摘要
全基因组关联研究(GWAS)表明，SNCA基因座的非编码变异与路易体痴呆(LBD)和特发性快速眼动睡眠行为障碍(iRBD)有关，但潜在的调控机制仍不甚清楚。整合GWAS、eQTL、sQTL和调控注释的分析揭示了一个皮质偏向的5′ SNCA调控单倍型，该单倍型与SNCA-AS1表达降低和SNCA 5′ UTR剪接改变相关，突显了可供未来实验验证的候选功能变异。
背景
路易体痴呆症(DLB)是一种进行性神经退行性疾病，是继阿尔茨海默病(AD)之后第二大常见的退行性痴呆病因，约占所有病例的10-15%。DLB是路易体痴呆(LBD)最常见的临床亚型，属于α-突触核蛋白病谱系，其特征是具有路易体病理的认知障碍。临床上，DLB表现为进行性认知下降、帕金森症、反复出现的视觉幻觉、认知和警觉性波动。快速眼动睡眠行为障碍(RBD)，通常在认知症状出现前数年发生，以及对抗精神病药物的严重敏感性是额外的标志性特征。与AD和帕金森病(PD)的临床重叠使诊断复杂化，凸显了对可靠生物标志物和机制洞察的迫切需求。
路易体痴呆(LBD)是一个临床总称，包括路易体痴呆症(DLB)和帕金森病痴呆(PDD)，两者通过认知障碍和帕金森症的相对出现时间来区分。相比之下，路易体疾病指由路易体和神经突中错误折叠的α-突触核蛋白累积定义的潜在病理实体，包括PD、DLB和PDD，它们沿临床病理连续谱系分布。在本手稿中，当泛指路易体痴呆中的遗传风险和队列水平发现时，我们使用LBD；当讨论DLB特定的临床特征、病理生理和疾病机制时，使用DLB。
DLB在病理学上以广泛的α-突触核蛋白病理为特征，涉及皮层、边缘系统和脑干区域。尽管α-突触核蛋白病理被认为起始于脑干，但DLB的标志性临床表现，如认知障碍、视觉幻觉和注意力波动，反映了显著的皮层功能障碍。在此背景下，共存的阿尔茨海默病样病理，包括淀粉样β斑块、磷酸化tau和TDP-43包涵体，在DLB中很常见，主要出现在皮层区域，可能有助于临床异质性并加速认知下降。这些观察支持这样一个模型：即使皮层区域不是病理最早的部位，皮层机制在塑造疾病表达和进展中也起着关键作用。
从遗传学角度看，LBD既与AD和PD共享风险等位基因，也表现出独特的遗传特征。编码α-突触核蛋白的SNCA基因座变异是主要的遗传贡献者，已与基因调控改变以及前驱期表型如孤立性RBD(iRBD)相关联。其他风险因素包括APOE ε4，它促进淀粉样共病理；GBA突变，它损害溶酶体功能并与PD存在遗传重叠。额外的基因座(如BIN1、TMEM175、SCARB2)突显了内体运输、线粒体功能和突触生物学的通路。
尽管取得了这些进展，非编码遗传变异如何影响α-突触核蛋白表达、剪接和下游致病过程的机制仍未完全理解。本文考察了在LBD和前驱期iRBD队列中鉴定出的SNCA基因座非编码调控变异，并评估其与DLB发病机制的相关性。
LBD中的遗传参与
SNCA基因罕见致病突变的发现首次确立了α-突触核蛋白与PD的直接联系。在表现出类似DLB的混合帕金森症和痴呆表型的家族中，SNCA点突变和重复强调了α-突触核蛋白的核心作用。随后的全基因组关联研究(GWAS)已将SNCA基因座确立为LBD跨疾病的主要易感区域。与罕见编码突变不同，与LBD相关的常见风险变异主要是非编码的。
最早的相关变异之一是rs7681440，位于SNCA内含子2内，与SNCA-AS1反义转录本的5′启动子区域重叠，该变异在一项比较DLB病例(n=1,743)与对照组(n=4,454)的GWAS中被发现(比值比[OR]=0.73；95%置信区间[CI]，0.66-0.81；p=6.39×10⁻¹⁰)。使用Genotype-Tissue Expression (GTEx) v8数据的表达数量性状位点(eQTL)分析显示，rs7681440在多个脑区(包括小脑、脊髓和皮层)中是SNCA-AS1的强顺式eQTL。在所有区域中，风险等位基因(G)与SNCA-AS1表达降低相关，在DLB中关键涉及的皮层中效果尤为明显。
