节对APOE4易感性或抵抗性的几个基因后，我们在年轻E4-KI小鼠中使用KRAB介导的CRISPRi基因调控技术[68]评估其功能相关性。具体而言，我们旨在将它们的表达调整到E3-KI小鼠中观察到的水平。根据我们的snRNA-seq结果，我们选择了两个候选基因：Nell2（神经元表皮生长因子样蛋白2），是CA2/CA3 PC聚类6和DGC聚类2之间唯一的感兴趣基因（补充表7），以及Mdga2（MAM结构域含糖基磷脂酰肌醇锚定2），是DGC聚类1和2之间唯一的感兴趣基因（补充表7）。
针对每个选定的候选基因，我们使用两种定制重组慢病毒的组合：一种携带CRISPRi的基因特异性引导RNA以及mCherry以荧光标记转导神经元，另一种携带dCas9–KRAB载体。这些构建体注射到5个月大雌性E4-KI小鼠的DG/CA3海马区域。两个月后，我们在注射小鼠的海马切片中对CA3 PCs和DGCs进行膜片钳记录，从海马切片中的同一区域区分并记录转导（CRISPR+）和非转导（CRISPR-）神经元（图8a,k）。
Nell2是蛋白激酶C结合糖蛋白[69]，已在调节神经元增殖、存活、分化和极化以及轴突导向和突触功能中发挥多种作用[70,71,72]。我们验证了mCherry+ DGCs和CA3 PCs中Nell2表达的CRISPRi介导减少，并使用RNAscope和免疫组织化学证实了无脱靶效应（扩展数据图9）。转导的mCherry+ Nell2-CRISPRi神经元（图8a,k）显示显著更高的阈值电流和尖峰潜伏期（图8d,e,n,o）以及更高的Cm值（图8f,p），与相邻的mCherry-非转导神经元相比，表明Nell2-CRISPRi转导神经元的兴奋性降低和大小增加。mCherry+ CA3 PCs还显示输出增益降低（图8b,c），表明该细胞类型特异性表型的挽救，但mCherry+和mCherry- DGCs之间在输出增益上未观察到差异（图8l,m），与这些神经元中无APOE4诱导的增益表型一致（图3b,l）。值得注意的是，Cm变化与所有记录的CA3 PCs和DGCs中每个三个表型IE参数的变化显著相关（图8h-j,s-t），支持APOE4诱导的神经元萎缩和过度兴奋表型相关的结论。
Mdga2是先前与自闭症谱系障碍（ASD）相关癫痫相关的基因[73]。我们在mCherry+ Mdga2-CRISPRi转导神经元与mCherry- DGCs之间未发现任何形态-电和兴奋性参数差异（扩展数据图10）。虽然这些数据不支持Mdga2在APOE4诱导的神经元形态-电表型中的参与，但它们确实证实CRISPRi程序本身未影响神经元参数，因此可以作为"阴性"CRISPRi对照。
总之，我们的CRISPRi验证研究证实了Nell2在介导早期APOE4诱导的神经元形态-电异常中的关键作用。这些发现表明，靶向逆转APOE4驱动的转录组变化（如降低Nell2表达）可能代表早期治疗APOE4相关AD的有前景策略。
讨论
我们的发现揭示了年轻E4-KI小鼠中区域特异性海马过度兴奋，这种兴奋预测老年时学习障碍。这种病理由神经元APOE4表达驱动，导致关键转录组变化，包括Nell2表达增加，促进神经元过度兴奋。由此产生的网络过度活动进一步被年龄相关的Hillar抑制信号缺陷和E-I比值失衡所加剧，共同导致APOE4驱动的病理生理和认知下降。值得注意的是，认知正常的年轻E4-KI小鼠中的早期海马过度兴奋与老年时空间学习障碍强相关，与将年轻APOL4携带者中海马过度活动与未来认知下降关联的人类研究一致[34]。这表明早期网络过度兴奋不仅短暂，而且是持续现象，也是APOL4携带者AD启动和进展的主要风险因素。支持这一点的是，我们先前证明通过GABA亚型受体增效剂戊巴比妥治疗9个月大E4-KI小鼠6周可预防16个月时学习和记忆缺陷[74]。这些发现强调了针对网络过度活动的早期干预的潜力，可为长期预防APOE4诱导的认知下降提供保护，强调了早期过度兴奋在驱动AD进展中的关键作用。