随后基于LBD患者(n=2591)和对照组(n=4027)全基因组测序数据的GWAS发现了另一个非编码风险变异rs7680557(OR=0.79；95% CI，0.73-0.85；p=9.73×10⁻¹¹)。该变异位于SNCA-AS1下游不远处，也作为SNCA-AS1的稳健eQTL发挥作用，风险等位基因在包括皮层在内的多个脑区一致地与表达降低相关。
最近，rs7668531(位于SNCA下游约170kb处，在MMRN1和SNCA-AS1之间)在路易体疾病伴痴呆与不伴痴呆的比较中被确定为全基因组显著性，对认知下降具有保护作用(OR=0.72；95% CI，0.66-0.79；p=3.25×10⁻¹²)。尽管rs7668531在GTEx中目前未被注释为eQTL(可能反映了有限的统计效力或情境特异性)，但它与rs7680557(R²=0.92, D′=1.0)和rs7681440(R²=0.84, D′=0.93)存在强连锁不平衡(LD)，表明这些变异可能标记SNCA基因座上相同的潜在调控单倍型。与此解释一致，条件分析表明rs7668531不代表独立的关联信号，而是标记影响SNCA-AS1表达的相同调控架构。
需要注意的是，现有的eQTL和sQTL数据主要来自神经学正常的死后组织，可能无法完全捕捉在DLB或更广泛的LBD背景下运作的调控机制。此外，SNCA顺式eQTL信号在PsychENCODE或MetaBrain等大型脑荟萃分析中并未一致检测到，可能反映了细胞类型、区域或疾病特异性调控。尽管存在这些限制，SNCA基因座变异在跨越LBD的独立研究中的一致性表明其与疾病发病机制的相关性。
LBD和PD在SNCA基因座上的遗传关系
虽然LBD和PD都涉及SNCA基因座的非编码调控变异，但常见调控单倍型的层级组织和疾病相关性在这两种疾病中有所不同。重要的是，在GWAS鉴定出的所有与α-突触核蛋白相关表型(包括PD、LBD和iRBD)相关的常见SNCA变异都位于非编码区域，强调基因调控是共享的致病机制。
在PD中，大规模荟萃分析一致确定SNCA 3'区域的主要关联信号，rs356182(或高度连锁的rs356220, R²>0.99)作为领先变异。重要的是，这一3'主要信号与LBD风险几乎没有或没有关联，表明疾病特异性对基因座上调控元件的优先选择。
相比之下，与LBD最强烈相关的变异，包括rs7681440、rs7680557和rs7668531，映射到SNCA的远端5'调控区域。该区域与之前在PD中报道的次要、统计学上独立的关联信号重叠，包括rs7687945和rs7681154。使用LDlink(欧洲人群)的LD分析证实，这些与PD相关的次要变异与LBD相关SNP高度连锁(R²>0.90)，表明PD和LBD之间存在共享的调控架构，尽管存在不同的疾病特异性遗传层级。
重要的是，尽管5′ SNCA变异在PD中被重复识别，但它们并不是PD的主要遗传风险驱动因素。相反，PD的主要关联位于SNCA的3′区域，由rs356182体现。与此层级区别一致，rs356182与LBD领先SNP之间的LD较弱(R²≈0.2)，支持3′和5′信号代表SNCA基因座内基本独立的调控单倍型的解释。这些不同的遗传层级伴随着不同的功能效应。综合数据支持这样一个模型：LBD风险等位基因主要影响皮层SNCA-AS1调控，而PD相关等位基因通过替代机制发挥作用。
SNCA-AS1与SNCA表达的关系