在小鼠AD模型中，网络过度活动源于兴奋性神经元的过度兴奋[16,17,75]和抑制缺陷[76]，由Aβ毒性引起。几种内在兴奋性参数已被确定为Aβ影响神经元过度兴奋的介质，包括去极化静息膜电位[16,17]、GABA介导抑制性突触电流的去极化逆转电位[17]、增加的输出增益[77,78]、降低的尖峰潜伏期[78]和改变的动作电位宽度[55,78]及振幅[55]。虽然APOE4诱导的E4-KI小鼠海马过度活动与淀粉样变模型共享特征，但我们观察到重要机制区别。值得注意的是，APOE4驱动的过度兴奋在静息膜电位或动作电位波形变化不存在的情况下发生，表明虽然神经元APOE4和Aβ导致海马网络过度活动，但它们通过重叠但不同的细胞机制实现。
神经元兴奋性也由被动神经元特性介导，例如细胞大小。在我们的研究中，年轻E4-KI小鼠海马中的CA3 PCs和DGCs比同龄E3-KI小鼠的细胞一致更小，表现为较低的Cm值，并通过细胞体体积形态测量分析确认。我们的结果与先前报道一致：APOE4与人类癫痫患者切除组织中较小的神经元大小相关[79]。小鼠神经元APOE4表达导致树突形态减小[64]，已被证明在兴奋毒性损伤下对树突完整性具有破坏性作用[80]。人类iPSC衍生AD患者神经元[55]和APP/PS1小鼠神经元[56]中也报告了Cm降低。我们分析显示E4-KI神经元中Cm与IE参数相关，表明神经元萎缩促进过度兴奋。这种结构萎缩与增加的兴奋性之间的关系与计算模型一致[81-83]；例如，CA3锥体神经元中树突萎缩已被证明增加输入电阻和尖峰输出[83]。类似地，AD模型研究表明CA1 PCs在APP/PS1小鼠中减小的神经元大小是CA1 PCs过度兴奋和过度活动的基础[56]，在携带PS1和APP突变的人类iPSC衍生神经元中也观察到类似发现[55]。
随着年龄增长，E3-KI小鼠的CA3 PCs和II型DGCs"赶上了"E4-KI小鼠，显示出相似的大小减小和兴奋性增加——可能反映正常衰老的影响[58,59]——最终消除了基因型之间观察到的早期形态-电差异。有趣的是，年轻fE4/Syn1-Cre+小鼠的结果表明，缺乏APOE表达的CA3 PCs与表达APOE3的细胞在大小和兴奋性上无差异，支持APOE4代表毒性功能获得和加速衰老的观点，而非APOE3发挥神经保护作用。观察到的年龄和APOE同种型依赖表型与我们在E-KI小鼠中的最新发现一致[61]，即神经元上调整APOE表达，促进对AD相关病理和退化的选择性易感性。值得注意的是，高APOE4表达在10个月时达到峰值，而高APOE3表达在15个月时达到峰值。这种从早期E4-KI表型到E3-KI小鼠中延迟年龄相关变化的进展，与流行病学数据一致，表明APOE4相关AD风险大约从60岁开始增加，70岁左右达到峰值[84]，并在80岁左右与APOE3携带者会合[85]。这些发现进一步支持假设，即APOE4的有害作用加速衰老，而APOE3携带者中与年龄相关的变化更可能反映正常衰老效应。
值得注意的是，我们发现E4-KI小鼠DG中抑制功能进行性缺陷，导致老年时E-I失衡驱动DG过度兴奋。这一发现与我们先前报道的这些动物中间神经元丢失进展一致[7,66]，这与学习缺陷相关[7]。抑制功能障碍提供了将年轻E4-KI小鼠中早期网络过度兴奋与老年动物中学习障碍联系起来的机制。支持这一点的是，我们先前表明，用6周戊巴比妥治疗9个月大E4-KI小鼠海马过度活动，可防止Hillar DG中间神经元在7个月后退化并预防学习障碍[74]。E4-KI小鼠中网络过度活动可能通过各种机制损害APOE4表达中间神经元，包括兴奋毒性、代谢应激[47]。神经元APOE4表达已被证明在兴奋毒性挑战后导致神经元丢失[80]，中间神经元特别脆弱，因其能量需求更高[86]且对慢性应激耐受性较低[87]。我们的发现支持假设，即APOE4诱导的年轻E4-KI小鼠网络过度活动导致中间神经元丢失，促进老年动物中网络功能障碍和学习缺陷。因此，APOE4诱导的抑制功能障碍可能作为连接早期海马过度兴奋和老年时认知障碍的关键环节。