非编码RNA(ncRNA)是不编码蛋白质的RNA分子，但越来越被认为是基因表达的关键调控因子，特别是在大脑和神经退行性疾病中。SNCA-AS1是一种长非编码RNA(lncRNA)和自然反义转录本(NAT)，主要在神经元中表达。NAT是从蛋白质编码基因相反链转录的，可以与它们的正义对应物部分或完全互补。NAT越来越受关注，因为它们可以在多个水平上调控基因表达，包括mRNA稳定性、翻译和表观遗传修饰。
在帕金森病和LBD等α-突触核蛋白病中，包括黑质和大脑皮层在内的受影响脑区域中α-突触核蛋白水平升高是定义性的病理标志。eQTL分析将SNCA-AS1表达降低与DLB风险增加联系起来，暗示对SNCA可能的抑制作用。一致的是，在PD脑的黑质中观察到相反的表达模式，其中SNCA mRNA升高而SNCA-AS1与对照组相比降低。GTEx数据进一步显示，rs7681440和rs7680557的DLB相关风险等位基因与心脏中SNCA mRNA水平显著增加相关，尽管这种外周关联与脑病理生理的相关性尚不清楚。因此，当前证据尚未在包括皮层在内的脑区域建立SNCA-AS1和SNCA表达之间的一致反向关系。
矛盾的功能数据进一步使这一领域复杂化。一项体外研究表明SNCA-AS1正向调控SNCA mRNA和α-突触核蛋白蛋白水平。然而，这一结论受到几个方法学问题的限制，包括使用单一神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)、依赖可能具有脱靶效应的单一siRNA，以及仅靶向一个外显子的SNCA-AS1引物，这引发了基因组DNA污染的可能性。在此模型下，SNCA-AS1表达降低将导致SNCA表达下降，这种机制难以与将SNCA-AS1降低与DLB风险联系起来的遗传和表达数据相调和。这些差异突显了在疾病相关细胞类型中进行严格、多模型实验验证的必要性，以澄清SNCA-AS1和SNCA之间的调控关系。
SNPs对SNCA剪接的影响
遗传变异不仅可以影响转录水平，还可以通过调控前mRNA剪接来影响基因调控。GTEx分析表明，LBD相关SNPs rs7681440和rs7680557在多个脑区充当剪接数量性状位点(sQTL)。这一调控格局在图3A中总结，显示了这些变异在皮层和皮层下组织中一致的归一化效应大小(NES)。
风险等位基因与正NES值相关，这与SNCA内含子1内的特定连接点剪接增强一致，该连接点连接外显子1到外显子2，位于SNCA转录本高度可变的5′非翻译区(5′ UTR)内。虽然包含翻译起始密码子的外显子2在大多数亚型中共享，但外显子1由于替代转录起始位点和剪接而表现出显著变异性。这种5′ UTR多样性已被证明在塑造人类大脑中SNCA mRNA亚型库中起关键作用。
在sQTL分析中，正NES表示内含子保留减少，有利于更完全剪接的转录本。因此，rs7681440和rs7680557风险等位基因促进外显子1-2剪接，富集具有特定5′ UTR构型的SNCA mRNA(图4)。四个转录本变体—TV8、TV13、TV14和TV15—(GenBank命名法)共享此5′ UTR并编码在人类大脑中表达的多个α-突触核蛋白亚型，包括全长140-aa蛋白(TV8)以及112-aa(TV13)、126-aa(TV14)和98-aa(TV15)亚型。较短的亚型(112-aa、98-aa)缺乏C末端的酸性区域，这与更高的聚集倾向相关。这些数据表明DLB相关风险等位基因广泛影响SNCA转录本结构，尽管它们对LBD中α-突触核蛋白生物学的精确功能后果仍有待确定。
iRBD与SNCA调控的遗传联系