值得注意的是，尽管兴奋性神经元过度兴奋，老年E3-KI小鼠未发展出网络过度兴奋或认知障碍，与维持网络稳态的完整补偿机制一致。相比之下，E4-KI小鼠中这些机制的失效，加上更小、过度兴奋的I型DGCs选择性富集，促成了持续的DG过度兴奋和年龄相关学习障碍。
通过snRNA-seq分析，我们识别出年轻E4-KI小鼠CA3 PCs和DGCs中Nell2表达增加，当神经元APOE4被删除时，这种表达被消除。CRISPRi验证证实Nell2在介导APOE4诱导的早期神经元形态-电缺陷中的关键作用：在年轻E4-KI小鼠CA3 PCs和DGCs中降低Nell2挽救了神经元大小和过度兴奋表型。
Nell2是谷氨酸能神经元中在CA1-3和DG的锥体和颗粒细胞层中主要表达的糖蛋白[72]。已被证明通过其EGF样域与蛋白激酶C相互作用[69]，并调节MAPK活性[70]。此外，Nell2与血小板反应蛋白-1共享结构域，后者参与调节细胞增殖和凋亡[88]。虽然Nell2作为营养因子分泌[70,71]，但其选择性剪接变体是细胞质的，并参与细胞内信号传导[89]，包括与PKCβ1结合[69]。我们的结果表明Nell2的细胞质变体在介导APOE4效应中的细胞自主作用，因为降低CRISPRi转导神经元中的Nell2降低了它们的兴奋性，而相邻非转导神经元保持过度兴奋。NELL2是"神经元细胞稳态"基因本体通路（GO:0070050）的一部分，包含多个已知AD相关基因，如APP、PSEN1、PSEN2、TMEM106B、SLC24A2和IL6。在跨三个独立队列的AD患者前额叶皮层中已观察到Nell2蛋白表达增加[90,91]，其中Nell2表达与认知功能负相关，与淀粉样蛋白水平正相关[92]；Nell2水平升高也已在AD患者脑脊液（CSF）中报告[92]。这些增加在AD患者iPSC衍生海马神经元[93]和5×FAD AD模型小鼠海马中得到进一步验证[94]。最近一项分析65岁以上认知未受损个体CSF生物标志物的研究将Nell2确定为五种CSF水平与总tau和磷酸化tau（p-tau）显著相关的蛋白质之一[95]。此外，AD患者皮层组织中NELL2环状RNA（circRNA）表达已被发现上调[96]。显然，NELL2在神经元形态和兴奋性中的作用，特别是在APOE4背景下，需要更深入研究。
我们的发现表明APOE4诱导的网络功能障碍随年龄发展的因果时间线。在早期阶段，神经元APOE4表达触发细胞类型特异性转录组改变、神经元萎缩和过度兴奋，最终导致网络过度活动。随着E4-KI小鼠年龄增长，这一过程有助于GABA能中间神经元丢失和抑制缺陷，以及过度兴奋I型DGCs的病理性增加，最终导致网络功能障碍和认知障碍。开发针对APOE4相关AD的有效干预措施将需要进一步研究驱动海马兴奋性和抑制性神经元中APOE4诱导的细胞类型依赖性和年龄依赖性变化的精确机制。对这些过程的深入了解可能为减轻APOE4相关AD病理的靶向治疗方案铺平道路。
方法
小鼠
人类E3-KI和E4-KI小鼠来自Taconic Biosciences。在E4-KI小鼠中，条件删除人APOL4基因的loxP侧翼APOL敲入（fE-KI）小鼠如先前所述创建[63]：同源fE4-KI（floxed APOL4）小鼠与Gfapcre转基因小鼠（6.Cg-Tg(Gfap-cre)8Gtm）或Synapsin 1-cre（Syn1-cre）转基因小鼠（B6.Cg-Tg(Syn1-cre)671Jxm/J）杂交。这些杂交产生了对APOL4基因座杂合且对Gfap-Cre或Syn1-Cre呈阳性的后代。然后将这些与fE4-KI小鼠杂交，以产生对floxed APOL4基因座纯合且对Gfap-Cre（fE4-KI/GFAP-Cre+）或Syn1-Cre（fE4-KI/Syn1-Cre+）呈阳性的动物。对Gfap-Cre或Syn1-Cre呈阴性的同窝小鼠用作对照。所有小鼠均为纯C57BL/6遗传背景，饲养在19-23℃和30-70%湿度下具有12小时光周期的无病原屏障设施中。动物在短暂异氟醚麻醉下通过耳刺识别，通过尾部切片PCR进行基因分型。除本研究中报告的程序外，所有动物接受无其他操作。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院、加州大学和Gladstone研究所AN176773方案的指南和规定进行。所有方案和程序均遵循加州大学旧金山分校（UCSF）实验室动物资源中心的指南以及UCSF机构动物护理和使用委员会的伦理批准。