iRBD被广泛认为是包括PD、LBD和多系统萎缩(MSA)在内的α-突触核蛋白病的前驱表现。它影响30-60%的PD患者，并与非运动症状更快进展和痴呆风险增加相关。在LBD(50-80%)和MSA(75-95%)中患病率甚至更高，在MSA中iRBD与更严重的临床特征相关，特别是与更早的自主神经功能障碍和加速的疾病进展。这些观察将iRBD定位为更具侵略性α-突触核蛋白病轨迹的临床标志。
遗传证据将iRBD与SNCA调控通过SNP rs3756059联系起来，该SNP在1,061例iRBD病例和8,386名对照的全基因组关联研究中被鉴定(比值比=1.42；p=1.1×10⁻⁸)。位于SNCA内含子1内，与长非编码RNA SNCA-AS1的5′区域重叠，风险等位基因与包括皮层在内的多个脑区中SNCA-AS1表达降低相关，并作为剪接QTL发挥作用，增强SNCA在特定内含子1连接点(chr4:89835692–89836127, hg38)的剪接。重要的是，rs3756059与三个已建立的LBD相关变异—rs7681440、rs7680557和rs7668531—在欧洲人群中R²>0.9且D′>0.97，存在强LD。这些变异共享对SNCA-AS1的重叠eQTL效应和对SNCA的sQTL效应，暗示了iRBD和LBD背后共同的调控机制。
尽管现有QTL数据集缺乏对调控REM睡眠关键的脑干区域(如脑桥、延髓)的足够覆盖，但一致的皮层效应表明rs3756059及其LD伙伴可能通过皮层通路影响疾病风险。鉴于iRBD通常先于LBD，这些发现提出了早期SNCA失调可能促进从前驱期到明显LBD进展的可能性。未来在iRBD队列中的纵向研究，结合脑干核团的转录组分析，对于确定这些调控变化是否在前驱期发生以及它们是否因果驱动疾病进展至关重要。
优先确定SNCA基因座上的功能变异
为了评估SNCA基因座上的GWAS是否反映直接调控效应或相反地标记强LD(R²>0.80)中的因果变异，我们使用FORGEdb(得分10=最强证据)和RegulomeDB(排名越低=调控潜力越高)评估了领先SNPs。遗传变异rs7681440(FORGEdb 10/10；RegulomeDB 7)、rs7680557(6/10；7)和rs7668531(4/10；6)在脑组织中对直接调控活性的支持有限。它们相对较高的RegulomeDB排名表明对转录因子结合、DNase超敏感性或活性染色质特征支持较少，暗示这些SNP更可能是标记而非构成功能变异。
这三个LBD相关SNP与iRBD变异rs3756059形成强LD区块(R²>0.84, D′>0.93)，与共享调控单倍型一致。因此，我们使用LDproxy工具(LDlink v6.0)和1000基因组计划第3阶段欧洲参考面板进行了系统精细定位。由于rs7681440在当前LDproxy版本中不再索引(可能是由于参考面板重新索引)，我们独立使用rs7680557、rs7668531和rs3756059作为领先SNP进行LD代理分析。所有三项分析都收敛到相同的73个代理变异(R²>0.80)，表明底层关联信号的单一共享LD区块。然后对这73个变异评估其调控潜力。
两个变异，相距556bp的rs2301134和rs2301135，脱颖而出成为顶级候选。两者都获得最高FORGEdb分数(10/10)，并在GTEx脑组织中对SNCA-AS1和SNCA显示出一致的eQTL和sQTL效应(图6和补充图1)，反映了GWAS标记SNP的方向和组织特异性。虽然LDlink将这些变异排名为2a(rs2301135)和4(rs2301134)，但使用RegulomeDB v2.2的补充评估为两者分配了1f排名，反映了包括转录因子结合和DNase超敏感性在内的强调控证据。两个变异都与密集的ReMap转录因子结合峰重叠，rs2301135处峰强度更高(图4)，将它们定位在双向SNCA/SNCA-AS1启动子内的活性调控区域。值得注意的是，这两个变异以前均未在神经退行性或LBD中被牵连。