体内电生理学
对于体内网络兴奋性分析，我们分析了我们先前研究[8]中的LFP记录数据。简言之，数据从Neuronexus探针（配置A4x8-400-200-704-CM32）收集，该探针具有四个5-mm间隔400 mm的探针，每个探针8个电极点，点间距200-mm，插入背侧海马。所有小鼠数据均使用32通道直立头级、换向器和主控制单元（SpikeGadgets）进行收集、放大、复用、处理和数字化。每天60分钟家庭笼会话的5天数据收集与Trodes软件（SpikeGadgets）同步进行30 kHz数据采集和30帧/秒视频追踪。为控制昼夜节律效应，每天记录小鼠在光周期中随机分配的时间。每个电极点的解剖位置通过检查Nissl染色组织切片和原始LFP痕迹确定。LFP记录被下采样至5 kHz，高通滤波至0.1 Hz并高斯平滑2 ms。为去除运动伪迹，所有记录均被二次参考到位于胼胝体的通道[97]。然后使用MATLAB（MathWorks）中编写的自定义软件分析LFP记录，结合Chronux（ to MATLAB（SpikeGadgets）和NeuroQuery库，以及Igor Pro 8（WaveMetrics）中的自定义宏。IIS在活动期间在细胞层中检测为任何事件超过基线5 s.d.持续10-100 ms。实验人员在手术和记录期间对基因型设盲。
行为测试
为评估学习性能，我们重新分析了我们在先前研究[8]中对老年E3-KI和E4-KI小鼠的纵向队列MWM数据。简言之，小鼠被放置在测试室中，水池被隔板隐藏，并在训练开始前2天适应环境。在每次试验中，小鼠被放置在122-cm直径池中，池中装有不透明水，必须找到14×14-cm平台，淹没在水面下1.5 cm。小鼠只能依靠池周围墙壁上的空间线索引导搜索。在最初2天的预训练中，小鼠游过矩形通道找到平台或由实验者引导至平台（90秒后）。移除这些引导后，将平台移至新位置。在接下来5天中，小鼠每天进行4次隐藏平台试验，随机位置释放，有60秒时间找到平台。这些日常试验分为两对，间隔10分钟，对之间有4小时休息。未对小鼠进行随机化或分层。未从分析中排除小鼠。实验人员在分析中对基因型设盲。
CRISPRi向量设计
用于Nell2和Mdga2的dCas9-KRAB介导的CRISPRi向量由VectorBuilder设计、生产和包装成慢病毒，使用先前发表的方法[68,98]。具体而言，针对每个靶基因设计了多个CRISPRi单向导RNA（sgRNA）序列。每个靶点基于其脱靶潜力、与转录起始区域的接近度和序列特征（排除连续Cs和Gs）选择sgRNAs。具体而言，Nell2向导RNA（gRNA）序列为CAGATAAGACTATGTATAGA，而Mdga2 gRNA序列为TACCCTGGTGAGCAGAGCCC。为评估Nell2 CRISPRi构建体的潜在脱靶效应，我们使用在线工具CCTop[99]预测与靶位点序列相似的基因组位点。由于CRISPRi在转录起始位点（TSS）附近产生最强调控效应，特别在TSS的-50 bp至300 bp内，我们重点关注位于潜在PAM序列1200 bp内的预测脱靶位点。然后，我们检查了我们snRNA-seq数据集中目标基因的表达模式，并排除了在兴趣神经元（CA3 PCs和DGCs）中不表达的基因。这种过滤策略产生了四个脱靶基因候选（扩展数据图10a,b）。通过RNAscope分析每个脱靶基因在转导与非转导神经元中的表达，确认其未受CRISPRi修饰影响（扩展数据图9e-h）。
有关特定CRISPRi向量设计，见
病毒注射