重要的是，我们通过LDpair确认rs2301134和rs2301135与原始领先SNP rs7681440存在强LD(R²>0.93)，尽管无法通过LDproxy查询rs7681440。这一结果支持rs2301134和rs2301135捕获了最初由rs7681440标记的相同调控单倍型的解释。
总体而言，LD结构、调控注释和表达效应的汇聚支持rs2301134和rs2301135作为SNCA关联的候选功能驱动因子。
结论
本研究整合遗传关联、调控注释和转录组证据，提出一个调控框架，将SNCA基因座—特别是其反义转录本SNCA-AS1和SNCA的外显子1-内含子1-外显子2剪接—作为LBD病理生物学的关键组成部分。LBD和前驱期iRBD的GWAS一致识别出一个共享的LD区块(rs7681440、rs7680557、rs7668531、rs3756059)，风险等位基因与SNCA-AS1表达降低和有利于特定外显子1→外显子2连接使用(sQTL效应)相关(chr4:89835692–89836127, hg38)。综合来看，这些关联支持一个模型：常见调控变异可能通过汇聚的转录和剪接机制将前驱期iRBD和LBD联系起来。
使用FORGEdb和RegulomeDB的综合注释优先确定rs23001134和rs2301135作为该LD区块内的领先候选功能变异。然而，精细定位分辨率受到局部LD结构和可用脑eQTL数据集样本量的限制，无法进行明确的因果分配。因此，未来需要在人类iPSC衍生神经元模型中使用CRISPR基因组编辑、电泳迁移率变动分析(EMSA)和报告基因检测进行实验验证，以确定这些变异是否直接调控SNCA/SNCA-AS1基因座上的转录因子结合和调控活性。
几个关键的机制问题仍未解决。SNCA-AS1的调控作用，无论是抑制、促进还是调节SNCA转录，尚未在神经元亚型、脑区域或发育阶段中系统定义。长非编码RNA已知通过染色质重塑、转录干扰和剪接调节因子募集影响替代剪接，这引发了SNCA-AS1表达改变可能影响SNCA外显子1或5′ UTR剪接决策的可能性。SNP相关剪接异构体是否在LBD脑的皮层中优先表达，以及5′ UTR多样性如何影响SNCA mRNA稳定性、定位或翻译效率，仍是重要的开放问题。可能影响SNCA-AS1表达和SNCA转录本使用的基因-环境相互作用也值得调查。
未来研究应优先分析经病理证实的DLB脑样本，使用长读长RNA测序来解析SNCA 5′ UTR异构体和疾病相关转录本的完整谱系。同时，在iRBD队列中纵向评估脑脊液(CSF)和血浆外泌体中的SNCA-AS1和5′ UTR定义的SNCA mRNA异构体(捕捉中枢神经系统相关分子变化的生物流体)，可能有助于评估它们作为前驱期生物标志物的潜力。在额外验证后，包括证明对治疗干预的响应性，这些分子特征可探索作为候选药效学生物标志物。同时，应追求靶向SNCA-AS1转录或外显子1-内含子1剪接选择(例如反义寡核苷酸、小分子、剪接转换寡核苷酸)的治疗策略的开发和测试，同时严格评估细胞类型特异性和脱靶效应。
总之，现有的GWAS、eQTL和sQTL数据汇聚到SNCA基因座上一个皮质偏向的调控单倍型，该单倍型与SNCA-AS1表达改变和SNCA 5′ UTR剪接相关。虽然这些发现并未确立因果关系，但它们提供了一个连贯的、可检验的模型，将非编码调控变异与LBD中α-突触核蛋白失调联系起来。在人类相关系统中解决剩余的机制差距对于完善此模型以及指导未来早期检测和基于机制的治疗策略的努力至关重要。
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