对于病毒转导，将5个月大雌性E-KI小鼠用初始腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉，维持1%异氟醚氧气混合，流速1 l min^-1^。清洁头皮区域并用化学方法去除毛发。在颅骨上做一个小切口以暴露从前囟到lambda的中线缝合线。使用配备小型高速钻的立体定向架，在坐标2.1 mm后部至前囟和±1.5 mm侧向于中线处钻孔，深度为1.5 mm。连接到注射泵的28号针头降低至皮层表面以下1.5 mm深度，以500 nl min^-1^的速率注入2 μl慢病毒。每次输送后额外等待2分钟以平衡压力，然后缓慢移除针头。头皮用丝线缝合。手术结束时，小鼠接受切口附近皮下酮芬注射和腹腔注射丁丙诺啡和生理盐水以补充水分。小鼠允许在由加热垫预热的新笼子中恢复。4小时恢复结束时，给予第二次丁丙诺啡注射，并将笼子返回初级饲养架。
组织切片制备
小鼠用异氟醚深麻醉并断头。脑从颅骨中快速取出并置于4℃切割溶液中，包含110 mM胆碱氯化物、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、26 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、1.3 mM钠丙酮酸盐、1 mM L-抗坏血酸和10 mM葡萄糖。为优化切片质量和实现背侧海马神经元记录，使用振动切片机（Leica, VT1200 S）制备300-μm冠状切片。切片后，将切片转移到气液界面保持室（Scientific Systems Design, Inc.）中，在95% O2/5% CO2气体混合物中，34℃恢复1小时后进行记录。
免疫组织化学和原位杂交
脑组织收集在通过腹腔注射非特异性酯酶（Henry Schein）并进行0.9%生理盐水灌注1分钟后进行。右半脑在4%多聚甲醛中滴固定48小时（Electron Microscopy Sciences），然后放入1× PBS（Corning）中。将脑移至30%蔗糖中48小时，然后安装到冷冻滑动切片机（Leica）上并切片成30-μm切片。切片存储在-20℃下的低温保护溶液中（30%乙二醇、30%甘油和40% 1× PBS）。用于染色的选定切片然后在1× PBS-T（MilliporeSigma）中冲洗三次，沸水抗原修复缓冲液（Tris缓冲液，pH 7.6；Teknova）中10分钟。随后在1× PBS-T中冲洗切片，并在封闭溶液（5%正常驴血清（Jackson实验室）和0.2% Triton-X（MilliporeSigma）在1× PBS中）中孵育1小时，然后在小鼠-小鼠（MOM）封闭缓冲液中孵育1小时（一滴MOM IgG在4 ml PBS-T中）（Vector Laboratories）。MOM封闭后，切片在4℃过夜与原代抗体孵育（稀释至500倍最佳浓度的抗NeuN（MilliporeSigma））。第二天，切片在1× PBS-T中冲洗三次，然后在次级抗体（驴抗豚鼠594，1:1,000；Jackson ImmunoResearch）和DAPI（1:20,000）中孵育1小时。之后，切片再次在PBS-T中清洗，安装在显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific）上，用ProLong Gold安装介质（Vector Laboratories）覆盖。图像使用FV3000共聚焦激光扫描显微镜（Olympus）在×40放大率下捕获。为减少批次间差异，所有样品同时染色并在相同荧光强度下成像。实验人员在分析中对基因型设盲。
使用RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2（Advanced Cell Diagnostics）进行荧光原位杂交（FISH）和免疫组织化学的双重染色（检测Nell2和Nell4潜在脱靶基因），按照制造商说明（UM 323100，技术说明MK 51-150）。靶向目标基因和dCas9的C1和C2探针杂交，使用TSA Vivid 520和TSA Vivid 650（Advanced Cell Diagnostics，1:2,000）放大信号。原代抗体包括抗NeuN（豚鼠；Millipore，ABN90；RRID：AB_11205592；1:100）和抗mCherry（兔；Abcam，ab167453；RRID：AB_2571870；1:100）。次级抗体包括驴抗豚鼠结合DyLight 405（Jackson ImmunoResearch，706-475-148；RRID：AB_2340470，1:100）和驴抗兔结合Alexa Fluor 594（Abcam，ab150076；RRID：AB_2782993；1:200）。切片用ProLong Gold抗淬灭剂（Thermo Fisher Scientific）安装并在Evident FLUOVIEW FV3000激光扫描共聚焦显微镜上成像。图像作为z堆栈获取，步长1-μm，7-10步。基于NeuN和mCherry表达定义感兴趣区域（ROI），通过总强度投影量化ROI内靶基因和dCas9信号以确保捕获所有信号。为减少批次间差异，所有样品同时染色并以相同荧光强度成像。
细胞体积分析
为测量染色切片中的细胞体体积，我们使用Cellpose软件[100]的Python实现。
全细胞膜片钳电生理学
将脑切片置于淹没式双侧记录室（Warner Scientific，RC-27D）中，并以5 ml min^-1^速率双侧灌注34℃下的氧合人工脑脊液（ACSF）溶液，以优化氧气输送。记录和保持ACSF溶液包含124 mM NaCl、26 mM NaHCO3、10 mM葡萄糖、1.25 mM NaH2PO4、2.5 mM KCl、1.25 mM MgCl2和1.5 mM CaCl2。
神经元使用改装的Olympus BXW-51显微镜，×60物镜成像（Scientifica, Inc.）。使用Multiclamp 700B放大器执行全细胞膜片钳记录，信号以10 kHz采样并使用Digidata 1550B和Axon pCLAMP软件进行数字化（均来自Molecular Devices）。获取全细胞膜片钳构型后，细胞稳定至少3分钟后开始记录。膜片电极填充钾葡萄糖酸盐溶液，包含122.5 mM K-葡萄糖酸盐、8 mM KCl、10 mM HEPES、2 mM MgCl2、0.2 mM EGTA、2 mM ATPNa和0.3 mM GTPNa，pH设为7.2-7.3，渗透压为270-280 mOsm。为阻断自发突触活动，将AMPA受体拮抗剂6-氰-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX，20 μM）、NMDA受体拮抗剂D-2-氨基-5-磷戊酸（AP-5，50 μM）和GABA亚型受体拮抗剂吡唑并毒素（5 μM）添加到灌注液中。
使用含Cs+的膜片电极溶液记录自发突触活动，包含140 mM CsMeSO4、10 mM HEPES、2 mM MgCl2、0.6 mM EGTA、2 mM ATPNa和0.3 mM GTPNa，pH设为7.2-7.3，渗透压为270-280 mOsm。sEPSCs在-70 mV记录，sIPCS在0 mV记录，为期3-5分钟。
全细胞膜片钳电生理学数据分析
电生理数据在Igor Pro 8（WaveMetrics）中分析。使用Igor Pro中的NeuroMatic v.3c插件的模板匹配算法量化突触后事件（Jason Rothman）。实验人员在分析中对基因型设盲。无数据被排除。
神经元形态-电参数的k-means聚类分析
聚类分析使用Python（3.10.12版本）脚本执行。对于每种细胞类型，在结合年龄和基因型的情况下进行聚类。电生理测量归一化为z得分。使用Scikit-learn包[101]实现的k-means聚类算法应用于完整归一化数据集以及子集，使用五折交叉验证，随机选择80%神经元用于聚类拟合，剩余20%神经元基于结果聚类进行分类。重复1000次迭代，记录每次迭代的聚类中心点和神经元聚类分配。维持原始聚类的细胞成员概率（扩展数据图7e-h，底部面板）以及每次迭代匹配完整数据集聚类的概率用于验证聚类范式的一致性，并确定适当聚类数量（k值）。为计算成员资格强度残差，k-means算法确定的每个中心点距离归一化为z得分，对于每个细胞，与每个中心点距离之差用于估计对过度兴奋或正常聚类的亲和力。使用双因素方差分析和事后Tukey检验比较不同基因型和年龄的残差。
用于10x加载的单核制备
对于E3-KI和E4-KI小鼠不同年龄海马中各种细胞类型转录组分析，我们使用先前出版物[61]的snRNA-seq数据集（基因表达综合库（GEO）登录号：GSE167497）进行本研究分析。为从5个月和10个月大fE-KI/Syn1-Cre+小鼠脑中分离单核，我们结合并改编了10x Genomics对成人小鼠脑单核分离的演示协议和Allen脑研究所的单核荧光激活细胞分选（FACS）协议。急性解剖海马并在冰上置于2 ml Hibernate A/B27/GlutaMAX（HEB）培养基中。将HEB培养基返回到组织中，向组织添加2 ml冷藏裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl2和0.1%非离子型P40替代物）。组织在冰上裂解15分钟，期间旋转2-3次。保留的冷藏HEB培养基返回到裂解组织溶液中，使用1-ml移液器对组织进行额外5-7次移液。使用30-μm细胞滤器（Miltenyi Biotec；MACS SmartStrainer，130110-915）清洗后过滤裂解组织溶液以去除碎片和团块。过滤核离心500g 5分钟，4℃。去除上清液，用1 ml PBS（含1.0% BSA和0.2 U μl^-1^ RNase抑制剂）洗涤核。核再次离心500g 5分钟，4℃，重悬于400 μl核洗涤和重悬缓冲液。添加DAPI至终浓度0.1 μg ml^-1^，通过35-μm细胞滤器过滤核。使用BD FACSAria II在Gladstone研究所流式细胞术核心中基于DAPI+事件对核进行分选，排除碎片和双倍体。
互补DNA文库制备和测序
使用10x Chromium Single Cell 3' GEM、文库与凝胶珠试剂盒按照制造商说明制备互补DNA（cDNA）文库。使用10x Chromium v3试剂盒（10x Genomics，1000092）。在UCSF先进技术支持核心的Illumina NovaSeq 6000测序仪上对文库进行测序。
5个月和10个月fE-KI/Syn1-Cre+小鼠snRNA-seq样本的预处理和聚类
Demultiplexed FASTQ文件使用Cell Ranger 2.0.1版本与mm10-1.2.0（包括内含子）构建的自定义参考基因组进行比对。使用Cell Ranger "counts"功能与默认参数进行此比对，如Cell Ranger文档所述。还使用Cell Ranger "counts"功能确定独特分子标识符（UMI）计数，使用Cell Ranger "aggr"功能与默认参数将多个样本的计数矩阵合并为单个计数矩阵。通过UMI计数阈值过滤条形码（潜在细胞）。使用Seurat 2.3.4对过滤的UMI计数矩阵进行进一步处理。具体而言，过滤数据包含仅蛋白质编码基因。细胞过滤包括200-2,400个检测到的基因、500-4,500 UMI以及少于0.25%线粒体读数的细胞，确保数据质量。为规范化基因表达矩阵，使用Seurat NormalizeData功能[102,103]，缩放因子为10,000。聚类使用Seurat 2.3.4中的实现执行。该算法基于主成分分析空间中的欧几里得距离嵌入细胞到k近邻图中。通过Jaccard相似度优化单元格之间的边缘权重。使用Louvain算法进行聚类。使用Seurat FindVariableGenes功能[104,105]识别高度分散基因。基于0.25-4的平均表达范围和至少0.55的最小分散进行选择。使用最多前15个主成分和0.6的分辨率计算最近邻距离，导致28个不同聚类的识别。
细胞类型分配
使用t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）数据可视化技术检查聚类，其中小鼠年龄和基因型互连，未显示与基因型或年龄相关的批处理效应。为确认聚类身份不依赖于年龄或基因型等实验变量，我们分析了每个聚类内各组的比例。使用一系列t检验比较比例代表性，使用FDR校正p值（5%）。在任何聚类中均未观察到任何实验组的显著富集，基于校正或原始p值（补充表2）。
为识别每个聚类的标记基因，使用Seurat中的FindAllMarkers功能[102,103]。该算法使用Wilcoxon秩和检验迭代比较聚类中基因表达与所有其他聚类的表达。选择标记基因以表现出正向表达（即在目标聚类中表达高于其他聚类），在聚类中至少10%细胞中检测到，并与目标聚类中其他聚类相比具有0.25 log2倍以上表达。为确定宽泛细胞类别，包括兴奋性和抑制性神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞，将标记基因与来自之前RNA-seq数据的细胞类型特异性标记比较。此外，为细分海马细胞类型，特别是确定主细胞亚群，将每个聚类的标记基因与Hipposeq中报道的海马细胞类型特异性标记基因比较。对于较少见的非神经元细胞类型，我们将我们细胞中的基因表达与DropViz资源中相对于海马中所有其他细胞富集的每个海马细胞类型中的基因表达比较。为进一步验证聚类身份，我们还查询了每个聚类的顶级标记基因，与Allen脑研究所的成人小鼠脑基因表达基因组图谱进行比较。为对齐跨数据集的细胞类型，我们将新生成的聚类标记基因与原始数据集中的标记基因进行比较。聚类相似度使用JSI量化，该指标先前证明在RNA-seq数据集聚类身份比较中有效[108]。我们专注于Zalocusky等人的选定聚类[61]（聚类1、2、3和6），在聚类显示与多个组高度相似时应用贪心匹配方法。聚类大小也被考虑以优化配对匹配。
候选基因鉴定
为找到基于我们形态-电数据中观察到的显著效应符合感兴趣选择标准的基因，对感兴趣细胞群进行了差异基因表达测试。使用Seurat FindMarkers功能实现了非参数Wilcoxon秩和检验。仅考虑在任一细胞群中最低分数为0.1的基因。使用绝对log倍变化=0.05的差异表达水平阈值。虽然计算了FDR校正p值用于多重比较，但使用原始p值识别下游功能验证的候选基因。p<0.05的基因被认为显著改变。
统计与可重复性
未使用统计方法预先确定样本量，但我们的样本量与先前出版物类似[16,17,109,110]。Igor Pro和GraphPad Prism用于分析。使用Shapiro-Wilk检验在统计测试前评估数据集正态性。为检查年龄和APOL基因型对神经元兴奋性的显著影响，我们比较了包括年龄和APOL基因型的模型与忽略它们的零模型。每个兴奋参数的P值使用FDR方法进行多重比较校正（FDR=5%）。对于显示显著年龄或APOL基因型效应的参数，我们使用双尾、未配对Student t检验（用于正态分布数据）或双尾、未配对非参数检验（用于非正态分布数据）比较E3-KI和E4-KI小鼠，或每个APOL基因型内两个不同年龄，不应用任何额外校正方法。对于涉及三种基因型的实验（E3-KI，fE4/Cre-和fE4/Cre+），使用单因素ANOVA和Tukey事后多重比较检验评估统计学显著性。最大似然检验和FDR校正使用Python中的自定义脚本执行，使用Scikit-learn和statsmodels包。确切统计测试和小鼠与细胞数量（n）在图例中指定。α值为P<0.05时认为统计差异显著。所有数据集包括三个或更多生物重复。动物基于基因型和年龄分配到实验组，可能时同窝小鼠分配到不同组。设盲和数据排除在每个技术方法子节中描述。
报告摘要
研究设计的进一步信息可在本文章链接的Nature Portfolio报告摘要中获得。
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